分子生物学文献翻译作业

分子生物学文献翻译作业

文献标题：DNAMethylationandHistoneAcetylationPatternsin

CulturedBovineAdiposeTissue-DerivedStemCells(BADSCs)

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专业：________________12______________________________________

学位：________________________________________________________

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邮箱：______________;______________________________________

时间：2015年12月15日

表观遗传学参及记忆重整过程，可模糊远程恐惊记忆

总结

创伤性事务会产生一些最长久的记忆。焦虑症终生患病率上升，但尚

缺乏有效减轻长期创伤记忆的方法。基于记忆更新机制，唤醒记忆的过程

是减轻近期记忆（即日龄）损伤最有效的治疗方法。我们探讨发觉在小鼠

中，对于近期记忆再现适用的整理更新模式却并不适用于远程（即月龄）

记忆。我们发觉，海马神经可塑性参及再现近期记忆，其中一部分是人组

蛋白脱乙酰化酶（HDAC2）亚硝基化和组蛋白乙酰化参及的，但却并未在

远期记忆中发觉。然而，在记忆重整过程中加入HDAC2靶向抑制剂（HDACi）

时，我们发觉，即使是很久之前的记忆也会发生持续减弱。这种表观遗传

学上的干预后产生的神经再塑相关的基因，伴随着较高的代谢、较多突触

以及结构可塑性。因此，在记忆巩固过程中，应用组蛋白去乙酰化酶抑制

剂可能成为修复远程创伤的方法。

引言

在经验了类如严峻的身体或心理损害的创伤性事务之后，人们会罹患

恐惊和其他焦虑症。探讨表明人们约29%终生患病率，并且由于存在剧烈

的情感基础而使得创伤记忆特别强大，难以治疗。焦虑症的治疗方法中，

最有效的是暴露疗法，即将患者置于平安的拓境中，在这期间重复赐予最

初引起恐惊的刺激，从而使得最初的恐惊刺激变成中性或平安的刺激。胜

利的暴露疗法的基本要求是创伤记忆的激活，在有限的时间内记忆变得易

于修改即记忆再巩固过程。在暴露疗法中，已证明再巩固更新方法是能够

减轻人类和啮齿类动物对可怕的刺激的反应有效的方法，类似的方法已胜

利地用于预防药物依靠和再发。基于在记忆巩固过程中存在一段时间的更

新和学习的假设，人们在做药理学探讨来论证该说法。其中，组蛋白去乙

酰化酶抑制剂(HDACis)可能在永久修复恐惊记忆上有很大的应用前景，

有两个缘由。首先，通过变更染色紧凑性，表观遗传机制对基因表达可能

存在稳定而长久的影响，这是长期记忆所需的特征理；其次，表观遗传机

制可能参及一系列及神经元可塑性有关的核过程，这样，他们的影响便不

仅仅被限制于一个特定的信号传导通路中。

值得留意的是，能够减轻恐惊反应的单纯的行为学或药理学的方法几

乎都集中在近期记忆，即日龄，使得尚不能明确其是否对远程记忆，即月

龄，起作用。创伤性记忆往往不简单被干脆处理，由于远期记忆比近期记

忆更稳定，因此亟待一个明确的关于克服远期对于恐惊记忆的方法。

结果

尽管运用整理更新模式，远程的记忆不能持续衰减

为了测试基于暴露疗法是否能够被用来减轻远期创伤记忆，我们采纳

巴甫洛夫恐惊调整小鼠，这种方法常用于探讨恐惊反应，如创伤后应激障

碍(PTSD)o在恐惊条件反射中，同时赐予非条件刺激(US)——电击,

和条件刺激(CS)——特定的音调或语境下的提示性的、语境性的恐惊

调整。当测定动物被暴露在条件刺激下所产生的恐惊时，产生了类似空调

的反应(CR),冻结。详细来说，我们训练小鼠在线爽性的或情境性的恐

惊调整，在1天和30天之后，我们试图通过不同的恐惊消退模式来减弱

小鼠的类空调反应。全部这些模式利用瞬时不稳定记忆以及出现1和6小

时后的记忆重现稳固窗。

第一个探讨运用针对于线爽性恐惊调整的集中灭亡模式，来减弱条件

性刺激如音调所引起的类空调反应(CR)。我们发觉，对于近期记忆，

这种模式能够即刻持续减弱类空调反应，并在1天后消退。重要的是，

探讨并没有发觉恐惊自发复原(SR)或复原(R1)的迹象，代表着恐惊的

不完全消退。我们对比发觉，在远期记忆中，虽然这种模式能够有效减弱

冻结反应，在灭亡之后，但仍有明显的RI和SR的迹象表明原始记忆的存

