北京地区人腺病毒呼吸道感染临床及分子流行病学特征分析

北京地区人腺病毒呼吸道感染临床及分子流行病学特征分析目的：探究当前北京地区引起呼吸道感染的人腺病毒（HAdV）的临床及分子流行病学特征。方法：回顾性分析2023年11月至2024年9月期间，北京协和医院门诊、急诊及住院因呼吸道感染就诊并核酸检测为HAdV阳性的人群的HPV基因分型结果。结果：2023年11月-2024年9月，进行六项呼吸道病原体核酸检测共13247例，其中HAdV核酸阳性共928例（7.01%），纳入本次测序分型共141例。测序分型结果为HAdV-3型共118例（83.69%），HAdV-21型共10例（7.09%），HAdV-114型共9例（6.38%）,HAdV-7型共2例（1.42%），HAdV-1型共1例（0.71%），HAdV-5共1例（0.71%）。就诊患者临床诊断为急性上呼吸道感染共127例（90.07%），HAdV轻型肺炎共10例（7.09%），HAdV重症肺炎共4例（2.84%）。HAdV合并病毒或细菌感染共12例（8.51%）。呼吸道感染的HAdV部分阳性患者表现有消化道（腹痛、腹泻）、眼部（结膜炎）的感染症状。在重症案例中，患者出现了神经系统感染、急性肾功能不全、急性心功能不全、凝血功能障碍等多组织器官功能损伤，这可能与患者存在高血压、糖尿病等基础疾病且存在细菌混合感染情况有关。结论：本次结果与其他北京地区HAdV流行性研究结果具有差异。北京地区HAdV的分子流行特征较疫情期间发生变化，HAdV-B型（HAdV-3型）仍作为主要流行优势型别，同时发现了少量HAdV-114型的流行。HAdV作为地区流行性差异大的病毒，需要地区性持续性的监测，为建立北京地区HAdV监测体系提供支持，并为HAdV的预防和控制提供科学依据。关键词：人腺病毒，呼吸道感染，分型，北京地区。人腺病毒（HumanAdenovirus，HAdV）属于乳腺腺病毒属中的腺病毒科，是无包膜的二十面体病毒颗粒。HAdV包含一个双链DNA基因组，核酸长度为26至45kb。病毒外壳由五邻体、六邻体以及纤维蛋白组成。HAdV可分为A-G共7个亚属，迄今为止已检测到116（/）种类型，其中大多数新型HAdV起源于类型间重组，这可能导致病毒的适应力、组织嗜性以及毒力发生变异。新出现的类型或重组菌株由于尚未形成群体免疫且缺乏特异性疫苗干预，极具潜在风险且极易广泛传播，这种情况容易引发流行病暴发，对公共卫生构成严峻威胁。HAdV具有高度传染性，可通过空气、飞沫、粪-口传播；常暴发于军营、游泳池、医院和学校ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[1]。据有关报道指出，HAdV的感染检测频率在不同月份、季节、年龄段以及地域上展现出明显的差异。HAdV对人体的感染通常是自限的，健康人群可自愈。HAdV最常感染呼吸道，占急性呼吸道感染患者的5.8%～13%ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[2]；同时其有广泛的组织嗜性，可累及多个组织器官。在年幼儿童、免疫功能低下患者中，腺病毒有更严重的感染率以及危害性，它可导致多个器官严重损伤，例如肝脏、心脏、脑膜和大脑，可引起结膜炎、肠胃炎、腺病毒性肺炎，甚至是HAdV性肝炎、心肌炎等重症疾病。这可能与HAdV在胃肠道、呼吸道、结膜和泌尿道的初级屏障的上皮细胞中复制良好有关ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[3]。在新冠疫情发生前，2015～2019年，我国HAdV流行率逐年升高ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[1,4]，北京地区HAdV流行率由2015年的1.75%达到2018年高峰4.39%ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>王方明</Author><Year>2023</Year><RecNum>94</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[5]</style></DisplayText><record><rec-number>94</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="aesaweazcsfstnesats5xe2rtppdv2r9r99p"timestamp="1744718565">94</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">王方明</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">北京地区儿童人呼吸道腺病毒种系进化特点及腺病毒重组机制研究</style></title></titles><volume><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">博士</style></volume><dates><year>2023</year></dates><publisher><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">北京协和医学院</style></publisher><urls></urls></record></Cite></EndNote>[5]，流行的主要型别是HAdV-3与HAdV-7。在COVID-19期间，国家采取非药物干预措施（NPIs）应对这一大流行公共卫生问题，这使得能够在个人、环境、社区和国家层面采取行动来限制新冠病毒感染的传播，同时显著降低了流感病毒、呼吸道合胞病毒等其他呼吸道病原体感染的阳性率ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[6]。