2026届高三生物一轮复习课件第42讲《基因工程的基本工具和基本操作程序》

2026年·高考生物·一轮复习第十单元生物技术与工程第42讲基因工程

考点一重组DNA技术的基本工具1.基因工程的概念？基因工程：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。1.操作环境：2.原理：3.操作对象：4.操作水平：5.结果：体外环境基因分子水平基因重组赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍6.意义：考点一重组DNA技术的基本工具【思考】1:不同生物的基因为什么能拼接？为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达?①DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸）；②都遵循碱基互补配对原则；③DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构①基因是控制生物性状的结构与功能单位；②遗传信息的传递都遵循中心法则；③生物界几乎共用一套遗传密码考点一重组DNA技术的基本工具2.重组DNA技术的基本工具有哪些？①限制性内切核酸酶（限制酶）；②DNA连接酶；③载体原核生物数千特定核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端考点一重组DNA技术的基本工具粘性末端平末端①黏性末端：限制酶在它识别序列的

将DNA分子的两条链

切开时，产生的是黏性末端。中轴线两侧分别②平末端：限制酶在它识别序列的

切开时，产生的是平末端中轴线限制酶如何选(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”（3）“双酶切”法优点：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接。（4）“同尾酶”：来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。用限制酶切割时需注意的事项(1)获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶,目的是

。但是使用该法缺点是容易发生

，为了避免上述情况发生，可采取的措施是

。为了产生相同的黏性末端，便于连接分别使用两种限制酶去切割目的基因和载体目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接(2)获取一个目的基因需限制酶切割

次,共产生

个游离的磷酸基团。两(3)磷酸二酯键的形成脱去水分子（产生水），磷酸二酯键的断裂消耗水分子。不同的限制酶处理可以产生相同的黏性末端4将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题：(1)限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割产生的黏性末端分别是_______________和______________。(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒，应选用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。XhoⅠXbaⅠXbaⅠ考点一重组DNA技术的基本工具②DNA连接酶作用：可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。考点一重组DNA技术的基本工具②DNA连接酶类型：类型E.coliDNA连接酶T4

DNA连接酶来源功能缝合

和

；

缝合__________和_______________结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________大肠杆菌T4噬菌体黏性末端黏性末端平末端(效率低)磷酸二酯键平末端（连接平末端效率远低于T4DNA连接酶）项目DNA连接酶DNA聚合酶相同作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键【核心归纳】与DNA相关的几种酶的比较项目DNA连接酶限制酶DNA聚合酶解旋酶作用部位作用对象作用结果DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸DNA水解酶磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键氢键DNA片段DNA单个的脱氧核苷酸DNA将两个DNA片段连接成完整的DNA分子切割双链DNA分子将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端将双链DNA分子局部解旋为单链考点一重组DNA技术的基本工具③载体作用：将外源基因送入受体细胞，并在受体细胞内对目的基因进行大量复制。种类：质粒（最常用）动植物病毒噬菌体质粒——裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。质粒考点一重组DNA技术的基本工具③载体载体需具备的条件：（1）有一个至多个限制酶切割位点；（便于目的基因插入）（2）具有自我复制能力；（使目的基因稳定存在且数量可扩增）（3）具有特殊的标记基因；（便于将含有目的基因的受体细胞筛选出来）（4）对受体细胞无害。（避免受体细胞受到损伤）实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。①细胞内自我复制②或整合到受体DNA同步复制【拓展】标记基因的筛选原理载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：在含有抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞一定是导入目的基因的受体细胞吗？

不一定，因为仅导入载体的和导入插入了目的基因的载体的受体细胞均能在该培养基中存活。【拓展】如何提高筛选的准确性当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。则没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状，导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。举例：目的基因lacZ

