内毒素知识介绍

内毒素学问介绍

(2010-01-1610:00:17)

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抗体

细胞因子

蛋白

酶

试剂盒

信号转导

凋亡

生化

试剂

干细胞

生物

ips

细菌内毒素，英文称作Enolotoxin,是G菌细胞壁个层上的特有结构,

内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性

热原质，作用于体温调整中枢引起发热。内毒素的主耍化学成分为脂多糖

中的类脂A

细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提「出来，它是在探讨发

热物质过程所引成的，1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进

行化学免疫学方面的探讨，到1940年时候，Morgan运用志贺氏痢疾菌阐

明白细菌内毒素是由多糖脂质与蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950

年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以与遗传学等的进步发展，细菌

内毒素的探讨工作，尤其是其化学结构组成与各种生物活性间的关系也更

加明确起来。

细菌英文叫Bacteria：为原核生物中的一类单细胞微生物由二

分裂法繁殖。若按革兰氏染色法可将细菌分为G•菌和C菌两大类。这两类

细菌细胞壁的结构和化学组成存在很大差异。唯有肽聚糖为其共同成分,

但其含量的多少和肽链的性质有所不同，见下表：

细胞壁结构革蓝氏阳性菌革蓝氏阴性菌

厚度厚，15—50薄，10—15

多，占胞壁干重

肽聚糖含量少，占胞壁干重10%左右

50—80%

脂类含量少，约1一4%多,约11—22%

磷壁酸有无

外膜无有

脂蛋白无有

脂多糖无有

关于细菌细胞壁结构，尤其G7G菌不同之处见下图所示：

由以上结构模式图可以发觉，G菌与G菌有不同之处，其中

对于C菌来说：

细胞壁较薄，厚约l()—15nm,结构也较困难。肽聚糖含量低，仅占细胞干

生10%左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链干脆联结，缺乏五

肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖

的三层聚合物。

(1)脂蛋白(lipoprotein)由类脂和蛋白质构成，联结在外膜与肽

聚糖层之间，类脂一端经非共价键联结到外膜的磷脂上，另一端由共价键

联结到肽聚糖肽链中的二氧基庚二酸残基上，使外膜和肽聚糖层构成

一个整体。

(2)外膜(outermembrane)是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构，

位于肽聚糖的外侧，其结构类似细胞膜，为液态的磷脂双层，其中镶嵌一

些特异蛋白质，穿透外膜的内外双层，呈液态镶嵌体。外膜中间有微小孔

道，容许水溶性的小分子通过，以进行细胞内外的物质运输和交换。除此

之外，外膜还能防止胰蛋白酶和溶菌酶等进入，起到爱护性屏障作用。(3)

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)由多糖0抗原、核心多糖和类脂

A(lipidA)组成(图1-8),位于最外层。多糖。抗原向外，由若干个

低聚糖的重复单位组成的多糖链，即革兰氏阴性菌的菌体抗原(0抗原)，

有特异性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸

(2-keto-3-deoxyoctonicacid,KDO)等组成，全部革兰氏阴性

细菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄胺二糖为单位，通过焦磷酸酯键

组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素

的毒性成分。

细菌内毒素即：很多病原性细菌所产生的毒素。

一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素(Exotoxin)；它是

一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外

毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、

金黄色葡萄球菌以与少数革兰氏阴性菌。加一类为内毒素(Endotoxin)。

是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。细菌在生活状态时不释放

出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素

的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。

细菌外毒素与内毒素性质的比较

外毒素(Exotoxin)内毒素(Exotoxin)

