CN113226375B 方法和组合物 （英国研究与创新署）

2021.06.25PCT/GB2019/0530232019.10.24WO2020/084307EN2020.04.30biosyntheticacyl-enzymeinte本发明涉及将2,3-二氨基丙酸(DAP)遗传引含DAP的非天然氨基酸装载tRNA的tRNA合成酶；以及使用所得多肽例如在酶促反应中捕获底物和/或中间体的方法。本发明还涉及式(I)或式28.根据权利要求2至7中任一项所述的多肽，其中所9.根据权利要求2至7中任一项所述的多肽，其中所12.一种生产包含2,3-二氨基丙酸(DAP)的多肽的方法，所述方法包括将权利要求1所(ii)在能够识别所述正交密码子并将所述非天然氨基酸引入到多肽链的正交tRNA合316.根据权利要求15所述的方法，其中根据酶的国际命名和分类，所述酶是EC3.4肽18.根据权利要求15所述的方法，其中所述多肽包含一个至二十个2,3-二氨基丙酸20.根据权利要求12至19中任一项所述的方法，其中所述非天然氨基酸在对应于野生21.根据权利要求12至19中任一项所述的方法，其中所述非天然氨基酸在对应于野生22.根据权利要求1所述的非天然氨基酸在生产包含2,3-二氨基丙酸(DAP)的多肽中的23.根据权利要求22所述的用途，其中所述多肽的生产包括实施权利要求10至21中任4[0001]本发明涉及将2,3-二氨基丙酸(DAP)遗传引入多肽中；包含DA用于用包含DAP的非天然氨基酸装载tRNA的tRNA合成酶；以及使用所得多肽例如在酶促反[0003]许多酶通过与酶活性位点中的丝氨酸或半胱氨酸侧链结合的共价中间体进行反[0004]稳定捕获这些中间体的策略使天然底物的鉴定以及其他难捕捉的中间体和功能半胱氨酸残基，并在泛素的C末端形成酰胺键；这导致了对蛋白质泛素化途径的众多见[0005]酰基酶中间体——在酶的半胱氨酸或丝氨酸残基的巯基或羟基侧链与底物的羰经通过固相合成/缀合技术生产了一种或多种带有DAP的多肽(参见Virdee,S.,Macmillan,domainsdemonstratealteredphosphopeptidespecificityinducedby进行化学偶联，和/或因为通过固相合成制得的蛋白质需要进行化学重折叠才能获得正确[0008]本发明提供的关键技术是一种新的生产包含2,3-二氨基丙酸(DAP)的多肽的方式。这对于将DAP引入到现有技术中难以或不可能修饰的位置(例如引入到酶活性位点中)5[0009]这些方法基于新的非天然氨基酸，其用于通过天然存在的翻译机构(例如细胞自身的核糖体)引入到多肽中。所述方法还涉及能够用新的非天然氨基酸装载正交tRNA的新和N(C1-6烷基)2；-S-R5-NH-R55Y1Y23或NH-S1-6烷基3-20杂环基和核酸；65-20芳基3-20杂芳基、5-20芳基；27或N(R13)4+；合适地，所述PylRStRNA合成酶是包含所述突变的巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinabarkerii)PylRS(MbPylRS)t[0049](i)提供编码所述多肽的核酸，所述核酸包含编码根据本发明所述的非天然氨基[0050](ii)在能够识别所述正交密码子的正交tRNA合成酶/tRNA对的存在下翻译所述核8其中在对应于所述酶的活性位点内的氨基酸残基的位置引[0058]一方面，本发明涉及如上所述的非天然氨基酸在生产包含2,3-二氨基丙酸(DAP)[0066]在这里，我们公开了遗传编码的2,3-二氨基丙酸如何实现对酶促反应的结构见[0067]本发明实现了遗传引导将2,3-二氨基丙酸(DAP)有效引入到在(例如)大肠杆菌酶的硫酯酶结构域(VlmTE)促进线性四缩肽顺序三聚化为十二缩肽以及随后的十二缩肽环化为缬氨霉素。通过捕获VlmTE的催化循环中的第一个和最后一个酰基-TE中间体作为DAP缀合物，使用本发明提供了对NRPS的TE结构域中的构象变化如何控制从线性底物的低9择性替换催化半胱氨酸或丝氨酸残基将允许捕获通过酰胺键连接的酰基酶中间体(图1C)。[0078]产生次级代谢产物的巨型酶(megaenzyme)非核糖体肽合成酶(NRPS)和聚酮合成酶(PKS)在其合成周期中生成高度复杂的酰基酶中间体。这些分子机器使用硫代模板化的真菌剂和免疫抑制剂(补充图1)。试图揭示其详细分子功能的现有技术尝试已受到了以高短杆菌肽Sl8、催吐毒素cereulide19,20、铁载体肠杆菌素(si[0079]酰基-TE中间体的高分辨率结构将提供有关TE如何控制底物命运并代表着重大进[0080]本发明提供的获得稳定的酰基-TE中间体的能力具有显著的益处，使本领域技术[0081]如下面更详细描述的，发明人已经提出了引入可在温和条件下翻译后转化为DAP的氨基酸的氨基酰基-tRNA合成酶/tRNACUA对。我们证明了该对用于将DAP位点特异性引入到在大肠杆菌中产生的重组蛋白中的用途。我们证明了半胱氨酸蛋白酶和NRPSTE结构域[0082]我们证明了本发明用于阐明将四缩肽转化为缬氨霉素的生物合成途径。通过用DAP替换VlmTE中的催化丝氨酸，我们证明了如何获得稳定的脱氧-四缩肽基-N-TEDAP和十二缩肽基-TEDAP缀合物。这些缀合物的结构表征提供了关于VlmTE的催化循环中的第一个性前体的NRPS的TE结构域的构象变化来确对可能针对如上所述的DAP基团/非天然氨基酸的任何进一步化学修饰的特异性和/或当的DAP基团/非天然氨基酸时，则有利地避免可能的部分修饰/部分脱保护的问题或同一多肽中交替的DAP基团之间反应微环境发生变化的问题(这可能导致在该多肽中在不同位置[0085]原则上，可以通过相同或不同的正交密码子/正交tRNA对引入如上所述的多个非天然氨基酸(相同非天然氨基酸的多个拷贝，或两个或更多个不同非天然氨基酸中的每个和N(C1-6烷基)2；-S-R5-NH-R55Y1Y23或NH-S1-6烷基3-20杂环基和核酸；5-20芳基3-20杂芳基、C5-20芳基；2或N(R13)4+；[0121]“药学上可接受的”物质是指在合理的医学判断范围内适合与受试者的组织接触物或其盐)和溶剂形成的可变化学计量的复合物。