在。这一发觉和远期记忆的自发复原和复原是想一样的，并没有再现记忆。

其次个探讨运用针对于情景性的恐惊调整的集中灭亡模式，来减弱条

件性刺激如音调所引起的类空调反应(CR)。通过运用这种模式，近期恐

惊记忆胜利地并永久地衰减，但远期恐惊记忆明显有复原的迹象。在没有

回忆是也得到了相像的结果。此外，探讨发觉越来越多的间断性间隔消退

训练能够促进恐惊记忆消退，因此我们推断这样的间距训练也有助于减弱

远期恐惊记忆。这一模式显著减弱近期恐惊记忆，并没有任何SR的迹象。

然而，当运用到远期记忆时，同样的模式甚至不能短暂性的削减恐惊，当

测试SR时，冻结症状的水平和再唤醒记忆相像。在没有再现记忆的条件

下同样得到类似结果。

同样，这些结果表明，三种不同的行为模式，能够使近期恐惊记忆消

退，但却并不能使远期恐惊记忆消退，尽管考虑到有记忆再现引起的瞬时

不稳定记忆。问题就在于为什么远期恐惊记忆更难以消退。

回忆远期记忆不足以诱导组蛋白乙酰化介导的海马神经元可塑性

依据定义，再现记忆开启再巩固记忆之窗，其允许更新之前的记忆，

因此产生一段新时期的神经可塑性。我们推想，近期记忆和远期记忆的记

忆再现存在不同程度的神经可塑性。在随后的分析中，我们专注于探讨情

景性的恐惊记忆，其形成依靠于海马，它是大脑里及记忆相关的神经元可

塑性特别重要的区域，激活了远期记忆再现。调控神经可塑性的一个基本

机制是组蛋白乙酰化修饰基因的表达。组蛋白乙酰化变更了染色质结构，

更改基因转录，从而正向调整依靠转录的长久神经可塑性。

为了测试相同的记忆在近期和远期记忆中是否存在不同的组蛋白乙酰化

的差异，我们首先采纳免疫组化分析来评估组蛋白乙酰化3赖氨酸残基9

和14(H3K9/14),可促进神经可塑性。我们发觉，1小时后记忆再现,

远期记忆中海马113K9/14乙酰化是及行为学上的自然动物没有什么区分,

但近期记忆明显变小。接下来，我们进行了染色质免疫沉淀(ChIP),确

定了H3K9/14乙酰化存在于CFO启动子区，即参及调控神经元的活动的

早期基因，并且是神经可塑性的关键。及整体组蛋白乙酰化模式相一样，

我们发觉远期记忆比近期记忆对相比CFO启动子去乙酰化作用刺激更大。

因此，CFO启动子区的表达在远期记忆后明显下降，前期的报道中也在蛋

白水平发觉及CFO相关的阳性细胞数量变更。

组蛋白乙酰化水平的增加依靠于神经元的活动，我们在体外培育中发

觉神经通道，其中组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)及染色体cys262和cys274

发生亚硝基化相关。因此我们探讨了远期记忆中并没有发觉组蛋白乙酰化

增加可能是由海马中HDAC2亚硝基化不足引起的。我们发觉，当用生物素

开关调控近期记忆时，30到60分钟后，HDAC2维持亚硝基状态不超过6

小时。因此，在记忆再巩固窗中，HDAC2亚硝基化参及限定时间点的记忆

不稳定期。相反，我们并没有发觉远程记忆中的HDAC2亚硝基增加。及亚

硝基化状态一样，CFO中的启动子HDAC2的结合力下降，再现远期记忆时

染色体上仍有HDAC2o重要的是，引起上述变更时再现记忆是必要的。全

部这些结果表明，和近期记忆相比，远期记忆未能引起海马中HDAC2亚硝

基化和组蛋白乙酰化介导的神经可塑性。

海马中HDAC2亚硝基化是再巩固更新记忆的关键

为了进一步评估神经可塑性中HDAC2亚硝基化作用，在近期记忆再现

和消退训练之前，我们赐予条件性恐惊小鼠左旋硝基精氨酸甲酯

(L-NAME),是一种一氧化氮(NO)抑制剂合酶。缘由可能是其抑制作用

将阻挡亚硝基化对近期记忆的更新作用。同时我们还发觉，动物经记忆消

退训练后赐予卜NAME明显表现出恐惊衰减消退，却再发恐惊。相比之下,

被赐予VEH治疗的没有复发的迹象。L-NAME治疗不影响动物的行为。好玩

的是，探讨发觉赐予L-NAME的动物，1小时后并没有HDAC2亚硝基化，其

表明HDAC2亚硝基化是记忆巩固更新再现的关键。

然后，为了证明HDAC2亚硝基化参及记忆更新，我们进行如下试验步

骤。在远期记忆时赐予小鼠一氧化氮氧化物MOL,其甚至可促进远期记忆

更新，同时促进HDAC2非硝基化作用的过表达，双丙氨酸突变

HDAC2C262/274A,其中MOL阻挡远期记忆更新。为此，在远期记忆再现2

天前，我们向动物海马CA1区注入携带有HDK2WTorHDAC2c262/274A的

短期的单纯疱疹病毒（HSV）载体，以确保最大程度的记忆再现。然后，

