酪蛋白含量实验测定方法

酪蛋白含量实验测定方法一、凯氏定氮法凯氏定氮法是测定蛋白质含量的经典方法，通过测定样品中氮的含量，再乘以蛋白质换算系数来计算酪蛋白含量，适用于各类乳制品及含酪蛋白食品的测定。（一）实验原理蛋白质是含氮的有机化合物，将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨游离，用硼酸溶液吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即可计算出样品中蛋白质的含量。由于酪蛋白的含氮量约为15.67%，因此换算系数通常为6.38（1/0.1567）。（二）试剂与材料浓硫酸：分析纯，密度为1.84g/mL。硫酸铜：分析纯，作为催化剂，加快消化速度。硫酸钾：分析纯，提高溶液的沸点，使消化更彻底。氢氧化钠溶液：400g/L，用于蒸馏时碱化消化液，使氨游离出来。硼酸溶液：20g/L，作为吸收液，吸收蒸馏出的氨。盐酸标准溶液：0.1mol/L，用于滴定吸收氨后的硼酸溶液，需用基准物质进行标定。混合指示剂：由1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合而成，也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液混合。样品：液态奶、奶粉、奶酪等含酪蛋白的样品，需根据样品状态进行预处理。（三）仪器与设备凯氏定氮仪：包括消化装置、蒸馏装置和吸收滴定装置，也可使用半自动或全自动凯氏定氮仪。分析天平：感量为0.0001g，用于准确称量样品。消化管：500mL，耐高温，可在电炉上加热消化。电炉：可调温，用于加热消化样品。容量瓶：100mL、250mL等，用于定容消化液或稀释样品。移液管：10mL、20mL等，用于准确移取溶液。（四）实验步骤样品预处理液态样品：如牛奶，充分摇匀后，准确吸取10.00-25.00mL（约相当于0.2-0.5g蛋白质）于干燥的500mL消化管中。固体样品：如奶粉、奶酪，准确称取0.2-2.0g样品（精确至0.0001g）于干燥的500mL消化管中，注意避免样品沾附在消化管壁上。半固体样品：如酸奶，准确称取2.0-5.0g样品于干燥的500mL消化管中，加入少量水（约5mL）使样品溶解。消化在消化管中加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾和20mL浓硫酸，轻轻摇匀后，将消化管放在消化装置上，连接好抽气装置，以防消化过程中产生的有害气体溢出。先以小火加热，待内容物全部炭化，泡沫停止产生后，加大火力，保持消化液微沸，至溶液呈蓝绿色透明状后，再继续加热0.5-1小时。消化过程中，要注意控制加热温度，避免消化液暴沸溅出，同时要及时转动消化管，使沾附在管壁上的样品残渣进入消化液中。消化结束后，关闭电炉，让消化管自然冷却至室温。蒸馏将消化后的冷却溶液全部转移至100mL容量瓶中，用少量水多次冲洗消化管，将冲洗液一并倒入容量瓶中，加水至刻度，摇匀，得到消化稀释液。安装好凯氏定氮仪的蒸馏装置，在接收瓶中加入50mL硼酸溶液及2-3滴混合指示剂，将接收瓶置于蒸馏装置的冷凝管下端，使冷凝管下端插入硼酸溶液液面以下，防止氨逸出。准确移取10.00-20.00mL消化稀释液于蒸馏瓶中，加入10mL氢氧化钠溶液，迅速连接好蒸馏装置，打开蒸汽开关进行蒸馏。蒸馏至接收瓶中溶液体积约为150mL时，将冷凝管下端提离液面，继续蒸馏1分钟，用少量水冲洗冷凝管下端外部，洗液并入接收瓶中，关闭蒸汽开关，停止蒸馏。滴定用盐酸标准溶液滴定接收瓶中的溶液，至溶液由蓝绿色变为灰红色（或紫红色）即为终点。记录盐酸标准溶液的消耗量。同时做空白实验，除不加样品外，其余操作均与样品测定相同，记录空白实验中盐酸标准溶液的消耗量。（五）结果计算样品中酪蛋白的含量按下式计算：[X=\frac{(V_1-V_0)\timesc\times0.014\timesF}{m\times\frac{V_2}{V_3}}\times100]式中：(X)：样品中酪蛋白的含量，单位为克每百克（g/100g）或克每百毫升（g/100mL）；(V_1)：样品消耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升（mL）；(V_0)：空白实验消耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升（mL）；(c)：盐酸标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；(0.014)：1mL1mol/L盐酸标准溶液相当于氮的质量，单位为克（g）；(F)：换算系数，酪蛋白为6.38；(m)：样品的质量或体积，单位为克（g）或毫升（mL）；(V_2)：移取消化稀释液的体积，单位为毫升（mL）；(V_3)：消化液定容后的总体积，单位为毫升（mL）。（六）注意事项消化过程中，要注意防止暴沸，可在消化管中加入几粒玻璃珠，同时控制加热速度，避免样品溅出。