结晶化合物可以形成药学上可接受的溶的实例包括但不限于衍生自茚满基、茚基、异茚基、四氢萘基、苊基、芴基、非那烯基或CCl3。以在任何环原子处连接至母体基团或连接至底物，并且可以包括一个或多个非氢取代基，除非这种连接或取代会违反化合价要求或导致化学上不[0172]保护基是通过官能团的化学修饰引入到分子中以暂时掩盖官能团的特征性化学过程以防止其干扰另一反应的基团。可通过光解反应去除的保护基(即通过光解反应能够被去除/可去除/可被脱保护)是可通过诸如光的辐射能去除的基团。保护基描述在Wuts,P.G.M.和Greene,T.W.,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis，第4版，Wiley-1-5552-Y1或N(CH2CH3是是S。4是NH-C(O)-O。或N-CH3。R1是H。CH33或2是H。CH3332CH33)2和N(CH2CH3)2。1-6烷基NH(C1-6烷基)和N(C1-6烷基)CH3CH33)2或N(CH2CH3)2。[0211]当R6或R9是非H的取代基时，保护基Y在R6或R9所连接的碳上包含立体中心。合适CH3322CH32CH2CH3和Ph。CH33和Ph。CH3CH32CH3和CF3。CH3和CF3。CH3和CF3。或K+。构(或构成)异构体(即，原子之间的连接不同而不仅仅是原子在空间中的位置不同的异构[0260]上述排除不适用于互变异构形式，例如，酰胺/亚氨基醇-NH-C(＝O)-/-N＝C(-[0265]此类异构体形式的制备(例如不对称合成)和分离(例如分步结晶和色谱手段)方体或混合物包含式(I)或式(II)的化合物的药[0268]式(I)或式(II)的化合物(其包括以上具体命名的化合物)可以形成药学上可接受钾(K+2+2+式盐的讨论，参见S.M.Bergeetal.,J.Pharm.Sci.(1977)66:1-19；还参见Stahl和Wermuth,HandbookofPharmaceuticalSalts:Properties,Selection,物与适当的酸或碱反应以得到所需的盐。也可以使式(I)或式(II)的化合物的前体与酸或当的酸或碱处理或通过与离子交换树脂接触，可以将式(I)或式(II)的化合物的盐转化为过介入有机化合物的分子使溶剂(例如水)分子从彼此直接接触分开的溶剂化物和水合物。酸工作的替代tRNA/tRNA合成酶对的情况下使用其他密码子，仅仅可以用所选密码子所期望的反密码子区域调换tRNA的反密码子区域。反密码子区域不涉及tRNA的装载或引入功[0291]如果需要，本领域技术人员可以通过使MbPylRStRNA合非天然氨基酸未被MbPylRStRNA合成酶[0296]优选地，正交合成酶/tRNA对是巴氏甲烷八叠球菌MS吡咯赖氨酸tRNA合成酶[0297]本发明的tRNA合成酶可以变化。尽管在实例中可能已使用特菌(Methanosarcinamazei)Go1；嗜乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcinaacetivorans)C2A；嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcinathermophila)；或布氏拟甲烷球菌[0305]>巴氏甲烷八叠球菌iF/1-419/巴氏甲烷八叠球菌str.Fusaro版本YP_[0307]>马氏甲烷八叠球菌/[0319]>哥本哈根脱亚硫酸菌_DCB-2/1-279哥本哈根脱亚硫酸菌DCB-2版本YP_[0321]>哥本哈根脱亚硫酸菌_Y51/1-312哥本哈根脱亚硫酸菌Y51版本YP_521192.1GI:[0323]>哥本哈根脱亚硫酸菌PCP1/1-288哥本哈根脱亚硫酸菌版本AY692340.1GI:变移入替代的(alternate)tRNA合成酶骨架(如选自上述的一巴氏甲烷八叠球菌i和/或马氏甲烷八叠球菌序列以外[0331]可以通过与已知tRNA合成酶(例如示例性巴氏甲烷八叠球菌i和/或马氏甲烷八叠过使序列与已知tRNA合成酶比对(而不是仅仅使用低序列同一性得分)来研究序列是重要[0335]聚焦于催化区域可能是有用的。此目的在于提供tRNA催化区域，根据其可限定高％同一性，以捕获/鉴定适合于接受为了产生相同的tRNA装载(氨酰化)功能而移植的突[0338]当使用数字地址提及特定氨基酸残基时，除非以其他方式显而易见，否则使用MbPylRS(巴氏甲烷八叠球菌吡咯酰-tRNA合成酶)氨基酸序列作为参考序列(即，如由可公开得到的野生型巴氏甲烷八叠球菌PylS基因登录号Q46E77编码的)来进行列(骨架序列)中识别出对应于参考序列的L266的正确氨基酸，并将该残基(无论其可能是[0344]现在参考示例性巴氏甲烷八叠球菌i和马氏甲烷八叠球菌序列说明替代的tRNA骨[0351]可通过将这些突变移植到马氏甲烷八叠球菌PylS中来得到具有相同底物特异性[0367]有利地，应测试以这种方式产生的移植多肽来确保已保留所需的功能/底物特异[0371]可以生产嵌合的tRNA合成酶，前提是tRNA合成酶分子的装载/乙酰化部分基于或体应总是保持与用于用如上所述的一种或多种非天然氨基酸装载tRNA的tRNA合成酶有成过肽键加入到多肽骨架中的所述非天然氨基酸的残基的多肽。这意味着从严格意义上讲，该多肽将不包含准确的所提及的非天然氨基酸，而是将包含已经历缩合反应的其残基，因为所提及的非天然氨基酸的氨基酸基团与在多肽链中与其相邻的氨基酸残基反应，导致基于肽键的引入所提及的非天然氨基酸的残基加释放的一分子H2O。应当相应地解释提及的缬氨酸，而实际上它包含缬氨酸的氨基酸残基，其已通过如上所述的其氨基酸基团的反应并形成肽键和释放一分子H2O而加入到肽链中。[0384]类似地，本文公开的示例性非天然氨基酸可以被称为“包含DAP的非天然氨基酸”4、5和6中的一种或任何一种，其每一个都具有H2N-C-(COOH)-C-N(H)-R部分(即“包含[0388]可以将本发明的载体转化或转染入如描述用来提供本发明的蛋白质表达的合适[0390]被有效地连接至编码本发明的蛋白质的序列的控制序列包括启动子/增强子和其他表达调节信号。