基因氨苄青霉素抗性基因

LacZ基因表达产生的β-半乳糖甘酶能够分解X-gal产生蓝色物质，从而使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。请分析下列3种大肠杆菌在含X-gal和青霉素的固体培养基上的存活情况及菌落颜色。无法存活存活；白色存活；蓝色2．质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是()A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点B．①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是bC．质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个D．将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶C考点二基因工程的基本操作程序1.基因工程的基本操作程序包括哪几步？①目的基因的筛选与获取④目的基因的检测与鉴定②基因表达载体的构建（基因工程的核心）③将目的基因导入受体细胞考点二基因工程的基本操作程序2.什么是目的基因？如何筛选合适的目的基因？如何获取目的基因？用于改变受体细胞性状或获取预期表达产物等的基因①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一②利用序列数据库（GenBank）和序列比对工具进行筛选①人工合成目的基因②PCR获取和扩增目的基因③通过构建基因文库来获取目的基因基因组文库从细胞中提取DNA细胞基因组DNA质粒质粒酶切DNA连接酶连接限制酶酶切导入细菌中基因组文库克隆提取酶切的DNA片段cDNA文库逆转录逆转录酶酶切的cDNA片段限制酶酶切质粒质粒酶切连接导入细菌中cDNA文库克隆提取考点二基因工程的基本操作程序3.PCR（聚合酶链式反应）概念？条件？过程？PCR概念：PCR是________________的缩写，它是一项根据_____________的原理，在_____提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对_______________________进行大量复制的技术；聚合酶链式反应DNA半保留复制体外目的基因的核苷酸序列①全称：②原理：③操作环境：④目的：⑤优点：聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因考点二基因工程的基本操作程序3.PCR（聚合酶链式反应）概念？条件？过程？DNA复制所需的基本条件参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物打开DNA双链提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸PCR技术与生物体内DNA复制的比较比较项目生物体内DNA复制PCR技术区别解旋方式场所酶温度条件合成对象解旋酶催化细胞内(主要在细胞核内)解旋酶、普通的DNA聚合酶等细胞内温和条件DNA分子DNA在高温作用下变性解旋细胞外(在PCR扩增仪内)耐高温的的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)需控制温度，在较高温度下进行DNA片段或基因联系①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成②原料：均为四种脱氧核苷酸③酶：均需要DNA聚合酶进行催化④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸注：引物是一小段能与__________的一段碱基序列_________的____________。用于PCR的引物有

种，长度通常为20~30个核苷酸。DNA母链互补配对短单链核酸3’5’DNA母链3’5’DNA母链3’5’引物3’5’引物2图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，都不合理，请分别说明理由。第1组：

；第2组：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效引物的设计原则：1.引物长度适宜。2.G+C含量合理。（40％-60％）3.引物自身/之间没有连续4个碱基互补4.引物5`可修饰，3`不能修饰引物1．土壤盐渍化影响水稻生长发育。将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，过程①PCR扩增OsMYB56需要添加引物，应选用的引物组合为()A．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′B．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′C．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′D．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′A2．(2021·湖北，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是()A．增加模板DNA的量B．延长热变性的时间C．延长延伸的时间D．提高复性的温度D考点二基因工程的基本操作程序3.PCR（聚合酶链式反应）概念？条件？过程？引物DNA模板耐高温的DNA聚合酶4种脱氧核苷酸3’5’3’5’3’5’3’5’①变性

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链②复性当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合③延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链条件3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’缓冲溶液（含Mg2+)激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶考点二基因工程的基本操作程序3.PCR（聚合酶链式反应）概念？条件？过程？第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；第二轮循环的产物第三轮的产物完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物PCR扩增仪拓展应用——PCR相关计算Theirapplication——PCRcorrelationcalculation长链-中长链DNA____个含有引物A的DNA____个含有引物B的DNA____个211第一次扩增引物A引物B拓展应用——PCR相关计算Theirapplication——PCRcorrelationcalculation中长链-短链DNA____个2长链-中长链DNA____个含有引物A的DNA____个含有引物B的DNA____个233第二次扩增拓展应用——PCR相关计算Theirapplication——PCRcorrelationcalculation第三次扩增中长链-短链DNA____个4长链-中长链DNA____个含有引物A的DNA____个含有引物B的DNA____个277短链-短链DNA______个2拓展应用——PCR相关计算Theirapplication——PCRcorrelationcalculation第四次扩增中长链-短链DNA____个6长链-中长链DNA____个含有引物A的DNA____个含有引物B的DNA____个21515短链-短链DNA______个8拓展应用——PCR扩增DNA规律Theirapplication——RuleofPCRamplificationofDNA扩增次数第1次第2次第3次第4次第n次DNA总数212223242n长链-中长链DNA中长链-短链DNA短链-短链DNA含引物A(或B)的DNA20022240226822(n-1)2n-2n137152n-1聚合酶链式反应——过程归纳Polymerasechainreaction——Theprocessofinduction一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：①子代DNA分子数为：___个②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__个③子代含有的目的基因数目：_____个④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个⑤复制过程中共需引物_______个⑥第n次复制需要引物___个2n22n-12n＋1-22n2n-2nPCR扩增DNA规律考点二基因工程的基本操作程序4.基因表达载体的构建——基因工程的核心目的：①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代②使目的基因能够表达和发挥作用基因表达载体的组成：终止子启动子目的基因标记基因复制原点基因表达载体当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。（1）启动子：一段有特殊序列结构的______片段。①本质：②位置：位于基因的____，紧挨_______________。上游③功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。诱导型启动子：（启动子≠起始密码子）DNA转录的起始位点考点二基因工程的基本操作程序4.基因表达载体的构建——基因工程的核心终止子启动子目的基因标记基因复制原点基因表达载体（2）终止子：①本质：一段有特殊序列结构的_______片段。DNA②位置：位于基因的_____。下游③功能：使转录在所需要的地方停下来。（3）标记基因：①作用：便于重组DNA分子的筛选。（4）目的基因：②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。如Bt基因,能控制表达所需要的特殊性状。（5）复制原点：DNA复制的起始位点。注意：目的基因需要插入到