疫情期间，2019年～2022年，HAdV流行率明显下降，北京地区由2019年感染率3.38%下降至2021年1.25%，主要的流行型别为HAdV-1，替代了HAdV-3与HAdV-7型别ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>王方明</Author><Year>2023</Year><RecNum>94</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[5]</style></DisplayText><record><rec-number>94</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="aesaweazcsfstnesats5xe2rtppdv2r9r99p"timestamp="1744718565">94</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">王方明</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">北京地区儿童人呼吸道腺病毒种系进化特点及腺病毒重组机制研究</style></title></titles><volume><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">博士</style></volume><dates><year>2023</year></dates><publisher><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">北京协和医学院</style></publisher><urls></urls></record></Cite></EndNote>[5]；郑州地区ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[7]的一项重症急性呼吸道感染患者的流行病学监测结果指出，流感病毒、鼻病毒在NPIs实施前后阳性率有显著降低，但HAdV变化不大；这符合文献报道的新冠病毒后腺病毒感染仍是持续性的这一观点ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[6]。在2023年后半年尤其是年底，HAdV感染大爆发，在北京地区2023-2024年秋冬季急性呼吸道感染疾病的病原体流行情况分析中，显示HAdV单一感染率为8.33%，复合感染率为2.75%，HAdV整体感染率呈上升趋势ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>曹艳</Author><RecNum>96</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[8]</style></DisplayText><record><rec-number>96</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="aesaweazcsfstnesats5xe2rtppdv2r9r99p"timestamp="1744805833">96</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>曹艳</author><author>陈雨</author><author>伊洁</author><author>孔令君</author><author>王子怡</author><author>张睿</author><author>于奇</author><author>刘仪威</author><author>木拉提江·买买提</author><author>杨城林</author><author>孙玉杰</author><author>徐英春</author><author>杨启文</author><author>杜娟</author></authors></contributors><auth-address>南通大学附属医院医学检验科;中国医学科学院北京协和医院检验科;</auth-address><titles><title>北京地区2023—2024年秋冬季急性呼吸道感染疾病的病原体流行情况分析：以北京协和医院5556例患者为例</title><secondary-title>协和医学杂志</secondary-title></titles><periodical><full-title>协和医学杂志</full-title></periodical><pages>1-13</pages><keywords><keyword>急性呼吸道感染</keyword><keyword>病原体</keyword><keyword>新型冠状病毒</keyword><keyword>北京</keyword><keyword>流行特征</keyword></keywords><dates></dates><isbn>1674-9081</isbn><call-num>11-5882/R</call-num><urls><related-urls><url>/urlid/11.5882.r.20241209.1043.002</url></related-urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[8]。韩国2020年～2023年的HAdV监测数据ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[9]显示，2023年HAdV感染率同样是明显上升，且分子型别较疫情期间发生改变。据此猜测，北京地区目前的HAdV流行型别可能较新冠疫情期间不同。本篇将以北京地区为例，分析北京协和医院在2023年11月～2024年9月收入的HAdV呼吸道感染就诊患者的HAdV基因分型结果与传统实验室指标、临床表现的关系，探究HAdV呼吸道感染临床与分子流行病学特征的关系，持续监测疫情后HAdV分子型别流行情况。2对象与方法2.1研究对象本研究为回顾性研究，旨在获得当前北京地区HAdV流行情况，重点分析HAdV基因分型结果与HAdV呼吸道感染患者的传统实验室指标、临床表现的关系。采取横断面分析，纳入2023年11～2024年9月在北京协和医院门诊、急诊及住院因呼吸道感染就诊并核酸检测为HAdV阳性的人群，共计141例。年龄范围为8月～63岁，平均年龄（11.57±12.00）岁。研究对象纳入标准：（1）门急诊及住院临床诊断为呼吸道感染；（2）采集呼吸道鼻咽拭子符合标准,且进行六项呼吸道病原体核酸检测并被检测HAdV阳性；（3）具有完整的实验室检查结果以及病案;（4）相应阳性标本进q-PCR的CT值<=35。2.2方法2.2.1样本采集与保存采集的鼻咽拭子转移到含3.5mL样本保存液的病毒采样管（友康生物科技股份有限公司）中，密封保存。