这些控制序列可被选择以与宿主细胞(表达载体被设计于其中使用)相启动子至包括上游元件和增强子的启动子的[0391]本发明的另一个方面是一种将一个或多个包含DAP的非天然氨基酸遗传地和位点法遗传引入的一个优点在于它排除了包含DAP的蛋白质一旦形成后被递送到细胞中的需[0393]ii)在细胞中引入正交tRNA合成酶/tRNA对的表达系统，例如DAPRStRNA合成酶/[0395]步骤(i)在蛋白质的遗传序列中的期望位点处需要或用正交密码子例如琥珀密码子替换特定密码子。这可以通过仅仅引入具有编码该蛋白质的核苷酸序列的构建体(例如[0396]步骤(ii)需要正交表达系统以在期望位置(例如琥珀密码子)处特异性引入包含[0410]HEK293T(具有大的T抗原的人胚肾)细胞可广泛获得，例如来自LGCStandards,[0411]BL21DE3大肠杆菌细胞可广泛获得，例如来自NewEnglandBiolabsNew在对应于野生型酶的活性位点内的氨基酸的位置引入本文所述的DAP或非天然氨基酸。合适地，在对应于野生型酶的活性位点内的催化氨基酸的位置引入本文所述的DAP或非天然脂酶、聚糖水解酶2-4、半胱氨酸蛋白酶(例如半胱天冬酶)或参与泛素化和/或SUMO化的酶[0421]参考酶系统的国际命名法和分类(由国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会(NC-IUBMB)在与IUPAC-IUBMB生化命名委员会(JCBN)协商后准备和更新的)(例如，参见[0425]本发明尤其提供了一种生产包含2,3-二氨基丙酸(DAP)的多肽的新方法。这具有使得能够通过将DAP引入到酶活性位点心脏能够实现的类似方法来剖析代谢途径。应用还[0426]蛋白质的结构表征通常代表许多药物开发项目的起点。由于DAP可用于任何通过位点中的丝氨酸或半胱氨酸侧链结合的共价中间体进行的蛋白质催化反应中。DAP可用于[0434]合适的底物是那些通过酶对所述底物的作用而产生硫酯或酯中间体键的底物(注酸或丝氨酸结合的酰基酶中间体起作用。[0439]在一个实施方案中，本发明可以用于观察通过添加小分子(药物)形成的中间体[0440]本发明发现了在经由编码的2,3-二氨基丙酸对生物合成酰基酶中间体的研究见解中的应用。[0445]图1显示了在活性位点酶与半胱氨酸和丝氨酸亲核体通过酰基酶中间体进行的一3-二氨基丙酸(DAP)替换半胱氨酸或丝氨酸可以产生酶，其进行为抗裂解的第一酰基酶中氨酸(D-val)、L-乳酸(L-lac)和L-缬氨酸(L-val)缩合为形成四缩肽基(D-hiv-D-val-L-长的但是用化合物加标至10μM的细胞产生的。绿色迹线是由在存在1mM化合物的情况下生值：28097.21Da。红色迹线：在光照后将6转化为中间体的含有6的sfGFP：预期质量：迹线还显示了由于N末端甲硫氨酸的自发损失而产生的蛋白斯凝胶中出现一条新带，代表了异肽连接的TEV(Ci5iDAP)-Ub复合物(左)。反应的αUb和αStrep的Western印迹证实了该复合物的身份(TEV构建体含有Strep标签)。b，异肽连接的[0454]从四缩肽基-SNAC7(1.7mM)和VlmTE(6.DAP和十二缩肽基-TEDAP的结构之间的盖螺旋Lα1-Lα4的基本构象变可以帮助十二缩肽朝向Ser2463卷曲回来[0474]图23显示了照片。采用UBE2L3(C86DAP)进行泛素化测试。A：采用UBE2L3(wt)、UBE2L3(C86A)或UBE2L3(C86DAP)在存在或不存在Ub和阝-巯基乙醇的情况下进行的泛素化Ub～UBE2L3：硫酯连接的(UBE2L3[wt])或异肽连接的(UBE2L3[C86DAP])E2-Ub复合物。在发现选择性地引入DAP的氨酰基-tRNA合成酶可能具有挑战性。因此，我们设计并合成(图tRNA合成酶—tRNACUA对将使其能够位点特异性引入到蛋白质中，以及通过过渡金属催化30[0480]相对于我们先前分别使用PCC1RS/tRNACUA和PCC2RS/tRNACUA对引入到蛋白质中的琥珀密码子的作用。的光笼型衍生物的合成酶32。我们在每个ncAA存在的情况下对每个库进行了两轮连续的正我们预期可以将其翻译后脱保护以显示侧链胺。该氨基酸比氨基酸1-5具有更有利的预测[0489]相对于MbPylRS，所选的合成酶含有四个活性位点突变(Y271C、N311Q、Y349F和1mM6的存在下表达了在150位含有琥珀终止密码子(TAG)的超折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)[0494]电喷雾电离质谱法(ESI-MS)证实了DAPRS/tRNAPylCUA对响应于琥珀密码子引导6引间体可能经历进一步的反应，导致DAP(通过巯基的5exo-trig环化作用到氨基甲酸酯的羰基上和所得四面体中间体的塌陷来释放氨基，或通过形成环硫化物和二氧化碳来释放氨-2[0499]半胱氨酸蛋白酶(如烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶)通常含有Cys-His-Asp催化三分活性位点半胱氨酸并捕获酰基酶中间体。使用提供有0.1mM6并表达His6-硫辛酰基-TEV(151TAG)-Strep的大肠杆菌以及DAPRS/tRNAPylCUA对生产TEVCys1516蛋白酶，其中6替换了活性位点中的催化半胱氨酸。通过串联亲和色谱法纯化蛋白质，每升培养物的产量为~TEVDAP与模型底物Ub-tev-His6(其中TEV裂解位点(tev)侧接泛素和六组氨酸标签)一起孵Cys151DAP取代对于形成含有TEV和Ub的较慢迁移带至关重要，以及Ub不从TEVDAP突变体中[0502]为了深入了解TE结构域的功能以及制备其以与DAP引入系统一起使用，我们克隆域的天然底物是通过硫酯与磷酸泛酰巯基乙胺-PCP(肽基-PCP)连接的肽中间体。