与

之间。（终止子≠终止密码子）启动子终止子考点二基因工程的基本操作程序4.基因表达载体的构建——基因工程的核心重组DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因DNA连接酶基因表达载体构建模式图限制酶启动子限制酶切割位点终止子标记基因复制原点质粒同种限制酶或能产生相同末端的限制酶？考点二基因工程的基本操作程序5.将目的基因植物、动物和微生物细胞的方法?农杆菌转化法、花粉管通道法显微注射法Ca2+处理法1.花粉管通道法：我国科学家独创①用____________将_______________________直接注入_____中；微量注射器含目的基因的DNA溶液子房②在植物受粉后的一定时间内，剪去_____，将___________滴加在____________上，使目的基因借助______________进入_______；DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊受体细胞：受精卵花柱考点二基因工程的基本操作程序5.将目的基因植物、动物和微生物细胞的方法农杆菌转化法的过程：T-DNA目的基因构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞表现出新性状的植物植物细胞将目的基因插入染色体DNA中植物组织培养考点二基因工程的基本操作程序5.将目的基因植物、动物和微生物细胞的方法__________插入Ti质粒的________中形成重组Ti质粒重组Ti质粒转入__________转化植物细胞目的基因插入植物细胞中的________________上目的基因在植物细胞中稳定存在并__________表达目的基因T-DNA农杆菌染色体DNA考点二基因工程的基本操作程序5.将目的基因植物、动物和微生物细胞的方法两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。提醒：农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入考点二基因工程的基本操作程序5.将目的基因植物、动物和微生物细胞的方法显微注射法受精卵注射器固定吸管显微注射仪将含有目的基因的表达裁体提纯→显微注射入动物的受精卵→受精卵发育→获得具有新性状的动物受体细胞：受精卵考点二基因工程的基本操作程序5.将目的基因植物、动物和微生物细胞的方法①.原核生物的作为受体细胞的优点①繁殖快②单细胞③遗传物质少②.导入方法：Ca2+处理法大肠杆菌能吸收周围环境中DNA分子的生理状态Ca2+混合表达载体吸收DNA，完成转化使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态

用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。缓冲液溶于考点二基因工程的基本操作程序5.将目的基因受体细胞受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法受体细胞转化过程以农杆菌转化法为例：将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上↓转入农杆菌中↓导入植物细胞↓整合到受体细胞的DNA上提纯含目的基因的表达载体↓显微注射↓受精卵发育↓具有新性状的个体Ca2＋处理细胞↓细胞处于一种能吸收周围环境DNA分子的状态↓基因表达载体导入农杆菌转化法、花粉管通道法体细胞显微注射技术受精卵Ca2+处理法原核细胞考点二基因工程的基本操作程序6.目的基因的检测与鉴定请同学们阅读教材82页，思考目的基因的检测需要检测什么？检测的方法分别是？①目的基因是否导入受体细胞②目的基因是否转录形成mRNA③目的基因是否翻译成蛋白质④个体水平检测PCR等技术、核酸分子杂交技术PCR等技术、核酸分子杂交技术抗原-抗体杂交技术抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等考点二基因工程的基本操作程序6.目的基因的检测与鉴定1.分子水平的检测①检测目的基因是否导入受体细胞方法1：PCR扩增转基因生物提取DNADNA作为模板是否扩增出目的基因PCR操作电泳操作非转基因棉花转基因抗虫棉阴性对照Marker考点二基因工程的基本操作程序6.目的基因的检测与鉴定方法2：