蒸馏时，氢氧化钠溶液要足量，确保消化液被充分碱化，使氨完全游离出来。滴定过程中，要注意控制滴定速度，临近终点时要缓慢滴加，避免滴定过量。实验所用的试剂和仪器要保持清洁，避免引入杂质影响测定结果。对于含脂肪较高的样品，如奶酪，消化前可先加入少量乙醚，使脂肪溶解，再进行消化，以防止脂肪包裹蛋白质，导致消化不完全。二、紫外分光光度法紫外分光光度法是利用酪蛋白在紫外光区的特征吸收峰来测定其含量，具有操作简便、快速、样品用量少等优点，适用于批量样品的快速测定。（一）实验原理酪蛋白分子中含有酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸残基，这些残基在280nm波长处有特征吸收峰，且在一定浓度范围内，酪蛋白溶液的吸光度与浓度符合朗伯-比尔定律，因此可以通过测定样品溶液在280nm处的吸光度，与标准曲线进行比较，计算出样品中酪蛋白的含量。（二）试剂与材料酪蛋白标准品：纯度≥90%，用于配制标准溶液。磷酸盐缓冲液：0.05mol/L，pH=7.0，用于溶解酪蛋白标准品和样品，保持溶液的稳定性。样品：液态奶、奶粉、酪蛋白制品等，需根据样品状态进行预处理，去除干扰物质。（三）仪器与设备紫外可见分光光度计：配备1cm石英比色皿，用于测定溶液的吸光度。分析天平：感量为0.0001g，用于准确称量标准品和样品。容量瓶：100mL、500mL等，用于定容标准溶液和样品溶液。移液管：1mL、5mL、10mL等，用于准确移取溶液。离心机：转速≥4000r/min，用于分离样品中的不溶性杂质。（四）实验步骤标准曲线的绘制标准储备液的配制：准确称取0.1000g酪蛋白标准品于100mL烧杯中，加入适量磷酸盐缓冲液，在40-50℃水浴中加热搅拌至完全溶解，冷却至室温后，转移至100mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀，得到浓度为1.0mg/mL的标准储备液。标准工作液的配制：分别准确移取0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL标准储备液于100mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀，得到浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的标准工作液。吸光度的测定：以磷酸盐缓冲液为空白对照，使用1cm石英比色皿，在280nm波长处分别测定各标准工作液的吸光度。标准曲线的绘制：以标准工作液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数，要求相关系数r≥0.999。样品处理液态样品：如牛奶，准确吸取5.00mL样品于50mL容量瓶中，加入磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，得到样品稀释液。若样品中含有脂肪等不溶性杂质，需将样品稀释液在4000r/min条件下离心10分钟，取上清液进行测定。固体样品：如奶粉，准确称取0.5000g样品于50mL烧杯中，加入适量磷酸盐缓冲液，在40-50℃水浴中加热搅拌至完全溶解，冷却至室温后，转移至100mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀，得到样品溶液。若样品中含有不溶性杂质，需进行离心处理，取上清液测定。样品测定以磷酸盐缓冲液为空白对照，使用1cm石英比色皿，在280nm波长处测定样品溶液的吸光度。若样品溶液的吸光度超出标准曲线的线性范围，需对样品溶液进行适当稀释后再测定。根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得对应的酪蛋白浓度，或通过回归方程计算得出。（五）结果计算样品中酪蛋白的含量按下式计算：[X=\frac{c\timesV\timesn}{m\times1000}\times100]式中：(X)：样品中酪蛋白的含量，单位为克每百克（g/100g）或克每百毫升（g/100mL）；(c)：从标准曲线上查得或通过回归方程计算得出的样品溶液中酪蛋白的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；(V)：样品溶液定容后的体积，单位为毫升（mL）；(n)：样品的稀释倍数；(m)：样品的质量或体积，单位为克（g）或毫升（mL）。（六）注意事项配制标准溶液和样品溶液时，要确保酪蛋白完全溶解，避免因溶解不完全导致测定结果偏低。实验过程中，要避免溶液中含有气泡，以免影响吸光度的测定。对于含有较多干扰物质的样品，如含有色素、维生素等的食品，需进行适当的前处理，如透析、层析等，去除干扰物质后再进行测定。紫外分光光度计要定期进行校准，确保仪器的准确性。实验所用的玻璃器皿要保持清洁，避免污染影响测定结果。