尽快送至实验室，24小时内完成检测。2.2.2六项呼吸道病原体核酸检测六项呼吸道病原体包括甲型流感病毒（FluA），乙型流感病毒（FluB），鼻病毒（HRV），肺炎支原体（MP），呼吸道合胞病毒（RSV）和人腺病毒（HAdV）。应用核酸提取试剂盒（西安天隆科技有限公司，中国）和核酸提取仪，操作按照说明书进行。提取呼吸道标本的核酸（包括DNA和RNA）。按照六项呼吸道病原体核酸检测试剂盒（圣湘生物科技股份有限公司，中国）说明书配置核酸扩增体系，并设置阴性对照和阳性对照，采用实时定量（real-timequantitativePCR，RT-PCR）方法进行检测，同时试剂盒内参基因对采样及检测流程进行监控，结果判读严格按照试剂盒说明书要求进行。2.2.3腺病毒阳性标本临床信息收集LIS系统上2023年11月至2024年9月所收入的被诊断为腺病毒感染的阳性病例，疾病诊断标准：根据我国发布的《人腺病毒呼吸道感染预防控制技术指南（2019年版）》和《儿童社区获得性肺炎管理指南（2024版）》可将腺病毒感染患者分为（1）急性上呼吸道感染：表现为急性发热起病，同时伴咳嗽、咳痰、咽部不适、咽痛等；可出现腹泻、乏力、恶心、食欲减退等消化系统症状；少数患者出现头痛、头晕；患者病程1～14d（平均5～7d），多数呈自限性。（2）下呼吸道感染（人腺病毒肺炎）：患者多持续高热（38.5℃以上），同时可伴呼吸急促、胸闷，胸部X线片或CT检查发现肺部病变，肺部听诊可有湿啰音。少数可发展为重症肺炎，患者具有HAdV肺炎临床表现，并符合以下任一项主要标准或≥3项次要标准可诊断为危重症人腺病毒肺炎病例（主要标准：①需要气管插管行机械通气治疗；②脓毒性休克经积极液体复苏后仍需要血管活性药物治疗。次要标准：①呼吸频率增快:成人及5岁以上儿童≥30次／分,1岁以下婴幼儿RR>70次/min，1-5岁儿童RR>50次/min；②氧合指数≤250mmHg（1mmHg=0.133kPa）；③多肺叶浸润；④意识障碍和（或）定向障碍；⑤血尿素氮≥7.14mmol/L；⑥收缩压＜90mmHg需要积极的液体复苏）。（3）隐性感染：无任何临床症状，但具有传染性。本分析将所有患者分为以下3组：急性上呼吸道感染、轻型肺炎组和重症肺炎组。整理每个阳性病例患者的信息，具体有性别、年龄、来源地、临床症状（包括有无发热、咳嗽、咽痛、呕吐等呼吸道感染及特殊临床表现）、影像学或听诊结果、实验室检测数据（包括血常规、C反应蛋白等指标）、临床转归（包括治疗措施及预后），与其他病毒或细菌共患情况。2.2.4腺病毒阳性标本测序分型①阳性标本的筛选：取冻存的阳性标本进行核酸提取，收入CT值<=35的标本进行后续分型；②对标本进行全基因组测序分型：采用基于多重扩增富集的腺病毒全基因组测序方法；使用SQK-LSK110试剂盒构建上机文库；进行第三代Nanopore平台测序；获得北京地区HAdV流行优势基因型别。2.2.5统计学处理纳入对象年龄数据以均数±标准差表示。按照不同HAdV分型型别分组，使用SPSS26.0和Excel软件进行统计分析，以计数和百分比的形式展示各组的结果，组间差异的比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。使用GraphPadPrism8软件作图。3结果3.1HAdV阳性病例整体情况分析2023年11月～2024年9月间，在北京协和医院门诊、急诊及住院进行六项呼吸道病原体核酸检测共计13247例，其中HAdV核酸阳性共928例（占7.01%），单一合并感染率28.66%。诊断为呼吸道感染并纳入本次分析的阳性例数共计141例，排纳情况详见图1，纳入例数时间分布情况见图2。总体年龄范围为8月～63岁，平均年龄（11.57±12.00）岁。0～5岁婴幼儿组43例（30.50%），6～14岁儿童组共75例（53.19%），15～63岁中老青年组23例（16.31%）。141例HAdV阳性标本中，测序分型结果是HAdV-3型共118例（83.69%），HAdV-21型共10例（7.09%），HAdV-114型共9例（6.38%）,HAdV-7型共2例（1.42%），HAdV-1型共1例（0.71%），HAdV-5共1例（0.71%）。患者疾病临床诊断为急性上呼吸道感染共127例（90.07%），HAdV轻型肺炎共10例（7.09%）（分型结果为HAdV-3型9例、HAdV-7型1例），HAdV重症肺炎共4例（2.84%）（分型结果为HAdV-7型1例、HAdV-21型3例）。HAdV无合并其他病原体感染共130例（92.00%），合并鼻病毒感染共5例（HAdV分型结果都为HAdV-3型），合并肺炎支原体感染共1例（HAdV分型结果为HAdV-3型），合并乙型流感病毒感染共1例（HAdV分型结果为HAdV-3型），合并甲型流感、呼吸道合胞病毒感染共1例（HAdV分型结果为HAdV-3型），合并细菌真菌感染（都存在2种以上细菌或（和）真菌感染）共4例（HAdV分型结果1例为HAdV-7型、3例为HAdV-21型，都为重症肺炎感染病例）。3.2不同基因型别HAdV的临床情况分析本次北京地区HAdV阳性人群的基因分型结果以HAdV-3、HAdV-21、HAdV-114型为主，为探究此三型致病性是否存在显著差异，针对患者的实验室检查（血常规以C反应蛋白）、临床表现进行统计学分析，结果详见表2。HAdV阳性患者的白细胞计数较正常人（正常人指标范围为3.50～9.50×109/L）升高，尤其是HAdV-3型中性粒细胞计数（正常人指标范围为2.00～7.50×109/L）升高；C反应蛋白明显升高，尤其是HAdV-21型。在血常规指标中，感染HAdV-3型患者的白细胞计数最高，感染HAdV-21型患者的C反应蛋白含量最高；感染HAdV-3、与其他型别患者的淋巴细胞计数存在显著差异（P<0.05），其他指标间并无显著性差异。临床表现中，感染HAdV-21型患者发热体温最高；HAdV-3型致病性较重，涉及多组织嗜性（包括呼吸道、眼部、消化道）感染表现。3.3HAdV重症肺炎案例情况本次研究共纳入4例HAdV重症肺炎案例，为了更好的了解HAdV重症致病性以及后续研究，以时间流程图展示患的者基础情况、住院期间实验室检查、病情发展及诊治情况，详见图3。4讨论人腺病毒具有高度传染性、感染途径广泛；流行具有地区差异性，不同地区间的流行率与流行型别不同；全年持续存在感染，但存在相对集中爆发时间，在北方地区集中于春冬季节，在南方集中于春夏季节。