肺干细胞产品质量控制指南（试行）

肺干细胞产品质量控制指南（试行）一、范围本指南适用于治疗用肺干细胞产品的研发、生产及质量控制，覆盖来源于人成体肺组织、诱导多能干细胞（iPSC）、人胚胎干细胞（ESC）分化来源的自体/异体肺干细胞产品，包括肺基底干细胞、肺泡II型（AT2）干细胞、肺前体干细胞等产品类型，供药品研发机构、生产企业及监管机构参考使用。二、原材料质量控制（一）供体与起始原材料质量控制1.供体基本要求（1）入选标准：成体肺组织供体年龄限定为18~65周岁，无临床确诊的慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化、肺癌等肺部疾病，无活动性恶性肿瘤病史（治愈的皮肤基底细胞癌、宫颈原位癌除外），无遗传性疾病、自身免疫性疾病病史，无长期吸烟史及职业粉尘接触史。（2）病原学筛查：所有供体必须完成血清病原学检测，检测项目包括乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原/核心抗体、丙型肝炎病毒（HCV）抗体、人类免疫缺陷病毒（HIV）1/2型抗体、梅毒螺旋体抗体、人类T淋巴细胞白血病病毒（HTLV）1/2型抗体、巨细胞病毒（CMV）IgM、EB病毒IgM、严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）核酸/抗体，所有检测结果必须为阴性；异体供体额外增加细小病毒B19检测，结果需为阴性。（3）伦理学要求：所有供体取材均需获得伦理委员会审批，自体治疗需获得患者本人知情同意，异体治疗需获得供体或其直系亲属知情同意，供体来源符合国家法律法规要求，严禁使用不符合伦理规范的起始材料。2.起始原材料质控要求（1）成体肺组织：取材后需置于2~8℃无菌生理盐水中密封运输，从取材完成到原代细胞分离的间隔时间不得超过24h，取样检测细胞活率≥90%，超出时间限制或活率不达标的标本予以废弃。（2）iPSC/ESC起始种子：需符合国家人多能干细胞质量标准，提供完整的遗传背景资料、全项检定报告，STR分型明确，无外源因子污染，核型正常，无致病性拷贝数变异。（二）细胞库体系质量控制建立三级细胞库管理体系，即主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB）、终产品冻存库，各细胞库检定要求如下：1.MCB检定：需完成全项检定，包括细胞身份鉴定（STR分型）、细胞活率、纯度、特异性标志物表达、无菌检查、支原体检查、内毒素检测、外源病毒因子检测、染色体核型分析、拷贝数变异（CNV）分析、致瘤性试验（多能干细胞来源产品必须开展）、功能验证，所有项目合格方可投入生产。2.WCB检定：每新建一批WCB需完成除致瘤性试验外的所有MCB检定项目，致瘤性试验可基于MCB检定数据豁免，要求细胞复苏后活率≥85%，STR分型与MCB一致性≥95%，不符合要求的WCB批次予以废弃。3.储存与传代限制：所有细胞库需储存于温度≤-150℃的气相液氮环境中，每批次冻存后随机抽样比例不低于1‰，最少抽样2支进行检定；每年至少开展1次储存温度监测，温度偏离≤-150℃范围超过10℃持续1h以上时，需抽样复检，不合格批次予以销毁。成体肺干细胞从原代分离到终产品制备的累计传代次数不得超过15代，iPSC/ESC分化来源肺干细胞分化后的累计扩增传代次数不得超过10代，超出传代限制的细胞不得用于终产品制备。（三）生产原材料质量控制1.所有生产用试剂、耗材必须符合GMP要求，优先选择无动物源、无血清的重组制备试剂，严禁使用未获得检定合格报告的原材料。2.