三、双缩脲法双缩脲法是利用蛋白质在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色络合物，通过测定络合物的吸光度来计算蛋白质含量，操作简便、快速，适用于各类乳制品及含酪蛋白食品的测定。（一）实验原理在碱性条件下，蛋白质分子中的肽键（-CO-NH-）与铜离子结合生成紫红色络合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，在540nm波长处有最大吸收峰，且在一定浓度范围内符合朗伯-比尔定律。由于酪蛋白是蛋白质的一种，因此可以用双缩脲法测定其含量，通过与标准曲线比较，计算出样品中酪蛋白的含量。（二）试剂与材料双缩脲试剂：称取1.50g硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）和6.0g酒石酸钾钠（KNaC₄H₄O₆·4H₂O），用500mL水溶解，在搅拌下加入300mL10%氢氧化钠溶液，用水稀释至1000mL，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存，若出现黑色沉淀则需重新配制。酪蛋白标准品：纯度≥90%，用于配制标准溶液。氢氧化钠溶液：100g/L，用于调节溶液的pH值。样品：液态奶、奶粉、奶酪等含酪蛋白的样品，需根据样品状态进行预处理。（三）仪器与设备可见分光光度计：配备1cm玻璃比色皿，用于测定溶液的吸光度。分析天平：感量为0.0001g，用于准确称量标准品和样品。容量瓶：100mL、500mL等，用于定容标准溶液和样品溶液。移液管：1mL、5mL、10mL等，用于准确移取溶液。恒温水浴锅：用于控制反应温度，使反应充分进行。（四）实验步骤标准曲线的绘制标准储备液的配制：准确称取0.1000g酪蛋白标准品于100mL烧杯中，加入适量10%氢氧化钠溶液，在40-50℃水浴中加热搅拌至完全溶解，冷却至室温后，转移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，得到浓度为1.0mg/mL的标准储备液。标准工作液的配制：分别准确移取0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL标准储备液于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，得到浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的标准工作液。显色反应：分别准确移取5.0mL标准工作液于10mL具塞试管中，加入5.0mL双缩脲试剂，摇匀，在37℃恒温水浴中保温30分钟，取出冷却至室温。吸光度的测定：以水为空白对照，使用1cm玻璃比色皿，在540nm波长处分别测定各显色后标准工作液的吸光度。标准曲线的绘制：以标准工作液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数，要求相关系数r≥0.995。样品处理液态样品：如牛奶，准确吸取1.00-5.00mL样品于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，得到样品稀释液。若样品中含有脂肪等不溶性杂质，需将样品稀释液在4000r/min条件下离心10分钟，取上清液进行测定。固体样品：如奶粉，准确称取0.1000-0.5000g样品于50mL烧杯中，加入适量10%氢氧化钠溶液，在40-50℃水浴中加热搅拌至完全溶解，冷却至室温后，转移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，得到样品溶液。若样品中含有不溶性杂质，需进行离心处理，取上清液测定。样品测定准确移取5.0mL样品溶液（或稀释后的样品溶液）于10mL具塞试管中，加入5.0mL双缩脲试剂，摇匀，在37℃恒温水浴中保温30分钟，取出冷却至室温。以水为空白对照，使用1cm玻璃比色皿，在540nm波长处测定样品溶液的吸光度。若样品溶液的吸光度超出标准曲线的线性范围，需对样品溶液进行适当稀释后再测定。根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得对应的酪蛋白浓度，或通过回归方程计算得出。（五）结果计算样品中酪蛋白的含量按下式计算：[X=\frac{c\timesV\timesn}{m\times1000}\times100]式中：(X)：样品中酪蛋白的含量，单位为克每百克（g/100g）或克每百毫升（g/100mL）；(c)：从标准曲线上查得或通过回归方程计算得出的样品溶液中酪蛋白的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；(V)：样品溶液定容后的体积，单位为毫升（mL）；(n)：样品的稀释倍数；(m)：样品的质量或体积，单位为克（g）或毫升（mL）。（六）注意事项双缩脲试剂中氢氧化钠的浓度要准确，否则会影响反应的进行和络合物的形成。