记忆再现和消退训练1小时之前，我们向两试验组中赐予MOL或其变体。

探讨发觉，远期记忆再现2小时候，MOL促进携带有HDAC2WT的短期的单

纯疱疹病毒（HSV）载体的小鼠HDAC2亚硝基化，但并未发觉其可促进携

带有HDAC2c262/274A的短期的单纯疱疹病毒（HSV）载体的小鼠HDAC2亚

硝基化亚硝基化，HDAC2周期性出现非亚硝基化形式。当测量恐惊消退时,

MOL治疗携带有HSV-HDAC2WT的动物表现出在记忆消退后明显的恐惊下降,

也未见复发的迹象，表明一氧化氮参及记忆更新。相比之下，MOL治疗携

带有HDAC2c262/274A短期注射的动物明显表现出复发的迹象，尽管该动

物已经验1天后的记忆消退训练并发生即刻记忆消退。重要的是，MOL治

疗并没有影响动物的一般行为。这些结果表明，HDAC2亚硝基参及的远期

记忆再现是有效地巩固更新记忆的关键。

HDAC2靶向抑制剂可以减弱远期恐惊记忆

因为MOL不仅仅作用于HDAC2,我们假设，通过运用HDAC2靶向抑制

剂，或许还可以或许可以解决远期记忆中神经可塑性相关的蛋白乙酰化缺

乏的问题，从而改善记忆更新机制。为此，我们采纳基于苯甲酰胺的HDACi

CI994,是一种选择性抑制剂HDACs,包括HDAC2。全身,按每公斤30毫

克长久（T1/2=3.7小时）腹腔注射高浓度（Cmax=12.3毫米）CI-994,

未影响整体行为。为了在记忆巩固期胜利的启动再更新机制，我们向受到

条件性恐惊刺激的动物注射CI-994或其变体VEH,在再现记忆1小时后,

然后采纳上文提及的记忆消退训练。

对于大群的消退训练后，我们发觉，VEH治疗的动物表现出明显的复

'发,而CI-994并没有该迹象。此外，依靠于HDACi的记忆再现时，恐

惊衰减效应的有所下降，当HDACi未赐予再现刺激是，我们也视察到复发

的迹象。其次，赐予间隔消退训练后，在赐予CI-994的小鼠中，我们明

显视察到CR削减，表明记忆再消退。更重要的是，我们并未视察到SR,

表明持续记忆消退，该效应参及记忆再现。值得留意的是，我们在观HDACi

缓解远期恐惊记忆上收获到同样的效果。

重要的是，HDACi并不会引起恐惊消退。当同时赐予小鼠线爽性以及

情景性的条件性恐惊刺激时，我们仅在赐予情景刺激的小鼠中发觉记忆消

退（利用空间消退训练），其之后仍可视察到线爽性恐惊记忆再现。全部

这些结果表明，在记忆巩固窗同时赐予HDACi和记忆消退训练时，甚至可

以缓解远期记忆。

HDAC抑制剂可促进海马转录后生成物，复原神经元的可塑性

接下来，我们探讨了HDACi的作用机制，假设消退训练结合CI-994可

以增加组蛋白乙酰化介导的神经元可塑性。我们探讨间隔的消退记忆模

式，因为该模式是当赐予VEH和CI-1994不同的治疗时，动物将在记忆消

退后表现不同的恐惊反应。在动物记忆消退讥练1小时后，首先用免疫组

织化学法测定海马组蛋白乙酰化。我们发觉，和赐予VEH治疗后发生组蛋

白乙酰化的动物，在1小时后再现远期记忆时，相比，赐予C1-994治疗

的的动物明显有更高的乙酰化水平。这和在海马中通过HDACi治疗削减

HDAC2活性后的结果是一样的。在前额叶皮质，远期记忆最起先存储在这

里，消退训练结合CIT994治疗后发生组蛋白乙酰化，及VEH治疗后的动

物相比，或者及一般水平相比，在再现远期记忆1小时后，可视察到同样

有所提升，这些可能表明HDACi治疗后皮质区的持续参及。在下文的分析

中，我们仍旧专注于海马，因为该大脑区域在情景记忆再巩固时，在纳入

新信息时是特别重要的。

除了组蛋白乙酰化，及神经可塑性相关的另一重要方面是及突触可塑

性、学习及记忆相关的基因转录。为了探讨这些，我们对同时赐予VEH和

CIT994治疗的动物，在其完全记忆消退训练一小时后，海马区进行RNA

测序。在表达倍数变更截止到L4倍的时候，我们发觉了在CI-1994和VEII

处理的动物之间，存在475个差异表达基因(DEGS),其中有199个基因

在CI-1994处理的动物有较高的表达。在通路和基因分析中，我们留意到

这些在生物学进程的差异及神经元可塑性相关，如学习、记忆、神经冲动

的调整、细胞形态、阳离子转运及突触传递。这些探讨结果表明，C1-1994

治疗结合记忆消退训练，神经元可塑性在基因表达水平得到提高。

此外，我们发觉神经元可塑性相关的几个关节调整因子，在CI-1994

治疗的动物中有明显的上升。这些基因包括早期基因Arc和cFos,其都

参突触可塑性和记忆有关的过程，Adcy6,是一种可以调整神经突起的腺