在NRPS缩肽基-SNAC7，补充图6和补充图7)，并发现将其与VlmTEwt一起孵育导致产生缬氨霉素wt可使用四缩肽基-SNAC7来完成其催化循环的所有[0503]在缬氨霉素合成中检测到的合成中间体揭示了VlmTEwt催化两种可能的途径(补充图10)18,40。VlmTEwt可能通过四缩肽基-O-TE中D-hiv的远端羟基与是因为八缩肽以后将再次转移到TE结构域)，潜在地低聚D‑hiv–D‑val‑L‑lac–L‑val部分。由四缩肽基‑SNAC7合成缬氨霉素的反应的LC‑MS显示质量对应于八缩肽基‑SNAC11和十8)的混合物进行的实验显示了脱氧‑八缩肽基‑SNAC12和脱氧‑十二缩肽基‑SNAC16的峰构域在最终产物中具有比以前想象的略微更[0505]我们接着获得并优化了用于使TEwt稳健且可重复生长图用缩肽基‑SNAC分子浸泡TEwt晶体的几次尝试未能揭示活性位点中可解释的配体电子密[0507]为了使VlmTE的酰基酶复合物可视化，我们生产了其中活性位点丝氨酸2463被DAP替换(TEDAP)的VlmTE。Vlm2TE(2463TAG)在含有DAPRS/tRNACUA对并补充有0.1mM6的大肠杆菌中的表达使得能够纯化其中丝氨酸2463被6替换的VlmTE，每升培养物的产量为~[0508]为了提供对VlmTE催化循环中第一个酰基‑TE中间体的了解，我们捕获了一个四缩肽基‑N‑TEDAP缀合物。用四缩肽基‑SNAC7孵育TEDAP导致以>60％的收率产生稳定的缩肽[0509]我们假设TEDAP–催化四缩肽基-SNAC7的羟基攻击四缩肽基-N-TEDAP缀合物可能有与残基DAP2463之间的酰胺键的较弱但清楚的密度(图6f，h)。L-val4位的羰基氧与残基氧四缩肽与盖子没有任何相互作用，其构象与第一种TEwt结构中的构象几乎相同(补充图[0511]接下来，我们专注于通过捕获十二缩肽基-N-TEDAP缀合物来深入了解VlmTE催化于环化反应的逆反应的反应而产生十二缩肽基-N-TEDAP，并且该缀合物将凭借酰胺键成为[0512]十二缩肽基-TEDAP的所有八个晶体学上独立的分子显示出十二缩肽的一些密度。分子P1_A-F和H3_A-B分别显示出全都遵循远离活性位点DAP的相似轨迹。除连接至DAP的L-val残基外的缩肽与TE结构域之白和四缩肽基结合的结构中都观察到的盖子的构象，十二缩肽基-TEDAP结构中的盖子发生[0513]将VlmTE盖子在载脂蛋白/四缩肽结合的结构中的位置与盖子在十二缩肽结合的VlmTE的盖子螺旋以明显不同的方式在载脂蛋白/四缩肽基结合的结构中以及在十二缩肽[0514]这种独特的盖构象直接影响缩肽的可能位置。在盖子的载脂蛋白/四缩肽结合的这可能有助于在环化步骤期间使十二缩肽卷曲回向Ser/DA[0518]所有试剂均购自Sigma-Aldrich，但以下除外：L-乳酸购自Fisher使用。缬氨霉素购自Sigma-Aldrich和BioShopCanada。所有溶剂均购自FisherBrukerAVANCEII(1H谱图在400MHz下以及13C谱图在100MHz下操作)和BrukerAVANCE300(1H谱图在300MHz以及13C谱图在75MHz下操作)进行NMR光谱法。在MicromassQ-TOFI上进行高分辨率质谱法(HRMS)用于ESI测量(JohnL.HolmesMassSpectros3COOH3OH-C2H5OH-CH2Cl23CH3CNCH2Cl2重复三次以通过共沸蒸发除去大量的1,4-二氧六环。将残留物重新溶解于干燥的CH3OH(10mL)中，并用干燥的Et2O(500mL)研磨以使产物沉淀。将其过滤并用另外的Et2O(2×液在0℃下历经5min在氩气正压下通过插管转移至含有Boc-L-Dap-OtBu的主烧瓶中。然后2H13CNMR[0532]将(S)-2-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-[(2-硝基苄基)氨基]丙酸叔丁酯3a(4.59g，在氩用另外的干燥的Et2O(150mL)洗涤，然后用干燥的正己烷(50mL)洗涤，然后在高真空下(<二氧基-2'-硝基苯乙酮32,50,514b，为黄色结晶(12.141g，58％)：Rf＝0.52(CH2Cl2)；2Cl2)νmax2980,1708,1525,1506,1484,1424,1362,1338,1271,1152,1038,932,875,819cm-1；MS(ESI+)m/z[0538]在2升单颈圆底烧瓶中将4',5'-亚甲二氧基-2'-硝基苯乙酮4b(43.714g，物在室温下超声处理10min以使大部分黄色固体溶解。在15℃下将NaBH4颗粒(7.116g，100％CH2Cl2)判断反应完成，1135,1090,1038,934,819cm-1；MS(ESI+)m/z(相对强度)234[(M+Na)+,1％],194[(M-OH)+,[0541]使用热风枪在>100℃下将1升3颈圆底烧瓶在真空中干燥15min，并用干燥的氩气装载到分液漏斗中，弃去水相，并依次用另固体。粗产物通过在SiO2上进行快速色谱法[洗脱液：CH2Cl2/正己烷(1:1)，然后100%HNMR2Cl2)νmax2981,2970,2930,1615,1504,1481,1420,1395,1385,1328,1305,1257,1156,1141,1057,1028,1014,957,925,872,815,752,730,719,698cm-1；HRMS(ESI+)m/z计算为C9H879BrNO4[M+Na]+：[0544]在干燥的1升三颈圆底烧瓶中将Boc-L-Dap-OtBu·HCl1b(6.233g，21.0mmol，后向反应混合物中加入(R,S)-1-溴-1-[4',5'-(亚甲二氧基)-2'-硝基苯基]乙烷4d望产物(2S)-2-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-{[1-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧环戊烯-5-基)乙147(10)；HRMS(ESI+)m/z计算为C21H32O8N3[M+H]+：454.2184，实测为454.2201(Δ=[0545](2S)-2-氨基-3-{[1-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧环戊烯-5-基)乙基]氨基}丙酸[0547]在用铝箔包裹以避光的干燥250mL圆底烧瓶中将(2S)-2-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-{[1-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧环戊烯-5-基)乙基]氨基}丙酸叔丁酯4e(4.303g，9.489mmol，1.0eq.)