显色反应的温度和时间要严格控制，确保反应充分进行，吸光度稳定。样品处理过程中，要避免蛋白质变性，以免影响测定结果。对于含有较多非蛋白质氮的样品，如添加了尿素的乳制品，双缩脲法的测定结果可能会偏高，需结合其他方法进行校正。实验所用的玻璃器皿要保持清洁，避免污染影响测定结果。四、福林-酚法福林-酚法又称Lowry法，是在双缩脲法的基础上发展而来的一种灵敏度更高的蛋白质测定方法，适用于低浓度酪蛋白样品的测定。（一）实验原理福林-酚法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜离子结合生成络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（福林-酚试剂）还原，生成蓝色的钼蓝和钨蓝混合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，在660nm波长处有最大吸收峰，且在一定浓度范围内符合朗伯-比尔定律。由于酪蛋白分子中含有较多的酪氨酸和色氨酸残基，因此福林-酚法对酪蛋白的测定灵敏度较高。（二）试剂与材料福林-酚试剂A：溶液A：称取10g碳酸钠（Na₂CO₃），2g氢氧化钠（NaOH）和0.25g酒石酸钾钠（KNaC₄H₄O₆·4H₂O），溶于500mL水中。溶液B：称取0.5g硫酸铜（CuSO₄·5H₂O），溶于100mL水中。使用前将溶液A与溶液B按50:1的比例混合，即为福林-酚试剂A，现用现配。福林-酚试剂B：市售的福林-酚试剂，使用前需用标准氢氧化钠溶液标定，使其浓度相当于1mol/L盐酸溶液，也可自行配制：称取100g钨酸钠（Na₂WO₄·2H₂O）和25g钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O），溶于700mL水中，加入50mL85%磷酸和100mL浓硫酸，充分混合后，在回流装置中加热10小时，冷却后加入150g硫酸锂（Li₂SO₄）、50mL水和数滴溴水，煮沸除去过量的溴，冷却后定容至1000mL，过滤，贮存于棕色瓶中。使用时用氢氧化钠溶液调节pH值至1.0左右。酪蛋白标准品：纯度≥90%，用于配制标准溶液。样品：液态奶、奶粉、酪蛋白肽等低浓度含酪蛋白的样品，需根据样品状态进行预处理。（三）仪器与设备可见分光光度计：配备1cm玻璃比色皿，用于测定溶液的吸光度。分析天平：感量为0.0001g，用于准确称量标准品和样品。容量瓶：100mL、500mL等，用于定容标准溶液和样品溶液。移液管：0.5mL、1mL、2mL等，用于准确移取溶液。恒温水浴锅：用于控制反应温度，使反应充分进行。（四）实验步骤标准曲线的绘制标准储备液的配制：准确称取0.0500g酪蛋白标准品于100mL烧杯中，加入适量水，在40-50℃水浴中加热搅拌至完全溶解，冷却至室温后，转移至500mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，得到浓度为100μg/mL的标准储备液。标准工作液的配制：分别准确移取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL标准储备液于10mL具塞试管中，用水补至1.0mL，得到浓度分别为20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL的标准工作液。显色反应：向各标准工作液中加入5.0mL福林-酚试剂A，摇匀，在室温下放置10分钟，然后加入0.5mL福林-酚试剂B，立即摇匀，在37℃恒温水浴中保温30分钟，取出冷却至室温。吸光度的测定：以水为空白对照，使用1cm玻璃比色皿，在660nm波长处分别测定各显色后标准工作液的吸光度。标准曲线的绘制：以标准工作液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数，要求相关系数r≥0.995。样品处理液态样品：如低浓度酪蛋白肽溶液，准确吸取0.1-1.0mL样品于10mL具塞试管中，用水补至1.0mL，得到样品溶液。若样品中含有干扰物质，需进行适当的前处理，如透析、超滤等。固体样品：如酪蛋白肽粉，准确称取0.0100-0.0500g样品于100mL烧杯中，加入适量水，搅拌溶解后，转移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，得到样品溶液。若样品中含有不溶性杂质，需进行离心处理，取上清液测定。样品测定向样品溶液中加入5.0mL福林-酚试剂A，摇匀，在室温下放置10分钟，然后加入0.5mL福林-酚试剂B，立即摇匀，在37℃恒温水浴中保温30分钟，取出冷却至室温。以水为空白对照，使用1cm玻璃比色皿，在660nm波长处测定样品溶液的吸光度。若样品溶液的吸光度超出标准曲线的线性范围，需对样品溶液进行适当稀释后再测定。根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得对应的酪蛋白浓度，或通过回归方程计算得出。