甘酸环化酶，Npas4,一种调整情景性记忆的转录因子，lgf2,可促进记

忆保存和近期恐惊记忆消退。利用qRT-PCR单独分析仅赐予CI-994和VEH

处理的动物后证明了这些基因表达变更。重要的是，当仅赐予HDACi而没

有记忆消退训时，并没有发觉上述基因变更，考虑到HDACi单独作用并不

会影响行为。

具有高表达的基因在启动子区域中也表现出较高的乙酰化状态。好玩

的是，在启动子上赐予HDAC2时也可视察到组蛋白乙酰化增加。这些调查

结果表明，远期记忆再现后赐予HDACi治疗后能够弥补HDAC2亚硝基化缺

失及其持续性及染色质结合，从而提高了在基因表达水平的组蛋白乙酰化

介导的神经可塑性。

抑制剂可在记忆消退中增加神经可塑性

最终，我们进行了一系列的试验来评估河经可塑性相关基因的表达能

否促进突触可塑性。在1小时完全远期记忆消退后，我们首先利用2-脱

氧葡萄糖汲取标记（3小时）测量了海马葡萄糖，其反映神经元活动性，我

们发觉，CI-994治疗的动物表现出较高的海马3小时2-DG摄取率，相较

于VEH治疗的动物，表明在记忆消退后大脑该区域代谢增加。相比之下，

VEH和CI-1994治疗的动物行3小时2-DG摄取率测量时，在大脑梨状皮质

间并没有什么区分，该大脑区域牵连嗅觉记忆，从而并未及情境性记忆相

联系。

接下来，为了测试这样的代谢活性的增加是否表明神经元可塑性增

加，我们评估了谢弗病电生理长时程增加（LTP）,在同一时刻记录。利

用三节律刺激（33TBS）,我们视察到，表明和VEH相比,CI-994治疗的

动物更能促进LTPo同时，我们在基础突触传递中也并未发觉区分，因为

兴奋性突触后电位(fEPSP)速率由给定的突触前纤维诱发在两组间并无

区分。同样，我们在刺激配对脉冲方面并无发觉明显差异。这些结果表明,

记忆消退训练结合0994增加海马突触可塑性。

最终，我们调查增加突触可塑性是否也可能增加结构可塑性。对于这

一点,我们通过微管关联D蛋白2(MAP2)免疫组化测量树突的数量，树

突分支、高尔基染色树突棘和突触的密度，通过透射电子显微镜和突触免

疫组织化学，即记忆消退后1小时的突触前标记。这些测量反映了神经元

的连接程度及突触强度。我们发觉，在海马的辐射层层面，和VEH治疗的

动物相比，C-994治疗的动物显示MAP2染色树突数量上升。同样，我们

用Sholl方法分析发觉胞体树突分支120和170毫米不等，以及用CI-994

治疗的动物也发觉大数量的脊柱量；值得留意的是，在分析脊柱的结构时,

在HDACi-治疗的动物中，我们发觉到蘑菇状脊柱多于瘦弱状的有柱，其实

脊柱成熟的标记。最终，在CI-994处理后，功能性突触的密度也明显增

加。总之，我们的探讨结果表明，除了表观遗传学上及基因表达方面可增

加神经可塑性，同时，HDACi治疗的动物也同时表明突触数量及结构可塑

性增加。

探讨

据报道，本篇探讨是动物创伤记忆模型中削减远期记忆反应的第一篇

胜利报道。之前的探讨也表明，通过采纳不同的行为模型，尽管再巩固更

新模式中发觉近期恐惊记忆消退，但并未发觉远期恐惊记忆消退。单独行

为干预治愈能削减远期记忆弹性回复，其可能的机制是远期记忆组蛋白乙

酰化介导的海马神经可塑性缺乏。再现近期记忆及组蛋白乙酰化和神经元

可塑性相关的基因表达，比如cFos,有关，其通过刺激HDAC2亚硝基化和

其随后的染色质解离，而再现远期记忆未表现出来。好玩的是，学习伴随

着海马区NO信号增加，而小鼠缺乏神经元一氧化氮合酶(nNOS),表明

其缺乏情境性恐惊记忆。因此，依据尚未确定的机制，及HDAC2相关的海

马NO信号下降可能阻挡阶段性学习，其实远期记忆更新的关键。

虽然我们的分子学分析主要集中在海马，我们不解除在其他脑区，

如杏仁核和皮质区，存在远期记忆衰减。后者的大脑区域值得进一步探讨,

因为它被广泛承认，作为成熟的记忆元素，其显示在皮质区。海马区神经

可塑性远期记忆的缺乏，其表明海马区远期记忆缺乏。然而，再现记忆依

靠于皮质区远程记忆，再现了海马依靠性，并且人为地抑制海马的活动(在

CA1区)，在记忆再现方面，削减了远期记忆再现的实力。目前的探讨扩

展了上述探讨，其表明再现远期恐惊记忆合并记忆消退训练，并不能提高

神经元可塑性水平，其在恐惊记忆更新方面是必需的。相反，它联合运用

HDAC靶向组蛋白去乙酰化酶抑制剂和记忆消退训练，可复原海马区神经可

塑性，并能更新远期创伤记忆。在人类磁共振成像的探讨中显示，持续的

创伤性记忆的受试者显示较低的海马激活再现记忆活性，和那些胜利进行