若生产过程中确需使用血清来源材料，必须使用来源可追溯、符合《中国药典》要求的γ辐照灭活胎牛血清，每批次需检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、布鲁氏菌等外源因子，结果阴性方可使用，终产品中胎牛血清白蛋白残留不得超过50ng/ml。3.生产过程中仅允许在原代培养阶段使用抗生素，终产品收获前72h必须停用抗生素，终产品中青霉素残留≤0.1IU/ml，链霉素残留≤0.1μg/ml，超出限值判定为不合格。三、生产过程质量控制（一）生产环境控制1.肺干细胞生产的细胞分离、收获、分装等开放暴露操作必须在GMPA级洁净区开展，背景环境为B级洁净区，环境监测要求为浮游菌≤1cfu/m³，沉降菌≤1cfu/4h·φ90mm，符合GMP生产要求。2.不同供体、不同批次的细胞生产必须采用空间分隔或分时生产模式，同一洁净区不得同时开展两个不同批次细胞产品的生产，每次生产完成后必须进行清场验证，残留细胞核酸检测阴性后方可开展下一批次生产，防止交叉污染。（二）关键工艺过程控制1.原代分离过程：成体肺组织采用0.1%~0.2%的GMP级胶原酶IV消化，消化条件为37℃恒温振荡消化15~30min，消化后采用100μm无菌细胞筛过滤去除未消化组织块，300g室温离心5min收集细胞。2.常规培养过程：培养条件恒定控制为37℃、5%CO₂、95%饱和湿度，每48h更换一次培养基，每代细胞接种密度控制在1×10^4~5×10^4个/cm²，传代时细胞活率低于70%的批次直接废弃，所有培养过程必须完整记录细胞活率、密度、形态变化，留存影像记录。3.定向分化过程（多能干细胞来源产品适用）：分化过程分阶段开展质控，①定型内胚层阶段：SOX17+FOXA2+双阳性率≥85%方可进入下一阶段；②肺前体阶段：NKX2.1+SOX9+双阳性率≥70%方可进入下一阶段；③成熟肺干细胞阶段：特异性标志物表达符合规定要求，任一阶段不合格的细胞予以废弃。4.收获与分装：收获消化时控制胰蛋白酶消化时间不超过10min，收获后按原代分离参数离心，收获后立即检测活率，活率≥80%方可进行分装冻存；分装过程每30min抽样检测一次细胞计数，与标示量误差超过±10%的需重新分装。四、终产品质量控制终产品质量控制分为一般属性检验、细胞身份与纯度检验、安全性检验、有效性检验四个部分，所有项目合格方可放行：（一）一般属性检验1.外观：冻存终产品应为无色或淡黄色均匀细胞混悬液，无血凝块、异物、异常浑浊沉淀，冻存管无裂缝、无渗漏。2.装量：标示装量误差范围限定为±5%，超出范围判定不合格。3.pH值：控制范围为7.2~7.4，符合人体生理范围要求。4.渗透压：控制范围为280~320mOsm/kg，符合人体等渗要求。5.细胞活率：复苏后细胞活率要求为自体产品≥80%，异体产品≥85%。6.细胞计数：细胞密度与标示量误差范围限定为±10%，超出范围判定不合格。（二）细胞身份与纯度检验1.细胞身份鉴定：采用STR分型进行身份验证，终产品STR分型与原代供体细胞/MCB分型一致性≥95%，排除错配、交叉污染。2.特异性标志物检测：采用流式细胞术检测肺干细胞特异性标志物，不同类型产品要求如下：（1）肺基底干细胞：KRT5+P63+双阳性率≥90%；（2）AT2源性肺干细胞：SFTPC+ABCA3+双阳性率≥90%；（3）肺间充质源性肺前体细胞：CD90+CD73+CD105+阳性率≥95%，CD45+CD34+HLA-DR+阳性率≤2%；任一类型产品标志物阳性率不符合要求判定为不合格。3.杂细胞与残留细胞检测：（1）非靶标杂细胞：上皮源性肺干细胞中Vimentin阳性成纤维细胞残留率≤10%，CD45+造血细胞残留率≤2%；（2）多能干细胞分化来源产品：必须检测残留未分化多能干细胞，要求残留率<0.001%，采用流式细胞术或定量PCR检测，超出限值判定为不合格。