溶解于干燥的CH2Cl2(30mL)中。加入新鲜蒸馏的CF3COOH(15mL，用正己烷(150mL)洗涤。将浅黄色粉末转移到100mL圆底烧瓶中，并在黑暗中于高真空(<DMSO-d631.5Hz),168.7(2×C),[0548]2,5-二氧代吡咯烷-1-基(1-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧环戊烯-5-基)乙基)碳酸TLC分析(SiO2板，CH3CN/CH2Cl2＝1:19)判断反应完成。然后将黄色反应混合物吸附到烷-1-基-(1-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧环戊烯-5-基)乙基)碳酸酯5a，为黄色针状结晶[0553]在用铝箔包裹以避光的干燥1升单颈圆底烧瓶中将Boc-L-Dap-OH1a(2.553g，12.5mmol，1.25eq.)悬浮于干燥的THF(180mL)和干燥的CH3CN(20mL)中。将干燥的DIPEACH2Cl2/CH3OH/CH3COOH＝94:5:1)和LC-MS然后将浅黄色沉淀物过滤并用Et2O(2×100100mL圆底烧瓶中将新鲜的(R,S)-1-溴-1-[4',5'-(亚甲二氧基)-2'-硝基苯基]乙烷1315min脱气。将13的1,4-二氧六环脱气溶液在氩气正压下使用插管在室温下滴加转移到含将内容物在氩气气氛中在黑暗中于室温搅拌12h，然后通过TLC和LC-MS分析(C18反相柱，IR(neat)νmax3393,2980,1617,1518,1503,1480,1418,1375,1332,1252,1156,1031,928,872,817,干燥的烧瓶中装入溶解于干燥的CH3CN(90mL)中的2-{[1-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧环戊=3:7)。EtOAc/正己烷＝3:7)和LC-MS分析(C18反相柱，H2O-CH3CN作为流动相)二者判断反应完成，证实了6b的消耗。然后将反应混合物吸附到{[1-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧环戊烯-5-基)乙基]硫代}-乙氧基)羰基]氨基}丙HNMR(400.13MHz,CDCl3)δ(差向异构体的混合物)1.44(s,9H),1.46[0568]在氩气下，将Boc-L-Dap后，通过LC-MS(C18反相柱，H2O-CH3CN作为流动相)判断反应完成，将内容物吸附到Biotage&IsoluteHM-N吸附剂上，并减压干燥。然后在黑暗中在球形SiO2[supelcoB,购[d][1,3]二氧环戊烯-5-基)乙基]硫代}-乙氧基)-羰基]氨基}丙酸6d，为稠的黄色胶状物采用0.1％v/v％v/vTMS作为内标]δ23.1(CH3),28.4(3×CH3),[0572]将(2S)-2-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-{[(2-{[1-(6-硝基苯并[d][1,3]-二氧环戊后将黄棕色胶状物溶解在干燥的CH3OH(40mL)中，在氩气气氛下转移至干燥的2L圆底烧瓶1JC-F=将内容物在0℃下剧烈搅拌15min，然后在室温下搅拌2h。然后将沉淀物过滤并用干燥的Et2O(3×500mL)洗涤，接着用干燥的正己烷(150mL)洗涤。将产物在黑暗中在高真空(<)4溶解在THF(215mL)中。使用冰浴将混合物冷却至0℃,并历经20min滴加冷却的LiOH溶液4洗涤并浓缩。通过二氧化硅柱色谱法(50％至90％的EtOAc的己烷溶液)从粗混合物中纯化HNMR(300MHz,CDCl3)63.48,39.47,31.04,28.51,25.82,23.23,22.04,19.47,18.00,16.83,-4.52SO4干燥并浓缩。用硅胶柱色谱法(2％13CNMR(100MHz,CDCl3)δ200.20,175.47,170.94,68.66,63.77,39.24,30.90,28.71,23.25,21.28,19.45,HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.99–5.82过硅胶柱色谱法(20％EtOAc的己烷溶液)纯化标题化合物(2.12g，84％)。Rf＝0.41(1:CNMR(100MHz,CDCl3)δ200.14,171.72,22H39N3NaO7S的精确质量计算为：(100MHz,CDCl3)δ172.85,172.49,56.91,52.19,46.14,31.35,26.29,22.56,22.53,19.07,17.9345.90,31.53,27.50,22.76,22.72,19.6Na2SO4干燥并浓缩。通过二氧化硅柱色谱法(1％至5％的MeOH的CH2Cl2溶液)从粗残余物中173.48,171.62,171.04,170.65,71.03,64.93,58.71,45.66,39.33,30.37,30.35,28.75,HNMR(400MHz,13CNMR39.32,30.72,30.55,28.91,26.35,23.30,22.64,22.57,19.42(2C),18.16496.2457氨霉素和可能的其他环状产物28)以形成近乎天然的酰基点可从信息丰富的终端抑制剂捕获的EntF的PCP-TE结构46中推断出来(图7)。