恐惊记忆消退训练相比。

我们发觉IIDACI处理是触发神经可塑性相关基因上调的关键，伴随着

各启动子区域组蛋白乙酰化增加。这一视察结果表明HDACi可以在表观遗

传学上将促使染色质转录可行，从而增加神经可塑性。基因的表达增加表

明远期记忆消退，同时也发觉远期恐惊记忆消退时cFos、Arc以及Igf2

表达增加，结论性证据表明至少对于近期恐惊记忆恐惊记忆，海马区1GF2

在情境性记忆消退时必需的。然而，及远期记忆相关的基因的作用仍待进

一步探讨。

前期也有探讨在近期记忆消退中运用HDACis。好玩的是，在记忆巩固

窗运用记忆消退模式的探讨中，其本身就足以胜利地减轻恐惊记忆。再联

系我们的试验，即HDACi胜利参及近期记忆巩固更新机制的探讨，并未引

起进一步恐惊下降，这好像表明HDACi能够促进那些单独赐予记忆消退训

练并未起作用的动物发生作用。

参及的记忆消退训练可结构和功能水平增加神经可塑性。例如，我们

视察到海马的代谢活动和LTP得到增加。这及人类的功能磁共振成像探讨

相一样，这表明胜利的记忆消退及海马高活性相关。在结构水平上，我们

发觉记忆消退结合HDAC抑制剂治疗，能够增加突触密度以及树突分支和

树突棘数量。这些结果及最近一份关于脊柱数量的近期记忆消退训练报道

相一样，表明单独的HDACi治疗可促进脊椎支数增加。因此，这里所说的

结构的变更是最有可能是由于记忆消退训练结合HDACi治疗的作用。推而

广之，我们发觉了再塑神经可塑性支持记忆涓退时一段新的学习期。这种

学习被认为是构成恐惊或是原始记忆痕迹，情景记忆及情景平安性结合起

来。有人认为，假如是前者，原始恐惊记忆将长期存在，继而SR、R：或

重建，当CS表现在情境性记忆时。基于这些纯粹的行为结果和发觉，在

再现记忆缺失时赐予HDACi治疗时对行为表现无作用，因此我们的探讨结

果将不仅永久恐惊衰减反应，而且也是最起先被修改的记忆。

EpigeneticPrimingofMemoryUpdatingduringReconsolidationto

AttenuateRemoteFearMemories

SUMMARY

Traumaticeventsgeneratesomeofthemostenduringformsof

memories.Despitetheelevatedlifetimeprevalenceofanxiety

disorders,effectivestrategiestoattenuatelong-termtraumatic

memoriesarescarce.Themostefficacioustreatmentstodiminish

recent(i.e.,day-old)traumatacapitalizeonmemoryupdating

mechanismsduringreconsolidationthatareinitiateduponmemory

recall.Here,weshowthat,inmice,successful

reconsolidation-updatingparadigmsforrecentmemoriesfailto

attenuateremote(i.e.,month-old)ones.Wefindthat,whereas

recentmemoryrecallinducesa1imitedperiodofhippocampal

neuroplasticitymediated,inpart,byS-nitrosylationofHDAC2and

histoneacetylation,suchplasticityisabsentforremotememories.

However,byusinganHDAC2-targetinginhibitor(HDACi)during

reconsolidation,evenremotememoriescanbepersistently

attenuated.Thisinterventionepigeneticallyprimestheexpression

ofneuroplasticityrelatedgenes,whichisaccompaniedbyhigher

metabolic,synaptic,andstructuralplasticity.Thus,applying

HDACisduringmemoryreconsolidationmightconstituteatreatment

optionforremotetraumata.