（五）结果计算样品中酪蛋白的含量按下式计算：[X=\frac{c\timesV\timesn}{m\times1000}\times100]式中：(X)：样品中酪蛋白的含量，单位为克每百克（g/100g）或克每百毫升（g/100mL）；(c)：从标准曲线上查得或通过回归方程计算得出的样品溶液中酪蛋白的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；(V)：样品溶液定容后的体积，单位为毫升（mL）；(n)：样品的稀释倍数；(m)：样品的质量或体积，单位为克（g）或毫升（mL）。（六）注意事项福林-酚试剂B对pH值非常敏感，加入时要迅速摇匀，避免局部pH值过高或过低影响反应的进行。显色反应的温度和时间要严格控制，确保反应充分进行，吸光度稳定。样品中若含有酚类、柠檬酸、硫酸铵等物质，会对测定结果产生干扰，需进行适当的前处理去除干扰物质。福林-酚试剂A需现用现配，放置时间过长会影响测定结果。实验所用的玻璃器皿要保持清洁，避免污染影响测定结果。五、电泳法电泳法是利用酪蛋白分子在电场中的迁移速度不同，将其与其他蛋白质分离，然后通过染色、扫描等方法测定酪蛋白的含量，适用于酪蛋白的定性和定量分析，以及不同种类酪蛋白的区分。（一）实验原理酪蛋白是一种两性电解质，在不同pH值的溶液中会带不同电荷，当溶液的pH值低于其等电点时，酪蛋白带正电荷，向阴极移动；当溶液的pH值高于其等电点时，酪蛋白带负电荷，向阳极移动。在一定的电场强度下，酪蛋白分子的迁移速度与其分子大小、形状和所带电荷数有关。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），可以将酪蛋白与其他蛋白质分离，然后用考马斯亮蓝等染料染色，根据染色条带的深浅或面积，与标准品进行比较，计算出样品中酪蛋白的含量。（二）试剂与材料丙烯酰胺：分析纯，用于配制凝胶。甲叉双丙烯酰胺：分析纯，作为交联剂，与丙烯酰胺共同形成凝胶。Tris-甘氨酸缓冲液：pH=8.3，用于电泳时的电极缓冲液。SDS：十二烷基硫酸钠，分析纯，用于变性蛋白质，使蛋白质分子带负电荷，且与分子大小成正比。考马斯亮蓝R-250：用于染色蛋白质条带。脱色液：由甲醇、冰乙酸和水按4:1:5的比例混合而成，用于去除凝胶中多余的染料。酪蛋白标准品：纯度≥90%，用于配制标准溶液。样品：液态奶、奶粉、奶酪等含酪蛋白的样品，需根据样品状态进行预处理。（三）仪器与设备垂直板电泳仪：包括电泳槽、电源、凝胶灌制模具等，用于进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶成像系统：用于拍摄电泳后的凝胶图像，并进行条带分析。分析天平：感量为0.0001g，用于准确称量标准品和样品。离心机：转速≥10000r/min，用于分离样品中的不溶性杂质。移液器：0.1-10mL，用于准确移取溶液。（四）实验步骤凝胶的制备分离胶的制备：根据需要配制一定浓度的分离胶，如10%的分离胶。称取适量的丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris-HCl缓冲液（pH=8.8）、SDS、去离子水，混合均匀后，加入适量的过硫酸铵（AP）和四甲基乙二胺（TEMED），迅速摇匀，注入凝胶灌制模具中，在凝胶表面覆盖一层水，防止氧气进入影响聚合。待凝胶聚合后，倒掉表面的水，用滤纸吸干。浓缩胶的制备：配制5%的浓缩胶，称取适量的丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris-HCl缓冲液（pH=6.8）、SDS、去离子水，混合均匀后，加入适量的AP和TEMED，迅速摇匀，注入分离胶上方，插入梳子，待凝胶聚合后，拔出梳子，形成加样孔。标准曲线的绘制标准储备液的配制：准确称取0.1000g酪蛋白标准品于100mL烧杯中，加入适量的样品缓冲液（含SDS、β-巯基乙醇等），在沸水浴中加热5分钟，使蛋白质变性，冷却至室温后，转移至100mL容量瓶中，用样品缓冲液定容至刻度，摇匀，得到浓度为1.0mg/mL的标准储备液。标准工作液的配制：分别准确移取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL标准储备液于离心管中，用样品缓冲液补至1.0mL，得到浓度分别为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的标准工作液。电泳分离：将标准工作液分别加入凝胶的加样孔中，同时加入分子量标准品，接通电源，先以80V电压进行浓缩胶电泳，待样品进入分离胶后，将电压调整为120V，继续电泳至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部，关闭电源。染色与脱色：将凝胶取出，放入考马斯亮蓝R-250染色液中，染色1-2小时，然后用脱色液脱色，直至背景清晰，蛋白质条带明显。标准曲线的绘制：使用凝胶成像系统拍摄凝胶图像，分析各标准