PCP域停靠在结构中的位置与盖子的十二肽结合的构象相容，但在我们的VlmTE结构中与载脂蛋白/四子可能促进这种情况，也许使用了与我们在十二肽基-TEDAP结构中观察到的口袋类似的口可以容纳与PCP结构域结合的四缩肽基-PPE并将其引导朝向活性位点(图7b)。过渡到开放的/大部分无序的盖子(如在EntFPCP-TE中所看到的)可以使PCP呈现出硫酯以转移[0628]在十二缩肽-TEDAP的结构中看到的盖子构象和半球形样口袋可能在硫酯酶循环中作用使得不太可能在合成循环的这些步骤中的任何一个步骤中存在单个完整定义的构象。到PCP结构域和TE域之间来回转换，并且同一四缩肽必须在循环过程中处于多个不同的位防止盖子中的类似于我们在这里观察到的结构重排而起作[0630]尽管我们专注于利用编码的DAP提供有关缬氨霉素合成中的硫酯酶酰基酶中间体的见解，但DAP系统为研究以半胱氨酸或丝氨酸结合的酰基酶中间体为特征的多种酶具有结构域和PKS酮基合酶结构域。本文报道的方法的扩展将促进各种酰基酶中间体的结构和而形成半脱保护的中间体。第二分子内反应最终导致完全脱保护的DAP。纯化UBE2L3[0639]UV光照射并在37℃孵育3h后UBE2L3(C86DAP5)-Strep的LC-ESI-MS：UBE2L3[0641]不幸的是，在37℃下较长的孵育时间(6h和16h)并未导致UBE2L3(C86INT)-Strep间后UBE2L3(C86DAP5)-Strep的总蛋白质LC-ESI-MS的约30％。在37℃下将UBE2L3[0642]为了测试已用UV线照射并在37℃下孵育过夜的UBE2L3(C86DAP5)是否可以用Ub装[0646]最后，为了表征新形成的键的化学性质，在胰蛋白酶消化后，将与UBE2L3(C86DAP)–Ub复合物相对应的带切除并通过串联质谱法进行分析(由Proteomics[0651]在本实施例中，我们显示了在大肠杆菌细胞(BL21)和哺乳动物细胞(HEK293T)中GFP(在C末端带有TEV切割位点的GFP)和C末端带有Strep标签的TEV蛋白酶的不同变体(WT/GFP(在C末端带有TEV切割位点的GFP)和C末端带有Strep标签的TEV蛋白酶的不同变体(WT/[0657]在20℃诱导与含有GFP的质粒和含有TEV的质粒共转化的BL21(DE3)细胞来表达蛋胞以5,000g离心5分钟。丢弃上清液，将沉淀重悬在含有新鲜添加的抗生素的新鲜培养基[0659]将HEK293T细胞与含有GFP的质粒、含有TEV的质粒共转染。转染后30min添加1mMDappc(DAP5)用于琥珀抑制。转染后48h，用UV光(365nm，10mW/cm2)照射6孔板中的细胞化到EletrocompetentMegaXDH10BTMT1RElectrocompTM大肠杆菌细胞(Invitrogen)，并接种到具有适当抗生素的过夜培养物中以制备质粒DNA。通过将转化拯救培养物的系列稀移酶报告因子与允许位置的琥珀密码子(密码子112)并表达同族tRNA来进行正选择。在氯霉素(通常为50g/mL)LB琼脂上进行正选择后存活的细胞预计将使用组成型存在于细胞中的天然氨基酸或添加到细胞中的ncAA。负选择使用了一种含有琥珀密码子的芽孢杆菌RNA[0669]在含有pBK_DAPRS或pBK_PylRS载体的MegaXDH10BT1R细胞中，从pSF-[0671]将BL21(DE3)细胞用pNHD-His6-硫辛酰基-TEVwt-Strep、pNHD-His6-硫辛酰基-TEVAla-Strep(基因是来自MarkAllen的赠予)40转化或与pSF-DAPRS-PylT41pNHD-His6-硫卡那霉素)的TB-琼脂板上于37℃下生长过夜(含有25μg/mL四环素(以及用于共转化细胞的用镍亲和色谱法(HisTrapHP柱，GEHealthcare)并采用咪唑线性梯度(0mM至500mM)来纯1mMIPTG诱导培养物，并在37℃下进行蛋白质表达6h。通过离心收获细胞并重悬50mM来澄清裂解物，并通过0.4μmPES膜进行过滤。使用镍亲和色谱法(HisTrapHP柱，GEHealthcare)并采用咪唑线性梯度(30mM至500mM)来纯化Ub。将蛋白质在4℃下针对10mMtris-HCl透析过夜，并使用在50mM乙酸铵pH4.5中的NaCl梯度(0-1MmM)通过离子交换色谱法(HiTrapS5mL柱，GEHealthcare)来进一步纯化Ub。合并纯的部分，然后针对20mMtris-HClpH7.4透析过夜。然后使用AmiconUltra-15(3kDaMWCO)离心过滤器装置(Millipore)将样品浓缩至～15mg/12％NuPAGEBis-Tris凝胶(Invitrogen)上，并使其在2-(正吗啉HRP缀合物(αStrep)[IBALifesciences]或P4D1抗体(αUb)[EnzoLifeSciences])加入的乙腈水溶液梯度从ZorbaxC18(4.8x108个细胞的估计值和0.6x10-15L的细胞体积来[0679]通过ATUM(以前为DNA2.0)在pJExpress411载体中合成含有vlm2PCP4-TE(编码来自津岛链霉素(Streptomycestsusimaensis)的Vlm2的残基2290-2655，GenBank：物TE_for_pNHD_fw和TE_for_pNHD_rev从pJExpress411-vlm2-TEwtPCR-扩增TEwt编码序[0681]对于蛋白质纯化，将TEwt的细胞沉淀重悬于5mL缓冲液wt-A(50mMTRISpH7.4，处理裂解。通过以40000g离心20min来澄清裂解物。将澄清的裂解物施加到串联在AKTAPrime系统(GEHealthcareLifeSciences)上的两个5mLHiTrapIMACFF(GE白质。