INTRODUCTION

Fearandotheranxietydisordersdevelopaftertheexperience

ofatraumaticeventsuchasgravephysicalorpsychologicalharm.

Becauseofastrongemotionalunderpinning,traumaticmemoriesare

extraordinarilyrobustanddifficulttotreat,evidencedbyan

estimated1ifetimeprevalenceofcloseto29%(Kessleretal.,2005).

Amongthemostefficacioustreatmentsforanxietydisordersare

exposure-basedtherapies,duringwhichapatientisrepeatedly

confrontedwiththeoriginalfear-elicitingstimulusinasafe

environmentsothattheoncefearfulstimuluscanbenewly

interpretedasneutralorsafe(FoaandKozak,1986).Afundamental

elementforsuccessfulexposure-basedtherapiesisthereactivation

ofthetraumaticmemory,whichinitiatesatime-limitedprocess

calledmemoryreconsolidation,duringwhichamemorybecomes

susceptibletomodification(Misaninetal.,1968;Naderetal.,

2000).Inthecontextofexposure-basedtherapies,reconsolidation

updatingapproacheshaveproveneffectivetoattenuatetheresponse

tofearfulstimuliinhumansandrodentsalike,andsimilar

paradigmshavebeensuccessfullyusedtcpreventdrugcravingand

relapse.Basedontheassumptionofaperiodofupdatingorlearning

duringmemoryreconsolidation,severalotherstudieshavereferred

topharmacologicalmeansinordertoenhancethisprocess.Among

those,histonedeacetylaseinhibitors(HDACis)mightbea

particularlypromisingcandidatetopermanentlymodifyfearful

memoriesfortworeasons.First,bymodifyingchromatincompaction,

epigeneticmechanismscanhavepotentiallystableandlong-lasting

effectsongeneexpression,arequiredfeatureoflong-termmemories;

second,epigeneticmechanismsperhapscantargetavastvarietyof

nuclearprocessesinvolvedinneuronalplasticity(Graffetal.,

2011),suchthattheireffectisnotrestrictedtoaparticular

signalingpathway.

Remarkably,almostalloftheseeitherpurelybehavioralor

pharmacologicallysupportedapproachestoattenuatefearful

responseshaveexclusivelyfocusedonrecent,i.e.,day-old,

memories-leavingitunclearwhethertheywouldalsobeeffective

forremote,i.e.,month-old,memories.Astraumaticmemoriesare

oftentimesnotreaci1yamenabletoimmediatetreatmentsandbecause

remotememoriesaremorestablethanrecentones,thereisaclear

needtoinvestigateoptionstoovercomeremotefearmemories.

RESULTS

DespiteUsingReconsolidation-UpdatingParadigms,RemoteMemories

CannotBePersistentlyAttenuated

Totestwhetherexposure-therapy-basedapproachescanbeused

toattenuateremotetraumaticmemories,weusedPavlovianfear

conditioninginmice,acommonlyemployedmethodtostudyfear

responsesunderlyingtraumaticmemoriessuchasposttraumatic

stressdisorder(PTSD).Infearconditioning,anunconditioned

stimulus(US)-anelectricalfootshock-ispairedwitha

conditionedstimulus(CS)-eitheraspecifictoneorcontextfor

cuedandcontextualfearconditioning,respective!y.Whenthe

animalsarelatertestedfortheirfearmemorybyexposingthemto

theCS,theCSalonewillelicittheconditionedresponse(CR),

freezing.Specifically,wetrainedmiceforeithercuedor

contextualfearconditioning,1dayand30daysafterwhichwe

attemptedtoattenuatetheirCRbydifferentfearextinction

paradigms.Alloftheseparadigmstakeadvantageofatransient

periodofmemorylabi1ity,thereconsolidationwindow,thatoccurs

between1and6hrfollowingthememoryrecall.

ThefirstprotocolaimedatextinguishingtheCRtoatone(the

CS)byemployingamassedextinctionparadigmforcuedfear

conditioning.Wefoundthat,forrecentmemories,thisparadigm

persistentlyattenuatedtheCRimmediatelyand1dayafter

extinctionoImportantly,therewerenosignsofspontaneousrecovery

(SR)orreinstatement(RI)ofthefear,thepresenceofwhichis

indicativeofincompletefearextinction.Forremotememories,in

contrast,wefoundthat,althoughthisparadigmwaseffectivein

decreasingthefreezingresponseaftertheextinctionsession,

thereweresignificantRIandSR,indicatingpersistenceofthe

originalmemory.Thisfindingisconsistentwiththeoccurrenceof

bothRIandSRuponremotememoryextinctionwithoutmemoryrecall.