几乎无发热性很强的发热性

细菌外壁层上的特有结构

细菌的代谢产物

细胞裂开后游离出来

毒性作用强毒性作用比较弱

很强的免疫原性，制成抗毒

抗原性弱

素能中和抗原毒素

核酸多糖的高分子聚合物，

单纯蛋白质，易被分解破坏

不易被分解破坏

对热不稳定，无透析性耐热性，无透析性

福尔马林可使其转化为类

福尔马林不能使毒性消逝

毒素

对肿瘤细胞几乎无影响破坏肿瘤细胞

白喉毒素，肉毒毒素，破伤

大肠菌，霍乱绿脓菌，沙门

风毒素厌氧菌毒素,溶血性

氏菌，赤痢菌等

链球菌毒素等

(1)外毒素(oxotoxin)有些细菌在其生命活动过程中产生毒素

能释放到四周环境中，称为外毒素。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性

菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以与少数革兰

氏阴性菌。如痢疾杆菌、霍乱弧菌等。细菌外毒素有以下特点：

①毒性强，如纯化肉毒杆菌外毒素结晶Img可杀死2,000万只小白鼠，对

人的最小致死量约为104mg,破伤风毒素对小白鼠的致死量为10'Wg,白

喉毒素对豚鼠的致死量为10②对机体组织有选择性的毒性，如白喉

杆菌外毒素主要抑制蛋白质合成，特殊是影响肽链延长，引发心肌炎、肾

上腺出血与神经麻痹等；破伤风外毒素主要毒害脊髓前角运动神经细胞,

引起所属肌肉的痉挛强直。

③具有抗原性，外毒素的化学成分为蛋白质，有抗原性，即以外毒素刺激

机体可产生大量的抗毒素，抗毒素能中和外毒素使其无毒。外毒素用甲醛

处理后，脱毒变成类毒素，但仍保持抗原性。

（2）内毒素（cxotoxin）是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，细菌在

生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表

现其毒性。内毒素的主耍化学成分是脂多糖中的类脂A成分。

内毒素的致病作用无特异性，即各种革兰氏阴性菌对人类引起

基本相同的反应。少量内毒素可引起机体发热反应；大量内毒素进入血液,

可使血管透性变更，局部出血，颗粒性白细胞增多或削减和体重下降，严

惩毒时能导致内毒素性休克。内毒素毒性比外毒素小得多。

内毒素是外源性致热原，它可能激活中性粒细胞等，使之释放

出一种内源性热原质，作用于体温调整中枢引起发热。

细菌内毒素化学结构与化学组份

到目前为止，我们知道细菌内毒素作为G一菌细胞壁外表层结

构的一部分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）主要是由多糖0抗原，

核心多糖和类脂A（L：pidA）三部分组成。见图所示：

类脂A位于最多层。多糖抗原向外由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖

链，具有特异性，核心多糖分为内核心与外核心，外核心由数种已糖，包

括葡萄糖，半乳糖，乙酰氨基葡萄糖等组成。内核心含有庚糖与特殊的

KD0（3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖）。KD0以不耐酸的酮糖键与类脂A的氨

基葡萄糖连接。全部5菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄糖胺二糖为

单位。通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物。具有致热作用。是

革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。

细菌内毒素生物活性

类脂A作为内毒素生物活性的主要部分。也是近年来探讨报道最多的。由

氨基葡萄糖，磷酸，10T8碳的长链脂肪酸组成，它与可溶性的0-特异性

链与核心分别后。即有难溶于水的特性。游离后的类脂A。可自身凝合成

高分子的复合体，其分子量大小不等。同时它也含有疏水性的中心与亲水

性的边沿。是一种双相分子，乂是酸碱两性分子，因此类脂A的独特结构

使细菌内毒素具有多种的生物活性。

细菌内毒素不同水平上的生物活性

A.机体水平B.细胞水平

发热性巨噬细胞的活性

致死毒性化(TNF,IL-1.IL-6

体重削减产生）

Shwartzman反应阻挡巨噬细胞游

骨髓反应（bone走

narrowreaction)淋巴球

白血球削减olony

(lEUcopenia)formation

血小板削减stimulation

(thrombocytopenia)前列腺素的产生

非特异的感染防卫抗肿瘤坏死作用

(nonspecificC.分子水平

resitance)补体活化性

耐受性Hageman因子活

(tolerant)化性

辅药作用纤维蛋白溶酶原

(adjuvant)活性化

寒颤（血压低下，赏细胞溶解物

血管内凝固）凝集

细菌内毒素的耐热性

我们知道细菌内毒素除了具有各种生物活性外，还具很强的耐热性，一般

的高压灭菌不能使其灭活,需250℃30分钟以上的干热灭菌才能使其灭活，

目前我国药典热原检查法和细菌内毒素检查法中关于玻璃用具的灭菌处