4.遗传稳定性检测：采用G显带染色体核型分析，要求染色体数目、结构正常，畸变率≤2%；采用CNV芯片检测，无致病性拷贝数变异，存在致病性变异的批次判定为不合格。（三）安全性检验1.微生物安全性：无菌检查（细菌、真菌）符合《中国药典》三部要求，结果为阴性；支原体检查结果为阴性；内毒素含量<0.5EU/ml，符合要求。2.外源病毒因子检测：采用细胞培养盲传三代法观察，无细胞病变；PCR检测HBV、HCV、HIV、HTLV、CMV、EBV、BVDV等常见病原体，结果均为阴性。3.致瘤性/成瘤性检测：（1）iPSC/ESC来源产品、异体规模化生产产品必须开展体内致瘤性试验，将1×10^7个细胞接种于免疫缺陷小鼠腋下，观察16周，无肿瘤形成判定为合格；（2）自体原代扩增产品可豁免体内致瘤性试验，但需开展体外软琼脂克隆形成试验，克隆形成率≤0.1%判定为合格。4.外源成分残留：牛源血清白蛋白残留≤50ng/ml，消化酶等工艺添加蛋白残留≤1μg/ml，抗生素残留符合前述要求，所有残留超出限值判定为不合格。5.免疫原性检测（异体产品适用）：HLA分型完整，若为低免疫原性基因编辑产品，HLA-I/II类分子敲除效率符合设计要求，CD45+免疫细胞残留≤2%，符合要求。（四）有效性（功能）检验1.干性验证：采用克隆形成试验，单个细胞接种后克隆形成率≥10%，提示干细胞自我更新能力合格。2.分化潜能验证：不同类型肺干细胞要求为：（1）AT2源性肺干细胞：定向分化后I型肺泡细胞标志物PDPN+AQP5+双阳性率≥60%，提示分化潜能合格；（2）肺基底干细胞：定向分化后纤毛细胞（ACETUBULIN+）、杯状细胞（MUC5AC+）阳性率总和≥50%，提示分化潜能合格；3.抗损伤功能验证：肺干细胞在100μMH₂O₂处理24h后，细胞存活率≥60%，提示抗氧化损伤能力符合肺部损伤微环境要求。4.体内功能验证（进入临床试验的产品必须完成）：采用博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠模型，输注1×10^6个肺干细胞后4周，肺纤维化面积较模型对照组减少≥30%，用力肺活量（FVC）较模型对照组改善≥20%，提示体内治疗功能合格。五、储存、运输与放行控制1.储存：终产品必须储存于温度≤-150℃的气相液氮罐中，禁止在-80℃冰箱长期储存，-80℃储存不得超过6个月；储存过程每7天记录一次温度，温度持续高于-150℃超过1h，该批次产品需抽样复检，不合格予以销毁。2.运输：运输过程必须采用液氮罐或高性能干冰保温容器，保证全程温度≤-130℃，运输容器必须配备连续温度记录装置，全程可追溯温度变化；任何时间段温度高于-130℃累计超过1h，该批次产品报废。3.放行：每一批次产品必须具备完整的生产记录、原材料检定报告、中间体质控报告、终产品全项检定报告，所有项目合格后由质量受权人签字放行；异体产品需提供完整的供体溯源记录，自体产品需提供供体（患者）对应身份验证记录，无完整记录的产品不得放行。六、稳定性研究1.实时稳定性研究：将终产品储存于规定条件下，分别于1年、3年、5年、10年取样检测，目前暂定气相液氮储存条件下有效期为5年，后续稳定性数据支持可延长有效期；若检测发现细胞活率下降超过10%或任何一项质控不合格，需提前终止有效期。2.加速稳定性研究：将终产品置于-80℃储存1个月，每2周取样检测，复苏后活率≥70%判定为稳定性合格，用于验证产品的耐应激能力。3.复苏后稳定性研究：终产品复苏后置于2~8℃储存，分别于4h、12h、24h、48h检测，要求24h内细胞活率下降≤10%，无菌保持阴性，因此规定