合并含有TEwt的部分(通过SDS分析确定)，并与TEV蛋白酶以1:100(Te:TEV)质10kDa截留分子量Amicon@超速离心过滤器(Millipore)中浓缩含TEwt的部分，然后注入到在SEC缓冲液(25mMHEPESpH7.4或pH8.0，100mMNaCl，0.2mM三(2-羧基乙基)膦交换，除了在流动相中用25mMHEPES代替TRIS作为缓冲液和用0.2mMTCEP代替βME作为还[0684]在气相扩散结晶试验中使用商业上可获得的筛选(Qiagen)和10mgmL-1的蛋白质于500μLDL-苹果酸pH8.1的储库溶液孵育0.5μL的22.4mgmL-1的纯化TEwt和0.5μL的液平衡的由1μL十二缩肽基-TEDAP复合物加1μL储库溶液(1.30至1.45MDL-苹果酸pH8.1)[0687]通过向结晶滴中加入10μL(TEwt结构1和十二缩肽基-TEDAP)或20μL(TEwt结构2)RUH3R发生器和R-AXISIV++检测器上收集。使用Pilatus检测器在加拿大光源(Canadian24-ID-C光束线上收集了TEwt和缩肽基-TEDAP复合物的更高分辨[0689]使用iMosflm47或DIALS48对TEwt结构1晶体的衍射数据进行索引并整合到空间群P432中。使用POINTLESS和SCALA49程序进行进一步的空间群确定和缩放。该结构通过使用PHASER50进行分子替换来解决，并以srfA-C(PDBID2VSQ)52的TE结构域的SCULPTOR51改良形式作为检索模型。使用Phenix53和AUTOBCoot55进行迭代模型构建。使用TopDraw56基于使用TEwt结构作为输入的PDBsum生成结果(http://www.ebi.ac.uk/thornton-sr[0690]使用iMosflm47或DIALS48，将从十二缩肽基-TEDAP复合物晶体收集的衍射数据集底物构建以及REFMAC559和phenix.refin[0692]将终浓度为0.2mgmL-1的TEDAP或TEwt与四缩肽基-SNAC7(1.7mM)或缬氨霉素(50μM)在含有1.7％或1％v/vDMSO的缓冲液T中一起孵育16小时。在截留分子量为10kDa的其施加至在缓冲液T中预平衡的SuperdexS-7510/300柱中，以在最终LC-ESI-MS分析之前去除过量的缩肽基-SNAC或缬氨霉素。为了形成脱氧四缩肽基-TEDAP复合物，将终浓度为8.7mgmL-1的TEDAP与脱氧四缩肽基-SNAC8(2.6mM)在25mMHEPESpH8.6、100mMNaCl、谱仪上进行在线电喷雾电离质谱(ESI-MS)。使用Jupiter5μC4300A柱，150mmx2.00mm通过监测200和280nm处的UV吸光度来检测蛋白质。使用OpenLABCDS软件(Agilent16uL注入到与BrukerAmazonSpeedETD离子阱质谱仪连接的AgilentTechnologies1260InfinityHPLC系统上的在95％流动相A(0.1％甲酸水溶液)和5％流动相B(0.1％甲酸的100％乙腈溶液)中预平衡的AgilentPLRP-S(1000A5μM,50x2.1mmID)柱中。使用分钟。通过监测280nm处的UV吸光度来检测蛋白质。使用BrukerDataAnalysis软件化和串联MS/MS分析由KateHeesom(PSNAC7和脱氧四缩肽基-SNAC8(各1.7mM)在缓冲液T中的混合物一起孵育。在室温下将样中采用与正ESI模式的BrukermaXisimpactQTOF质谱仪偶联的DionexUltimate3000UHPLC系统中的AgilentXDB-C8(5模式的BrukerAmazonSpeedETD离子阱质谱仪偶联的AgilentTechnologiesBrukerDataAnalysis软件和SmartFormula工具(Bruker)[0701]1.Holliday,G.L.,Mitchell,J.B.O.&Thornton,J.M.UnderstandingtheFunctionalRolesofAminoAcidResiduesinEnzymeCatalysis.Journalofmolecularbiology3[0703]3.Hedstrom,L.Serineproteasemechanismand[0704]4.Long,J.Z.&Cravatt,B.F.TheMetabolicSerineHydrolasesandTheirFunctionsinMammalianPhysiologyandDisease.ChemRev111,6022-6063andFutureProspectsasPharmacologicalTargets.Fron[0707]7.Swatek,K.N.&Komander,D[0708]8.Yang,W.&Drueckhammer,D.G.Understandingtherelativeacyl-transferreactivityofoxoestersandthioesters:computationalanalysisoftransitionstatedelocalizationeffects.JournaloftheAmericanChemicalSociety123,[0709]9.Liu,B.,Schofield,C.J.&Wilmouth,R.C.Structuralanalysesonintermediatesinserineproteasecatalysis.JournalofBiologicalChemistry[0710]10.Ngo,P.D.,Mansoorabadi,S.O.&Frey,P.A.SerinePComputationalStudyofTetrahedralIntermediatesandInhibitoryAdducts.JPhysJ.P.G.Quantifyingtetrahedraladductformationandstabilizationinthecysteineandtheserineprotea[0712]12.Scaglione,J.B.etal.Biochemicalandstructuralcharacterizationofthetautomycetinthioesterase:analysisofastereoselectivepolyketidehydrolase.AngewChemInt[0713]13.Cappadocia,L.