且感染集中于免疫力低下人群，尤其是1～5岁婴幼儿ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[2]、老年人以及免疫抑制人群ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Khalifa</Author><Year>2022</Year><RecNum>74</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[10]</style></DisplayText><record><rec-number>74</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="aesaweazcsfstnesats5xe2rtppdv2r9r99p"timestamp="1739613099">74</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Khalifa,A.</author><author>Andreias,L.</author><author>Velpari,S.</author></authors></contributors><auth-address>RutgersRobertWoodJohnsonMedicalSchool,SaintPeter'sUniversityHospital,NJ,USA.</auth-address><titles><title>AdenovirusHepatitisinImmunocompetentAdults</title><secondary-title>JInvestigMedHighImpactCaseRep</secondary-title></titles><periodical><full-title>JInvestigMedHighImpactCaseRep</full-title></periodical><pages>23247096221079192</pages><volume>10</volume><keywords><keyword>Adenoviridae</keyword><keyword>Adult</keyword><keyword>*covid-19</keyword><keyword>*Epstein-BarrVirusInfections/diagnosis</keyword><keyword>Female</keyword><keyword>*Hepatitis,Viral,Human/diagnosis</keyword><keyword>Herpesvirus4,Human</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>SARS-CoV-2</keyword><keyword>acutehepatitis</keyword><keyword>adenovirusinfection</keyword><keyword>healthyadult</keyword><keyword>viralhepatitis</keyword></keywords><dates><year>2022</year><pub-dates><date>Jan-Dec</date></pub-dates></dates><isbn>2324-7096</isbn><accession-num>35225036</accession-num><urls></urls><custom1>DeclarationofConflictingInterests:Theauthor(s)declarednopotentialconflictsofinterestwithrespecttotheresearch,authorship,and/orpublicationofthisarticle.</custom1><custom2>PMC8891914</custom2><electronic-resource-num>10.1177/23247096221079192</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[10]。本研究基于北京地区单中心HAdV感染患者，纳入平均年龄为（11.57±12.00）岁141人。其中3～7岁，11～12岁纳入人数更多，这与该人群易发生集体感染有关。最经典的HAdV分型检测方法是基于中和试验和血凝抑制试验进行，HAdV-1～HAdV-51型因血清学的不同被定义命名。但一些HAdV的外壳蛋白基因发生核苷酸插入、缺失、替换或重组等突变，血清学不能准确将其区分，目前发现的HAdV-52～HAdV-116型都是基于基因组学鉴定。其中大多数新型别HAdV起源于类型间重组，这可能导致病毒的适应力、组织嗜性以及毒力发生变异。本研究HAdV分型结果是基于第三代Nanopore平台的一次大规模的全基因组测序，在大多数研究中，常见的测序手段有六邻体sanger测序ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[11,12]、外壳蛋白基因组sanger测序ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[4,13-15]、外壳蛋白基因组或全基因组的下一代测序（NGS）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[16-18]或MinION测序ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>张冲</Author><RecNum>97</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[12]</style></DisplayText><record><rec-number>97</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="aesaweazcsfstnesats5xe2rtppdv2r9r99p"timestamp="1744806598">97</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>张冲</author><author>邹林</author><author>佟玲</author><author>郗璐</author><author>刘肖</author><author