核酸分子杂交技术碱基互补配对原理：酶切转膜标记的DNA/RNA探针DNA分子杂交（Southern-blot)流程图原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。考点二基因工程的基本操作程序6.目的基因的检测与鉴定提取RNA转膜标记的DNA/RNA探针RNA②检测目的基因是否转录方法1：PCR扩增转基因生物提取RNARNA作为模板PCR操作电泳逆转录cDNA方法2：

核酸分子杂交技术RNA分子杂交(NorthernBlot)流程图考点二基因工程的基本操作程序6.目的基因的检测与鉴定③检测目的基因是否翻译方法：抗原—抗体杂交技术苏云金芽孢杆菌提取Bt抗虫蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交转基因生物放射性检测（杂交带）过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体→是否出现杂交带考点二基因工程的基本操作程序6.目的基因的检测与鉴定2.个体水平的检测检测目的基因是否表现出相应的性状方法：抗虫鉴定、抗病鉴定等棉铃虫棉铃虫（死亡）考点二基因工程的基本操作程序转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常类型检测内容方法分子水平的检测个体生物学水平的鉴定目的基因是否转录出了mRNAPCR等技术、核酸分子杂交技术目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体是否具有相应性状抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等目的基因是否导入受体细胞基因工程的基本操作程序Thebasicoperatingproceduresofgeneticengineering目的基因的筛选和获取-前提利用PCR获取和扩增化学方法人工合成构建基因表达载体-核心目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞-关键花粉管通道法(植物)、农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物)、Ca2+处理法(微生物);目的基因的检测与鉴定-保证分子检测：是否插入、转录、翻译个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。易错辨析A．限制性内切核酸酶可以从某些原核生物中提取B．限制性内切核酸酶也可以识别和剪切RNAC．不同限制性内切核酸酶可能切割出相同的黏性末端D．DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键E．E.coliDNA连接酶只能将有互补黏性末端的两个DNA片段连接起来A．基因工程中所用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等B．基因工程中用的载体大多数为天然质粒C．质粒是常用的载体，有2个游离的磷酸基团D．基因工程中的载体必须具有自我复制能力E．基因工程中的载体具有一个至多个限制酶切割位点，以便目的基因的插入F．载体质粒中必须有抗生素抗性基因，便于重组DNA分子的筛选√×√××√××√√A．基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建√×易错辨析B．构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代C．一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和终止密码子等结构D．基因表达载体的构建至少需要两种工具酶E．基因表达载体的构建过程中会发生碱基互补配对F．诱导物与诱导型启动子结合可激活或抑制目的基因表达G．基因表达载体中启动子具有DNA聚合酶的结合部位，启动复制过程A．农杆菌转化法是利用土壤农杆菌侵染植物细胞，然后将重组Ti质粒整合到受体植物细胞的染色体DNA上B．将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时，可以用钙离子处理细菌C．应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T－DNA片段内D．将目的基因导入动物细胞常用体细胞作受体细胞，采用显微注射技术进行操作E．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译F．某抗虫基因转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状√×√√√××√√××√考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定1.DNA提取和鉴定的原理分别是?DNA提取原理：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精初步分离DNA和蛋白质DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液溶解DNADNA鉴定原理：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定2.材料选择和试剂作用？注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。（1）选材：DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。（2）试剂：①

研磨液②

体积分数为95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④

二苯胺试剂⑤

蒸馏水→提取、溶解DNA

研磨液成分作用SDS使蛋白质变性EDTA抑制DNA酶Tris-HCl缓冲液稳定DNA→析出DNA→溶解DNA→鉴定DNA（要现配现）考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定3.实验步骤称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。研磨洋葱取材、研磨研磨目的：注意：研磨时间不宜太长，防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量；有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶;破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中。考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定3.实验步骤取材、研磨过滤或离心方法一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。方法二：直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。思考：①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？

②低温放置几分钟有什么作用？

不能用滤纸，防止DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。可能含有核蛋白、多糖等杂质

抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定3.实验步骤方法一：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；用冷却的酒精析出DNA取材、研磨过滤或离心分离思考：①搅拌时应轻缓、并沿一个方向？