ThesecondprotocolaimedatattenuatingtheCRtoacontext

(theCS)byamassedextinctionparadigmadoptedforcontextualfear

conditioning.Byusingthisparadigm,recentfearmemoriescould

besuccessfullyandpermanentlyattenuated,butremotefear

memoriesshowedsignificantSR.Similarresultswereobtainedwhen

norecal1waspresented.Furthermore,becauseincreasingthe

intertrialintervalduringfearextinctiontraininghasbeenshown

tofacilitatefearextinctionofrecentmemories,wereasonedthat

suchspacingwouldalsohelpinattenuatingremotememories.This

paradigmsignificantlyattenuatedrecentfearmemories,andthere

werenosignsofSR.However,whenappliedtoremotememories,the

sameparadigmfailedtoeventemporarilyreducefear,andwhen

testedforSR,freezinglevelswerecomparabletothoseduring

memoryrecall.Similarresultswereobtainedintheabsenceof

memoryrecall.

Together,theseresultsindicatethatthreedifferent

behavioralparadigmsthatsuccessfullyextinguishrecentfear

memorieswerenotcapableofdoingsoforremotefearmemories,

despitetakingadvantageofthetransientperiodofmemorylability

inducedbymemoryrecall.Thequestionarisesastowhyremotefear

memoriesaremoredifficulttoextinguish.

RecallingRemoteMemoriesIsNotSalientEnoughtoInduce

HistoneAcetylation-MediatedNeuronalPlasticityinthe

Hippocampus

Bydefinition,thereconsolidationwindowopenedbymemory

recallallowspreviouslyacquiredmemoriestobeupdatedwithnew

informationandistherebythoughttoinitiateanewperiodof

neuronalplasticity.Wehypothesizedthatthesamememoryrecall

mightnotinducethesameextentofneuronalplasticityforremote

asforrecentmemories.Forthesubsequentanalyses,wefocusedon

contextualfearmemories,theformationofwhichdependsonthe

hippocampus,abrainareacrucialformemory-relatedneuronal

plasticitythatisactivateduponremotememoryrecall.One

fundamentalmechanismthatgovernsneuronalplasticityisthe

epigeneticmodificationofgeneexpressionbyacetylationof

histoneproteins.Histoneacetylationpromotesachromatin

structurethatismorepermissiveforgenetranscriptionandthereby

positivelyregulatestranscription-dependentlong-lastingformsof

neuronalplasticity.

Totestwhetherthesamememoryrecallleadstodifferencesin

histoneacetylationbetweenremoteandrecentmemories,wefirst

usedimmunohistochemicalanalysestoassesstheacetylationof

histone3onlysineresidues9and14(1I3K9/14),amodi-fication

associatedwithfacilitatedneuronalplasticity.Wefoundthat,1

hrpostmemoryrecal1,hippocampalH3K9/14acetylationofremote

memorieswasindistinguishablefrombehaviorallynaiveanimalsbut

wassignificantlysmallerthanthatofrecentmemories.Next,we

carriedoutchromatinimmunoprecipitation(ChIP)todeterminethe

abundanceofH3K9/14acetylationatthepromoterregionofcFos,

animmediateearlygeneregulatedbyneuronalactivityandcritical

forneuronalplasticity.Consistentwiththeoverallhistone

acetylationpattern,wefoundthecFospromotertobehypoacetylated

afterremotememoryrecallcomparedtoafterrecentmemoryrecall.

Accordingly,theexpressionofcFoswassignificantlyreducedafter

remotememoryrecall,aneffectthatwasalsoobservedatthe

proteinlevelevidencedbythenumbercFos-positivecells,as

reportedpreviously.

Incrementsinhistoneacetylationaredependentonneuronal

activity,andonepathwayshowntomediatethesechangesincultured

neuronsinvolvesthedissociationofhistonedeacetylase2(HDAC2)

fromthechromatinfollowingitsnitrosylationonCys262andCys274.

Wethereforeinvestigatedwhetherthelackofincreasedhistone

acetylationfollowingremotememoryrecallmightbeduetoalack

ofhippocampalHDAC2nitrosylation.Usingabiotin-switchassay,we

foundthat,forrecentmemories,HDAC2becomesnitrosylatedbetvzeen

30and60minfollowingmemoryrecall,astatethatlastedforno

longerthan6hr.Thus,HDAC2nitrosylationcorrelatedwiththe

1imitedperiodofmemorylabilityduringthereconsolidationwindow.

Incontrast,wedetectednoincreaseinHDAC2nitrosylation

followingremotememoryrecall.Consistentwithitsnitrosylation

status,thebindingofHDAC2tothepromoterofcFoswasreduced

followingrecentmemoryrecall,whereasHDAC2wasstillboundto

thechromatinaftertherecallofremotememories.Importantly,

memoryrecal1wasnecessarytoelicitallofthechangesdescribed

above.Together,theseresultsindicatethat,incontrasttorecent

memories,therecallofremotememoriesfailstoinstallHDAC2

nitrosylationandhistoneacetylation-mediatedneuronalplasticity

inthehippocampus.