>王芳</author><author>张猛</author></authors></contributors><auth-address>北京市通州区疾病预防控制中心;北京市通州区郎府社区卫生服务中心;</auth-address><titles><title>2023年北京市通州区学校呼吸道腺病毒暴发疫情感染病原特征分析</title><secondary-title>疾病监测</secondary-title></titles><periodical><full-title>疾病监测</full-title></periodical><pages>1-9</pages><keywords><keyword>呼吸道腺病毒</keyword><keyword>流行病学</keyword><keyword>暴发疫情</keyword><keyword>六邻体</keyword><keyword>全基因组测序</keyword></keywords><dates></dates><isbn>1003-9961</isbn><call-num>11-2928/R</call-num><urls><related-urls><url>/urlid/11.2928.R.20250226.1104.004</url></related-urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[12]。虽然基于HAdV外壳蛋白基因组的测序可以得到较准确的HAdV型别，但全基因组测序，可以获得更全面的遗传信息，验证分型结果，并发现潜在的重组或突变，这种综合方法可以更准确地了解HAdV的生物学特性、致病机制和进化动态。在测序平台方面，Sanger测序是经典的病毒基因组检测方法，由于其有较高的准确性和可靠性，一直延用至今，不可取代，但是只适用于测序量较小的项目ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[19]，如只测序HAdV六邻体高变区确定分型；Sanger测序通量低，不能适用于混合感染标本以及具有低频率突变的检测。基于HAdV六邻体的测序分型，常使用巢式PCR技术ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[12,20-22]扩增目的基因，提高检测灵敏度和特异性。随着测序技术的快速发展，有了成本低、通量高的下一代测序（NGS）。NGS已广泛应用于细菌、真菌或病毒的宏基因组测定ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[23]，不仅可以检测多微生物混合感染，准确定性定量检测多HAdV型别，同时可以识别新突变新重组ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Pungan</Author><Year>2022</Year><RecNum>106</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[24]</style></DisplayText><record><rec-number>106</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="aesaweazcsfstnesats5xe2rtppdv2r9r99p"timestamp="1744807646">106</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Pungan,D.</author><author>Eddens,T.</author><author>Song,K.</author><author>Lakey,M.A.</author><author>Crovetto,N.S.</author><author>Arora,S.K.</author><author>Husain,S.</author><author>Kolls,J.K.</author></authors></contributors><auth-address>CenterforTranslationalResearchinInfectionandInflammation,JohnW.DemingDepartmentofMedicine,TulaneUniversitySchoolofMedicine,NewOrleans,LA70112,USA. Children'sHospitalofPittsburgh,Pittsburgh,PA15201,USA. BiospecimenandCoreResearchLaboratory,DepartmentofResearch,OchsnerHealthSystem,NewOrleans,LA70121,USA. Multi-OrganTransplantProgram,DivisionofInfectiousDiseases,DepartmentofMedicine,UniversityHealthNetwork/UniversityofToronto,Toronto,ONM5G2N2,Canada.</auth-address><titles><title>TargetedNGS-BasedAnalysisofPneumocystisjiroveciiRevealsNovelGenotypes</title><secondary-title>JFungi(Basel)</secondary-title></titles><periodical><full-title>JFungi(Basel)</full-title></periodical><volume>8</volume><number>8</number><edition>20220817</edition><keywords><keyword>Pneumocystis</keyword><keyword>genotyping</keyword><keyword>pneumonia</keyword></keywords><dates><year>2022</year><pub-dates><date>Aug17</date></pub-dates></dates><isbn>2309-608x</isbn><accession-num>36012851</accession-num><urls></urls><custom1>Theauthorsdeclarenoconflictofinterest.