②酒精预冷的作用？

方法二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定3.实验步骤取材、研磨过滤或离心分离鉴定取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。鉴定DNA鉴定结果对照组实验组溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关。思考讨论：1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？利用蛋白酶分解杂质蛋白，但不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。3.有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？进一步纯化DNA--用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。DNA的粗提取与鉴定考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定1.实验原理

PCR利用了_________________和________________的原理。DNA的热变性原理DNA半保留复制2.材料用具②微量离心管③微量移液器④一次性吸液枪头——自动控温，实现DNA的扩增——实际上是进行PCR反应的场所PCR仪微量离心管推动杆调节旋钮卸枪头按钮体积刻度吸液杆枪头（注意：加不同样品时，需要更换枪头）①PCR仪⑤PCR反应体系的配方10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）1～2U模板DNA

（1pg～1μg）5～10μL总体积50μL注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致

。活性降低甚至失活考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定3方法步骤1.加样：用微量移液器按照PCR反应体系配方，在微量离心管中依次加入各组分。2.离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。——提高反应速率考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定3.反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃，5min——30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，10min使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合。问题1：预变性的目的是什么？问题2：为什么最后1次变性和延伸时间都延长了？Taq酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq酶就脱落了。最后1次变性、延伸时间延长，让这些DNA打开，重新充分延伸。3方法步骤考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定问题1：PCR的产物是什么？问题2：如何鉴定PCR的产物？DNA片段琼脂糖凝胶电泳利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定（1）电泳：DNA分子具有_______________，在一定的________下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷________的电极移动，这个过程就是电泳。可解离的基团pH相反1实验原理一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带

，在电场中DNA便向

泳动。负电荷正极磷酸电离形成的磷酸基团带负电样品点样孔应靠近

极。负考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定（2）鉴定方法：PCR的产物一般通过

来鉴定。琼脂糖来源于红藻的多糖，其主要成分为多聚半乳糖，琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶。琼脂糖凝胶具有网络结构（孔径），孔径大小与琼脂糖凝胶浓度有关，浓度越高，孔径越

，能够通过的核酸分子越

。琼脂糖凝胶电泳在凝胶中DNA分子的迁移速率与_____________、_________________和______等有关凝胶的浓度DNA分子的大小构象小小考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定核酸染色剂常用的核酸染色剂有EB（溴化乙锭）、GoldView等，EB能插入DNA分子中的碱基对之间，导致EB与DNA结合。嵌入核酸碱基间的EB能吸收300nm波长的紫外光，发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定标准参照物（Marker）DNAMarker是

的片段，在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计

。样本DNA的大小已知的DNA分子大小考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳装置2实验器材考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定制备凝胶观察鉴定进行电泳电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。①熔化：②倒模:③凝固:3方法步骤考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定制备凝胶观察鉴定进行电泳将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（marker）。接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待

前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳①加液②加样③电泳指示剂①有颜色，使样品呈现颜色，便于加样。②分子量较小，指示样品迁移的速率及方向。考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定制备凝胶观察鉴定进行电泳取出凝胶置于

下观察和照相。紫外灯一条条带（目的基因片段）1.本实验进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？2.如图所示，该片段大小约为

。750bp0次12次12次30次30次根据条带的

及

来评价扩增的结果3.判断成功扩增出DNA片段的依据是什么？分布粗细程度估计DNA的大小估计DNA的数量思考·讨论4.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？未出现扩增条带可能的原因有：①引物出现质量问题；②变性时温度

，变性时间

，模板DNA链未打开。③Taq酶失活；④Mg2+浓度过

。出现非特异性扩增带可能的原因有：①引物特异性不强或容易聚合成二聚体②复性时的温度过低，引物随机连接到非目的基因片段③DNA聚合酶的浓度过高，即使引物与模板的结合并不完全匹配，酶仍可能催化延伸反应，生成非特异性扩增产物。④Mg2+浓度过高⑤模板DNA出现污染低低短注意：1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行

处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在

储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上

。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须

。4.在进行操作时，一定要戴好

。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。高压灭菌-20℃更换一次性手套4．(2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是()A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来A专题突破10综合PCR的基因工程问题一.利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式——正向连接和反向连接5．(2019·江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是