S-NitrosylationofHDAC2intheHippocampusIsCriticalforMemory-

UpdatingduringReconsolidation

TofurtherassesstheroleofnitrosylatedHDAC2inmediating

suchneuroplasticity,wetreatedfear-conditionedmicewith

Nu-Nitro-Largininemethylester(L-NAME),aninhibitorofnitric

oxide(NO)synthase,beforetherecallofrecentmemoriesand

extinctiontraining.Wereasonedthat,ifnitrosylationplaysarole

infaci1itatingtheupdateofrecentmemories,itsinhibitionwould

preventit.Wefoundthat,althoughL-NAME-treatedanimalsshowed

significantattenuationoffearafterextinctiontraining,their

fearspontaneouslyrecovered.Incontrast,VEH-treatedanimals

showednoSR.L-NAMEtreatmentdidnotaffecttheoverallbehavior

oftheanimals.Interestingly,L-NAMEtreatmentalsoabolishedthe

recall-inducednitrosylationofHDAC21hraftermemoryrecall,

suggestingthatHDAC2nitrosylationmightbecriticalfor

recall-inducedmemoryupdatingduringreconsolidation.

Then,toproveacausalimplicationofHDAC2nitrosylationin

memoryupdating,wousedthefollowingstrategy.Wetreatedmice

beforeremotememoryrecallwiththenitricoxidedonormolsidomine

(MOL),whichshouldfacilitatememoryupdatingofevenremote

memories,andsimultaneouslyoverexpressedanon-nitrosylateable

formofIIDAC2,thedouble-alaninemutantIIDAC2C262/274A,which

shouldpreventremotememoriesfrombeingupdatedinthepresence

ofMOL.Tothisend,weinjectedshort-termherpessimplexviral

(HSV)vectorscarryingeitherHDAC2WTorHDAC2C262/274Ainto

hippocampalareaCAI.,3daysbeforeremotememoryrecal1toassure

maximalexpressionatthetimeofrecall.Then,1hrpriortorecall

andsubsequentextinctiontraining,weadministeredMOLorits

vehicletobothgroups.Wefoundthat,whereasMOL-administration

increasedIIDAC2nitrosylationinIISV-IIDAC2WT-injectedanimals1hr

afterremotememoryrecal1,HSV-HDAC2C262/274A-]njectedmice

showednoHDAC2nitrosylationdespiteMOLtreatment,indicating

that,inHDAC2C262/274A-injectedanimals,HDAC2ispredominantly

presentinitsnon-nitrosylateableform.Whentestedforfear

extinction,MOL-treatedHSV-HDAC2WT-injectedanimalsshowed

significantfearreductionaftermemoryextinctionandnosignsof

SR,suggestingthattheNOdonorallowedforsuccessfulmemory

updating.Incontrast,MOLtreatedHDAC2C262/274A-injectedanimals

showedsignificantSRdespitesuccessfulmemoryextinction

immediatelyand1dayafterextinctiontraining.Importantly,MOL

treatmentdidnotaffecttheanimals'generalbehavior.Together,

theseresultsindicatethatnitrosylatiorofHDAC2followingmemory

recallisacriticaleventforremotememoriestobecomeamenable

foreffectiveupdatingduringreconsolidation.

ByUsingHDAC2-TargetingHDACInhibitors,RemoteFearMemoriesCan

BeAttenuated

BecauseMOLcannotbetargetedtoHDAC2alone,wehypothesized

that,byusinganIIDAC2-targetingIIDACi,itmightalsobepossible

toovercomethelackofneuroplasticity-relatedhistone

hyperacetylationforremotememoriesand,consequently,toenable

memory-updatingmechanisms.Forthis,weusedthebenzamide-based

HDACiCI-994,aselectiveinhibitorofclassIHDACs,including

HDAC2.Systemic,intraperitonealadministrationof30mgperkg

resultedinhigh(Cmax=12.3niM)andlong-lasting(Tl/2=3.7hr)

levelsofCI-994inthebrainanddidnotaffectoverallbehavior.

Toconfi-dentlytargetthememory-updatingmechanismsduringthe

reconsolidationwindow,weadministeredCI_994oritsvehicle(VEH)

tofear-conditionedanimals1hrpostmemoryrecallandthen

performedtheextinctionparadigmsusedpreviously.

Forthemassedextinctionparadigm,wefoundthat,whereas

VEH-treatodanimalsshowedsignificantSR,CI-994-troatcdanimals

showednosignsthereof.Furthermore,thefear-attenuatingeffect

oftheHDACidepencedonmemoryrecall,aswealsoobservedSRwhen

theHDACiwasgivenwithoutrecall.Next,whenusingthespaced

extinctionparadigm,whichdidnotreduceremotefearmemories,we

observed