</custom1><custom2>PMC9409852</custom2><electronic-resource-num>10.3390/jof8080863</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[24]。Illumina平台是常用的NGS平台ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[18,25,26]，虽然有较高的测序深度，但短读长基因覆盖率有限，准确率有限，Sanger测序仍是验证NGS结果的重要手段ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>GoHun</Author><Year>2020</Year><RecNum>121</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[27]</style></DisplayText><record><rec-number>121</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="aesaweazcsfstnesats5xe2rtppdv2r9r99p"timestamp="1744895192">121</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>GoHun,Seo</author><author>Hyeri,Kim</author><author>Minjeong,Kye</author><author>Jung-Young,Park</author><author>Dong-gun,Won</author><author>Jungsul,lee</author></authors></contributors><titles><title>QualitythresholdevaluationofSangerconfirmationforresultsofwholeexomesequencinginclinicallydiagnosticsetting</title></titles><dates><year>2020</year><pub-dates><date>2020/12/9</date></pub-dates></dates><publisher>ColdSpringHarborLaboratory</publisher><urls><related-urls><url>/10.1101/2020.12.08.416792</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1101/2020.12.08.416792</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[27]。Sanger测序与NGS各有优势，两平台联用将为HAdV的研究提供更强大的工具。三代测序作为不需要扩增的单分子测序技术，也已应用于HAdV分型。但是第三代测序技术错误率较高，也包括纳米孔测序（NanoporeSequencing）。为了测序结果更加准确，研究者根据研究目的、标本类型等因素，在测序平台基础上提出了许多测序策略。在测序对象选择上，有宏基因组测序（mNGS）、全基因组测序（WGS）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[26]、外显子测序（WES）、转录组测序（RNA-Seq）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Xu</Author><Year>2019</Year><RecNum>109</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[28]</style></DisplayText><record><rec-number>109</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="aesaweazcsfstnesats5xe2rtppdv2r9r99p"timestamp="1744808027">109</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Xu,W.</author><author>Xu,Z.</author><author>Huang,L.</author><author>Qin,E.Q.</author><author>Zhang,J.L.</author><author>Zhao,P.</author><author>Tu,B.</author><author>Shi,L.</author><author>Li,W.G.</author><author>Chen,W.W.</author></authors></contributors><auth-address>TreatmentandResearchCenterforInfectiousDiseases,302MilitaryHospitalofChina,Beijing,China. RadiationOncologyCenter,302MilitaryHospitalofChina,Beijing,China.