&Lima,C.D.Ubiquitin-likeProteinConjugation:Structures,Chemistry,andMechanism.Che[0714]14.Plechanovova,A.,Jaffray,E.G.,Tatham,M.H.,Naismith,J.H.&Hay,R.T.StructureofaRINGE3ligaseandubiquitin-loadedE2primedforcatalysis.Nature4ItsMethylEsterwithMetalIons.1.FormationConstants.JChemSocA,3562-&[0716]16.Lan,Y.etal.ICationicAmphipathicPeptidesProducespH-SensitiveVectors.Chembiochem11,[0717]17.Radzicka,A.&Wolfenden,R.Ratesofuncatalyzedpeptidebondhydrolysisinneutralsolutionandthetransitionstateaffinitiesofproteases.JournaloftheAmericanChemicalSociety[0718]18.Hoyer,K.M.,Mahlert,C.&Marahiel,M.A.Theiterativegramicidinsthioesterasecatalyzespeptideligationandcyclization.Chemistry&biology14,[0719]19.Alonzo,D.A.,Magarvey,N.A.&Schmeing,T.M.Characterizationofcereulidesynthetase,atoxin-producingmacromolecularmachine.PloSone10,cereulideNRPSalpha-hydroxyacidspecifyingmodules:activationofalpha-ketoacidsandchiralreductionontheassemblyline.JournaloftheAmericanChemicalSociety128multimodularnonribosomalpeptidesynthetases:thethioesterasedomainofE.coliEntFcatalyzesbothelongationandcyclolactonization.Chemistry&biology[0722]22.May,J.J.,Wendrich,T.M.&Marahiel,M.A.ThedhboperonofBacillussubtilisencodesthebiosynthetictemplateforthecdihydroxybenzoate-glycine-threoninetrimericesterbacillibactin.JBiolChem[0723]23.Zhou,Y.etal.IterativeMechanismofMacrodiolideFormationintheAnticancerCompoundConglobatin.Chemist[0724]24.Robbel,L.,Hoyer,K.M.&Marahiel,M.A.TioST-TE--aprototypicalthioesteraseresponsibleforcyclodimerizationofthequinoline-andquinoxaline-typeclassofchromodepsipeptides.FEBSP.ReconstitutedbiosynthesisofthenonribosomalmacrolactoneantibioticvalinomycininEscherichiac[0726]26.Akey,D.L.etal.Structuralbasisformacrolactonizationbythepikromycinthioesterase.Na[0727]27.Samel,S.A.,Wagner,B.,Marahiel,M.A.&Essen,L.O.Thethioesterasedomainofthefengycinbiosynthesiscluster:astructuralbaseforthemacrocyclizationofanon-ribosomallipopeptide.Journalofmolecularbiology[0728]28.Tseng,C.C.etal.CharacterizationofthesurfactinsynthetaseC-[0729]29.Bruner,S.D.etal.Structuralbasisforthecyclizationofthelipopeptideantibioticsurfactinbythethioesterasedomain[0730]30.Li,J.etal.Palladium-triggereddeprotectionchemistryfor[0731]31.Baker,A.S.&Deiters,A.OpticalControlofProteinFunctionthroughUnnaturalAminoAcidMutagenesisandOtherOptogeneticApproaches.Acs[0732]32.Nguyen,D.P.etal.GeneticEncodingofPhotocagedCysteineAllowsPhotoacti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