理为180C2小时或250C30分钟以上，而日本药局方第十三改正为250c

1小时以上。其它各国药典也大都如此，据国外文献报导，当对细菌内毒

素的稀水溶液，在不同温度下保温处理后进行检测，发觉其内毒素活性在

200℃1小时时还能检测出来。而只有当加热到250℃1小时才能完全灭活，

国内细菌内毒素标准品的耐热状况虽然未能考察，但可以认为对细菌内毒

素检查法中玻璃用具等的除菌最好采纳250℃1小时以上的干烤处理。

细菌内毒素的除去方法

由于细菌内毒素具有很强的耐热性，因此对于它的去除采纳一

般的灭菌方法是无法达到的，尤其是制药行业注射剂中内毒素的除去，对

于临床用药的平安性意义重大，因此对于药品中内毒素去除可以运用过滤

与高压灭菌方法，而对于一般水溶液，则一般采纳薄膜过滤后高压法，对

于试验中所用器具可运用干热或射线赐予灭活，其它也可运用酸、碱破坏

的方法。对于细菌内毒素检查法中所用试验用具的外源性内毒素除去方法,

最好采纳250℃2hr以上的干热灭菌方法。

各种外界因素对细菌内毒素活性的影响

细菌内毒素的生物活性随外界因素的影响变更很大。目前已经

知道。一些金属离子、超声波以与温度等都会对细菌内毒素的生物活性产

生很大影响，据国外文献报导，铁离子、铝离子和保离子等会引起细菌内

毒素活性的降低。因此在试验过程中最好运用玻璃用具，以必免这些因素,

另外温度的凹凸对细菌内毒素水溶液活性影响很大，依据国内外文献的报

道：内毒素水溶液活性随着环境温度的上升而降低，因此对于内毒素水溶

液肯定要在低温处保存，而且对已经稀释好的内毒素水溶液，要尽可能的

在2小时内用完。以免活性降低。

细菌内毒素致病机理

(1)致热性内毒素可使人体和动物致热，人体对内毒素致热原敏感。

在正常状况下，人体内内毒素的正常阈值保持在之间，一旦人体免疫力下

降或遭遇某种致病菌侵袭时;细菌便在机体内繁殖崩解，释放出大量的内

毒素，当体内内毒素的浓度高于这个阈值时，即可启动内外源致热原引起

机体发热。

(2)内毒素对糖代谢的影响与其机理内毒素干脆或间接损害肝脏，

引起糖代谢紊乱与酶学、蛋白代谢的变更。①致病机理：脂多糖能刺激肾

上腺素的分泌和释放，使磷酸环化酶活性增加，加速糖分解，使血糖浓度

表现为短暂性上升。②低血糖症的主要机理：脂多糖进入机体数小时后，

始作用于肝细胞，引起肝细胞的损伤，使糖元异生的关键酶活性降低，抑

制糖原的异生和分解，激活丙酮酸激酶，加速葡萄糖的分解氧化，并产生

大量的热量，在临床上表现为发烧症或持续低血糖症。内毒素致肝脏枯否

氏细胞功能受到抑制，进而影响对内毒素的消退与对胰岛素的分解代谢。

（3）内毒素对血液循环系统的影响与机理：内毒素可引起白细胞和

血小板削减，激活凝血、纤溶系统，产生出血倾向，可导致充满性血管内

凝血（DIC）的发生。DIC严峻时，可导致严峻的休克症状。①内毒素（脂

多糖）对中性粒细胞的作用与机理：内毒素〔脂多糖）能引起人体血液中

中性粒细胞的增多，这是人体对内毒素反应最敏感的指标之一，亚致热量

即可引起中性粒细胞的削减，并伴之以粘连性增加，数小时后，中性粒细

胞明显增多。②脂多糖对血小板的影响：对试验动物注射足量的脂多糖后,

均能导致动物血液中血小板明显削减。③脂多糖对淋巴细胞的作用：脂多

糖作用于B淋巴细胞，可增加B淋巴细胞DNA的合成。脂多糖能提高人体

体液免疫功能，革兰氏阴性菌感染后引发的机体发热是人体自我防卫功能

的表现，是主动的。④脂多糖对单核细胞和巨噬细胞的作用：增加吞噬和

巨噬细胞的杀菌实力。同时，脂多糖作用于巨噬细胞和单核细胞后，能产

生多种中介物质，参加外源性凝血过程，脂多糖能刺激单核细胞和巨噬细

胞产生集落刺激因子（GSF）o⑤对红细胞和血清铁的影响：脂多糖能抑

制红细胞的生成，脂多糖干脆作用于骨髓造血干细胞，抑制骨髓的造血功

能。内毒素可导致血清铁浓度的降低，内毒素血症的另一病症就是缺铁性

贫血。⑥内毒素可经C3旁路或经典途径激活补体系统，最终导致血压下

降和血液动力学的变更，出现局部或全身性shwartzman(炎症症状)，并

伴有稍微的发热症状。

细菌内毒素作用机理

(1-3)B-D-glucan概念、结构与活性

1)(1~3)B-D-glucan概念：(1-3)8HD-glucan在自然界的分布很

广，主要存在于担子菌、真菌、地衣类、高等植物以与酵母、藻类的菌体

成分中，平均分子量在6800左右。分子结构具用多样性。另外，某些运

用人造纤维制作的人工肾透析模上也含有类似物质。但它并不引起家兔的

升温过程。关于(1-3)B-D-glucan旁反应系是否可以单独形成凝固蛋白，

或是与ET反应系的共同作用形成凝固蛋白，目前国外学者尚有肯定分歧。

(1-3)B-D-glucan疝热极为稳定，高压121、1小时不以使其全部灭活。

需250℃2小时干热灭菌处理才能彻底去除。另外强酸、强碱以与一些酶

类也能使其灭活。H前在日本，尤其是在药局方的各种解说书中，无热原

的概念即灭菌后的用具除了无ET外，还要求无(1-3)B-D-glucan。这一

点要引起足够重视。

2)(1-3)B-D—glucan结构：由上可知：(1-3)B-D-glucan在

自然界的分布很广，可以说明它同细菌内毒素一样，无处不在，无处不有。

有关它的化学结构如下所示:

除此

之外，它还有很多其它高i级的结构，如(1-4)B-D-glucan、

(1-6)B-D-glucan结构等。3)(1-3)B-D-glucan生物活性：

(1-3)B-D-glucan与细菌内毒素一样，除了结构的多样化外，它们也有很

多共同特性。如对热的稳定性，不易去除，不同菌株所产生的结构差异性

等。作为(1-3)B-D-glucan的生物活性主要表现在以下几个方面：

(1-3)B-D-glucan类的生物活性：1,刺激机体的(MQ)巨噬细胞产生各种

细胞分裂素Cytikines(TNFIL-1IL-6等)；2.激活补体其次条经

路；3.抗肿瘤作用；4.抗炎症作用；5.抗放射线作用；6.激活G因子旁路

使蛰血细胞裂解液(LAL(TAL)试剂)产生凝集反应

细菌内毒素标准品

作为内毒素的探讨和运用者对于高纯度的内毒素标准品的渴

望是非常迫切的，我们知道，细菌内毒素的活性随着菌株来源不同，调制

方法与分散状态等不同差异很大，因此作为一个好的标准内毒素必需有满

意以下条件：

1)菌株来源要有很好的稳定性。

2)能够很好地确定其化学分析值。

3)强的发热性与赏试验活性间要有很好的相关性。

4)反应曲线为直线型。

5)易溶、在冻冷状态下能长时间稳定贮存。

6)高纯度并能保证供应。

WHO在1950年起先就提出了热原标准品的问题，在1959年

Shigelladysenteriae内毒素笫一次作为WHOstandard被采纳由

于这个标准品稳定性等问题，目前已不在运用，之后，随着内毒素的探讨，

尤其是赏试验法的探讨与应用，各种新的内毒素标准品已被制备出来，目

送各国在内毒素标准品菌株的选择上，一般均运用发热活性比较强的大肠

杆菌，除添加附形剂稍有不同处，其对家兔的性几乎都是一样的，各种内

毒素标准品，除了发热性好外，还要求具有赏试验活性，化学分析值安定

性、均一等。目前WHO最新的细菌内毒素标准品为EC—6,以

下为三国标准内毒素化学分析值，供参考：

ReferenceendotoxJapanE.coliUKTUSAE.coliollGermanyS.abortusequ

inE3i

Hesose24.9%23.56%66.2%

Heptose9.32.385.0

Heptosamine7.916.44.2

KDO4.53.886.8

FattyAcid20.835.010.7

C12:02.62.2

C14:01.91.8

C16:0trace1.1

3-oH-cl4:015.95.6

Phosphate8.854.275.0

N1.82.584-amino-LarabinoseO

.3

Protein<1EthanoloamineO.2

Nucleicid<12.58Nai.8

细菌内毒素工作标准品：主要用于日常检验工作和试验探讨，

尤其在内毒素检查法中，用于阳性比照和样品的阳性比照，其力价要比参

考内毒素标准品耍低的多。由于制备工艺不同其对常试剂的反应性也存在

很大差异，因此在试验中，为了保证明验有效和精确建立稳定统一的CSE

是非常必要的。

另外，目前的内毒素标准品一般都是针对凝胶法而言的，虽说国外在定量

法运用上已渐渐增多，但真正的定量法专用内毒素标准品还没有，因此定

量法中运用的内毒素标准品的探讨是非常重要的。

细菌内毒素量值

关于细菌内毒素的量值在80年头几乎都是以重量单位来表示

它很不科学，相同重量的内毒素，由于菌株来源不同，提取方法各异而且

所加附形剂不同，囚此其生物活性相差很大。如EC-2和EC-5,其重量换

算单位分别：5EU/ng和10EU/ng,因此随着人们对内毒素生物活性的

不断提高，以效价单位表示内毒素的量值是非常合理的。

目前，世界各国药典所收载的细菌内毒素标准品均是以效价单

位来表示。由于各国所用菌种来源不同，加入的赋形剂不同，其效价也不

尽相同，如美国药典内毒素参考标准品（EC-6）的效价为1OOOOEU/瓶，JP

为16000EU/瓶，BP川H（）为14000EU/瓶，而中国药典内毒素参考标准品

（Lot;981）的效价为9000EU/Amp。因此，建立统一的细菌标准品是目前

各国所面临的一大问题。

内毒素血症

内毒素血症是由于血中细菌或病灶内细菌释放出大量内毒素至血液,

或偷入大量内毒素污染的液体而引起。内毒素血症分为内源性和外源性两

大类。（1）内毒素血症发生的缘由。在严峻创伤、感染等应激

状态下可出现：全身网状内皮系统功能障碍，免疫机能下降，肠道汲

取的内毒素过多而超过机体清除实力；胃肠道粘膜缺血、坏死、屏障

破坏，大量内毒素释放入血；肠道汲取的内毒素因肝功能障碍由侧枝

循环干脆入体循环；某些组织、器官的感染引起外源性内毒素入血。

（2）内毒素血症的临床症状内毒素血症临床症状主要确定于宿主对

内毒素的反抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变更，出血倾向，心力

衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神经系统症状，以与休克等。内毒素可引

起组胺、5-羟色胺、前列腺素、激肽等的释放，导致微循环扩张，静脉回

流血量削减，血压下降，组织灌流不足，缺氧与酸中毒等。（3）内毒素

血症的后果内毒素血症可以出现在多系统的多种疾病中，通常导致致

死性感染性休克、多器官功能衰竭、充满性血管内凝血等，病死率极高。

内毒素血症可引起一系列病理生理变更：①发热反应：内毒素干脆作用于

下丘脑体温调整中枢，或作用于白细胞使之糕放内原性致热原；②促使血

管活性物质如缓激肽、组胺、5-羟色胺、血管惊慌素等释放，使血压下降，

导致微循环障碍；③引起白细胞和血小板削减，激活凝血、纤溶系统，产

生出血倾向；充满性血管内凝血；④经C3旁路或经典途径激活补体；⑤

干脆或间接损害肝脏，引起糖代谢紊乱与酶学、蛋白代谢的变更；⑥激活

白三烯、前列腺素、巨噬细胞、单核细胞与内皮细胞活性。（4）各类疾

病内毒素血症的发生率急性肝炎37-6饿；爆发性肝炎58-100%；丙肝

61.54%胆石症伴急性梗阻性化脓性感染85%；烧伤85%；败血症70%：多

器官功能衰竭100%；急性胰腺炎90%：皮肤软组织感染70-81.1%；腹腔感

染72-84%；尿路感染70-80%（肾炎）、癌症70%；肺炎100%；上感100%。

（5）内毒素血症的治疗内毒素血症的治疗原则多主见：①削减内毒

素的产生和汲取；②改善内毒素引起的微循环障碍。肠源性内毒素血症

很多非革兰氏阴性菌感染的重症病人与处于应激状态的患者，绝大部分出

现内毒素血症，血浆中内毒素血症主要来源于肠道内毒素的汲取，因此肠

源性内毒素血症是病人死亡的主要缘由。肠源性内毒素血症的发病机制与

如下几方面有关：（1）肠道内毒素生成和摄取增多（肠道微生物移位）

机体免疫功能受损和肠粘膜免疫屏障的破坏，内毒素移位，进入血循环;

肠粘膜屏障功能障碍，粘膜缺血、萎缩、破损、脱落均可造成内毒素移位，

发生肠源性内毒素血症；肠道微生态环境破坏，广谱抗生素的长期应用削

减了对抗生素敏感的厌氧菌的数量，导致革兰氏阴性菌大量繁殖，突破粘

膜屏障而移位进入血循环。(2)肝脏对内毒素的清除功能减退，大量内

毒素在肝脏未经解毒溢入体循环。(3)门体系统功能障碍，出现门体分

流，来自肠道的内毒素绕过肝脏，未经灭活解毒，涌入体循环，形成内毒

素血症。(4)淋