</auth-address><titles><title>TranscriptomeSequencingIdentifiesNovelImmuneResponseGenesHighlyRelatedtotheSeverityofHumanAdenovirusType55Infection</title><secondary-title>FrontMicrobiol</secondary-title></titles><periodical><full-title>FrontMicrobiol</full-title></periodical><pages>130</pages><volume>10</volume><edition>20190206</edition><keywords><keyword>humanadenovirustype55</keyword><keyword>immuneresponse</keyword><keyword>interleukin-1family</keyword><keyword>transcriptomesequencing</keyword><keyword>tumornecrosisfactorsuperfamily</keyword></keywords><dates><year>2019</year></dates><isbn>1664-302X(Print) 1664-302x</isbn><accession-num>30787914</accession-num><urls></urls><custom2>PMC6372566</custom2><electronic-resource-num>10.3389/fmicb.2019.00130</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[28]等。在NGS平台上，对于基因组较小的病毒、细菌，常使用高产量低成本的单向测序策略ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[29]；为提高准确度、获得基因组重复序列、突变重组结构变异等信息，也有HAdV分型研究使用了双向测序ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[5,19]。在测序覆盖度上，对于复杂标本或低病毒含量的标本进行靶向多重扩增ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[12,30]或探针捕获测序ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[19]，实现目的基因的筛选与富集，不仅可以提高检测灵敏度、实现高通量，也可同时检测多种HAdV型别。但HAdV基因多样化且易变异，引物合成仍存在挑战。在存在多个病毒类型或外源核酸干扰的情况下，大规模平行扩增子测序ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[31]可以更好的用于HAdV基因分型。也有越来越来多的测序方法应用于HAdV分型ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[32]。本研究采用基于多重扩增富集的腺病毒全基因组测序方法。通过系统评估腺病毒基因组保守性，筛选高保守且与人源基因组无交叉反应的区域，设计覆盖全基因组的靶向引物组：引物长度18-25bp，GC含量40%-60%，退火温度统一为60℃，并在5’端添加通用标签序列；通过两轮多重PCR扩增生成约800bp重叠片段（重叠100-300bp），结合磁珠纯化和纳米孔测序（如Nanopore），实现低载量临床样本中腺病毒基因组的无缝覆盖与高特异性捕获，最终通过生物信息学分析完成序列组装、分型及变异检测。该方法兼具高灵敏度、广谱兼容性及抗宿主干扰优势，适用于复杂样本的精准分子诊断与病毒进化研究。在测序过程中会遇到六邻体、五邻体、纤维蛋白测序结果不一致的情况，需要确定该标本是有不同HAdV型别混合感染或是重组型别。有美国TroyMcCarthy团队ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[33]提出，在单独的PCR反应中用物种特异性引物对fibergene18进行复核，并对纤维基因扩增子进行测序，结果与HAdV原型株的序列数据进行比对。若显示两种不同的HAdV型别，则认为该标本存在共感染的证据。本次参考该方法，设计不同型别的fiber引物对标本进行扩增，若出现>=2条带的则为混合感染。在本次北京地区单中心部分HAdV阳性人群分型结果显示，HAdV-3型占83.69%，作为感染的主要型别。其次为HAdV-21（7.09%）、HAdV-114型（6.38%）。这与北京地区之前的感染分型具有较大差异。在2015年～2019年北京地区儿童急性呼吸道HAdV感染分型情况中，其中以HAdV-3（56.57%）和HAdV-7（32.00%）型别最多，其次是HAdV-1（6.00%），HAdV-21仅占0.57%ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[4]，2017年～2018年北京地区ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[22]呼吸道感染住院儿童中人腺病毒感染情况中，HAdV-3型占56.06%，其次为HAdV-2型占19.70%。总体来说，在疫情前中，HAdV-3型是北京地区的感染主要型别，但其他非主要感染型别在不停变化，该差异可能与纳入患者年龄以及纳入疾病不同、与北京省不同地区流行差异有关，也可能是发生了优势型别的循环遗传变异。目前缺少北京地区全覆盖持续性的HAdV监测研究。一篇2015～2021年北京地区ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATAHAdV感染持续监测数据与中显示，COVID-19流行期间，HAdV的流行率显著下降，长期占优势的HAdV-B亚型（包括HAdV-3）消失，另一篇北京地区研究也是同样结果。在韩国ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[9]、合肥地区也有同样报道。本次为疫情后监测数据，发现HAdV-3型再现且仍为优势型别。可见NPIs可以有效控制HAdV-B型的流行与传播。HAdV-114型是在2023年发现的、是由HAdV-3型与HAdV-7型重组的新型别。关于HAdV-114的文献很少，同时在文献也并未记录有哪个地区发现该型别的流行，这可能与大多数研究是只基于六邻体基因测序分型，并未进行外壳蛋白全基因测序、甚至是全基因组测序、无法获得该型别准确测序结果有关。确实曾有文献报道过只基于六邻体测序确定HAdV型别的误判情况ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Singh</Author><Year>2012</Year><RecNum>116</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[35]</style></DisplayText><record><rec-number>116</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="aesaweazcsfstnesats5xe2rtppdv2r9r99p"timestamp="1744893123">116</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Singh,G.</author><author>Robinson,C.M.</author><author>Dehghan,S.</author><author>Schmidt,T.</author><author>Seto,D.</author><author>Jones,M.S.</author><author>Dyer,D.W.</author><author>Chodosh,J.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofOphthalmology,HoweLaboratory,MassachusettsEyeandEarInfirmary,HarvardMedicalSchool,Boston,Massachusetts,USA.</auth-address><titles><title>Overrelianceonthehexongene,leadingtomisclassificationofhumanadenoviruses</title><secondary-title>JVirol</secondary-title></titles><periodical><full-title>JVirol</full-title></periodical><pages>4693-5</pages><volume>86</volume><number>8</number><edition>20120201</edition><keywords><keyword>Adenoviruses,Human/*classification/genetics</keyword><keyword>CapsidProteins/*genetics</keyword><keyword>CellLine</keyword><keyword>ComputationalBiology/methods</keyword><keyword>Genome,Viral</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>MolecularSequenceData</keyword><keyword>Phylogeny</keyword><keyword>SequenceAnalysis,DNA</keyword></keywords><dates><year>2012</year><pub-dates><date>Apr</date></pub-dates></dates><isbn>0022-538X(Print) 0022-538x</isbn><accession-num>22301156</accession-num><urls></urls><custom2>PMC3318657</custom2><electronic-resource-num>10.1128/jvi.06969-11</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[35]。随着HAdV重组导致新类型的不断出现，国际AdV组织认为，获取五邻体、六邻体和纤连蛋白三个基因序列是确定HAdV型别的必要条件。全基因组测序是HAdVs正确分类的金标准。HAdV的另一大特征就是具有广泛组织嗜性。在本次研究纳入的呼吸道感染（上呼吸道感染和下呼吸道感染）病例中，部分表现有消化道（腹痛、腹泻）、眼部（结膜炎）的感染症状。在重症案例中，也出现了患者神经系统感染、急性肾功能不全、急性心功能不全、凝血功能障碍等，但由于患者存在高血压等基础疾病且存在细菌混合感染情况，不能确定是否是HAdV导致。但在很多文献中明确报道HAdV可引起结膜炎、肠胃炎、甚至是HAdV性肝炎、心肌炎、神经系统疾病等疾病ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[11,38,39]。HAdV部分型别可主要导致特定组织或器官感染，例如HAdV-A/F/G是急性肠胃炎、急性腹泻的主要感染亚属（尤其是HAdV-41型），HAdV-D亚属是最常见感染结膜炎的亚属。HAdV-B/C亚属可感染多组织或器官，但也有文献发现，不同型别间的感染严重程度是具有差异的，例如HAdV-55和HAdV-7引起的疾病比HAdV-3更严重。本研究分型结果只有2例为HAdV-7型，其中一例诊断为轻型肺炎、另一例为重症肺炎，可见HAdV-7型的感染可能较严重。同时在本次研究中，可发现HAdV-3型导致的淋巴细胞计数值与此次HAdV分型结果的其他型别具有显著差异（P<0.05）。由于本次分型结果HAdV-3型例数远多于其他型别，临床表现不能进行统计学分析。虽然HAdV-21型造成的重症肺炎例数更多，但是由于存在细菌共感染，不能得到该型别造成的疾病更加严重这一结论。在本次数据中，主观性地排除大部分共感染病例，所纳入的HAdV共感染病例仅12例（8.51%）（但也仅能排除初步诊断的六项呼吸道病原，不能排除其他未检测病原感染）。本次HAdV合并感染数据不具有代表性。通过查阅文献，HAdV混合病毒或细菌共感染已成为一个普遍现象。北京地区社区获得性HAdV共感染数据ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>王方明</Author><Year>2023</Year><RecNum>94</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[5]</style></DisplayText><record><rec-number>94</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="aesaweazcsfstnesats5xe2rtppdv2r9r99p"timestamp="1744718565">94</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">王方明</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface