生物药物的分类基因重组多肽蛋白类治疗剂基因药物

1.生物药物的分类：（1）基因重组多肽、蛋白类治疗剂（2）基因药物（3）天然生物药物

（4）合成与部分合成的药物。

DNA重组药物和基因药物的区别：DNA重组药物即应用重组DNA技术（包括基因工程技

术和蛋白质工程技术）制造的重组多肽、蛋白质类药物和疫苗、单克隆抗体与细胞因子等；

基因药物即以基因物质（DNA或RNA）为基础，研究而成的基因治疗剂、基因疫苗、反义

药物和核能等。

3.DNA重组药物主要有哪几类，举例说明。

DNA重组药物有：

（1）细胞因子干扰素类：干扰素、B-干扰素、y-干扰素

（2）细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子:白介素-2（IL-2）和突变型白介素・2（Scrl25-lL-2）

肿瘤坏死因子类主要有TNF-a和TNF-a受体。

（3）造血系统生长因子类：粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子

（M-CSF）、巨噬细胞粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）、促红细胞生成素（EPO）、促血小

板生成素（TPO）干细胞生长因子（SCF）

（4）生长因子类：胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因

子（PDFD）、转化生长因子（TGF-a和TGF-B）、神经生长因子（NGF）及各种神经营

养因子。

（5）重组多肽与蛋白质类激素：重组人胰岛素（rhlnsulin）,重组人生长激素（rhGH）、促

卵胞激素（FSH）、促黄体生成素（LH）和绒毛膜促性腺激素（HCG）、重组人白蛋白和重

组人血红蛋白

（6）心血管病治疗剂与酶制剂：VQI因子、水蛭素、tpA.rtpA.尿激酶、链激酶、葡激酶、天

冬酰胺酶、超氧化歧化附、葡萄糖脑首能及DNsae等

（7）重组疫苗与单抗制品：重组乙肝表面抗原疫苗、乙肝基因疫苗、AIDS疫苗、流感疫苗、

痢疾疫苗和肿瘤疫苗。

2简述生物活性物质分离纯化的主要原理：

根据混合物中的不同组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个

物相中，或者将混合物置于某一相中，外加一定作用力，使多组分分配于不同区域，从而达

到分离的目的。主要纯化原理有：（1）根据分子的形状和大小不同进行分离（2）根据分子

电离性质（带电性）的差异进行分离（3）根据分子极性大小及溶解度的不同进行分离。

（4）根据物质吸附性质的不同进行分离（5）根据配体特意性进行分离

3.保存菌种、菌种退化、检查菌种退化

常用的菌种保存方法：斜面低温保藏法、液体石蜡封藏法、冷冻干燥保藏法、液氮超低温保

藏法、甘油冷冻保藏法、其他如沙土管保藏法。

菌种的退化意味着随时间的推移菌种的一个或多个特性逐步减退或消失，最终导致营养细

胞的死亡。一般把菌株的生活力、产抱子能力的衰退和特殊产物产量的下降统称为退化。

检查菌种退化：（I）单位容积中发酵液的活性物质含量（2）琼脂平皿上的单菌落形态，（3）

不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特征，如形成兔子的能力；（4）发酵过程的pH变

动情况（5）发酵液的气味、色泽

4重组DNA技术基本原理，如何获取目的基因

基因工程是通过体外重组将甲生物体的基因转入乙受体生物体内进行表达的生物技术。获取

目的基因的方法有：（1）鸟枪克隆法（2）人工合成目的基因1.酶促方法2.化学合成法

5常见的基因载体有，如何构建基因重组体

在体外将含目的基因的DNA片段和具有自我复制功能、并带有选择标记的载体分子进行能

切连接，获的重组DNA分子。常见的基因载体有：链霉菌质粒、芽抱杆菌载体、质粒、噬

菌体（phage）、黏粒（cosmid）、病毒载体等。

（1）6DNA重组体有主要有哪几种表达系统？各有什么特点？

（2）基因工程包括转录、翻译及翻译后加工等过程。根据宿主细胞种类不同，分为原核

基因工程和真核基因工程。原核基因工程以原核细胞作为表达宿主，如大肠杆菌、

枯草杆菌等；而真核基因工程则以真核细胞为表达宿主，如酵母、昆虫细胞、哺乳

动物细胞、植物细胞等。

大肠杆菌表达系统：遗传背景比较清楚，使用安全、技术操作简便，繁殖力强（20〜30min即

可繁殖一代），便于大规模培养，成本较低，表达水平较高（可达总蛋白的5%~6%），下游

技术成熟、易于控制。目前使用最广泛、最成功的表达系统。

酵母表达系统：①是真核表达体系，灼表达蛋白可进行折叠和翻译后的修饰与糖基化：②表

达量高，如明胶表达量达14。8g/L;③培养成本低；④适用高密度发酵；⑤杂蛋白少，产物易

纯化。

哺乳动物表达系统：中国仓鼠卵巢细胞（CHO）和猴肾细胞（COS）优点是能识别和剪切

外源基因的内含子并加工成为成熟的mRNA.但其培养技术难度大，成本高，研究与生产周

期长。

三体系表达特点比较

表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危

险

大肠杆菌多肽、菌体内容易一般对原核者好不大

蛋白质部分可获得真核者稍差

或融合高产

蛋白质

酵母多肽、菌体内或容易窗体内，真核的接近不大

蛋白质分泌出细可高产稍复杂天然

或糖基胞

化蛋白

哺乳动物细完整糖分泌出细较难成本高简单几乎可为天需注意

胞基化蛋庖可高产然产物有致癌

白质因素

1.去处发酵液中的杂蛋白的方法:

（I）加入凝聚剂（2）加入絮凝剂（3）变性沉淀（4）吸附（5）等电点沉淀

（6）加各种沉淀剂

2.去处发酵液中的钙、镁、铁离子的方法：

（1）离子交换法去铁离子（2）沉淀法钙与草酸钠或草酸镁的去处用草酸沉淀不完全,

碱性条件下用磷酸盐，或三聚磷酸钠，生成络合物（污染河水）

3、影响絮凝效果的主要因索・：

絮凝剂分子量、絮凝剂用量、pH及操作条件

絮凝剂分子量越大，链越长，吸附桥架效果就越明显，但分子链越大，絮凝剂在水中的溶解

度降低；

絮凝剂浓度越低，增加用量有助于架桥，提高絮凝效果，但过多引起吸附饱和，在胶粒表

面形成覆盖层，使胶粒稳定，降低絮凝效果：

pH的变化影响离子型絮凝剂功能团的电离度，电离度的提高使电排斥作用增强，架桥能

力最佳；

搅拌应注意，刚开始搅拌迅速使絮凝剂分散，发挥絮凝作用，絮凝团形成后，高的剪切力

会打碎絮凝团。

4细方法原理特点

胞破

碎：

机械匀浆法基于液相的剪切适用面广，处理量大，速度快，工业广泛使用，不

法力适用某些高度分支微生物，产热大，可能会生物活

性物质失活

珠磨法研磨作用破碎适用面广，处理量大，工业广泛使用，产热大，可

能会生物活性物质失活

超声波超声波的空穴作产热大，散热不易，成本高，适用小量样品破碎

用破碎

物理干燥法菌体细胞膜渗透较剧烈，易引起蛋白质或其他组分变性

法性变化，自溶

冻融法胞内冰晶引起细较温和，但破碎作用较弱，常需反复冻融，实验室

胞膨胀破碎使用

渗透压冲渗透压突然变化，较温和，但破碎作用较弱，常与酶法合用

击法细胞快速膨胀变

化

化学化学试剂化学试剂溶解细需选择合适的试剂，减少对活性物质的破坏，可应

法处理胞或抽提某些细用于大规模生产

胞成分

制成丙酮丙酮迅速脱水，迅速脱水，减少蛋白质变性，促进某些结合酶释放

粉破坏蛋白质与脂

质结合的键

生物酶解法用能反应分解破反应条件温和，但成本较高，一般仅适用于小规模

法坏细胞壁上特有应用

的化学键

组织自溶利用组织中酶改反应条件温和、成本低，不适用于易受酶降解的目

法变、破坏细胞结的物的提取

构、使组织自溶

2.溶液萃取法按操作方式不同，可分为单级萃取和多级萃取，后者分为错流萃取和逆流萃

取。当萃取剂用量相同时，二级萃取收率比单级萃取收率高，在萃取用量一定的情况下，萃

取次数愈多，则萃取愈完全。多级逆流与错流萃取相比，萃取剂耗量较少，萃取液平均浓度

较高。

4.破坏乳状液的方法：

（1）、加入表面活性剂（2）离心（3）加电解质（4）加热（5）吸附法破乳（6）高

压电破乳（7〉稀释法18）其他途径：超滤、反应萃取、中性磷萃取、脂肪类萃取剂

第五章沉淀和结晶

1.盐析沉淀是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数后的

中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀形式析出，从而达到纯化目的的方法。

基本原理：一、盐离子与蛋白质表面具相反电性的离子基团结合，形成离子对，因此盐离子

部分中和了蛋白质的电性.使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互结合。

二、中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水

化膜，暴露出疏水区域，疏水区相互作用，使其沉淀。

2、影响盐析效果的因素：

（I）无机盐的种类（2）溶质（蛋白质）种类的影响（3）蛋白质浓度的影响（4）温度

的影响⑸pH的影响

3.影响沉淀效果的因素：

（1）有机溶剂种类及用量（2）pH的影响（3）温度（4）无机盐的含量（5）某些金

属离子的助沉淀作用（6）样品浓度

4.形成过饱和溶液的方法：

（1）蒸发法（2）温度诱导法（3）盐析结晶法（4）透析结晶法（5）有机溶况结晶

法（6）等电点法（7）微量扩散法（8）化学反应结晶法（9）共沸蒸镭结晶

5.影响晶体大小的因素：

（1）过饱和度：增加过饱和度能使成核速度和晶体生长速度加快，对前者影响较大，过饱

和度增加，晶体较细小。

（2）温度快速冷却，达到较高的过饱和度，晶体细小形成针状晶：反之，缓慢冷却得到

较粗大的晶体.

（3）搅拌速度：搅拌能促进成核和加快扩散，提而晶核长大的速度，过快则晶体会被打

碎。经验表明，搅拌速度愈快，晶体愈细。

（4）晶种加入晶种能诱导结晶，还能控制晶体的形状、大小和均匀度。

2.吸附剂及被吸附物的极性对吸附的影响：

一般极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。极性吸附剂适宜从非

极性溶剂中吸附极性物质.非极性吸附剂适宜从极性溶剂中吸附非极性物质。如活性炭从水

中吸附有机化合物；硅胶是极性的，适宜从有机溶剂中吸附极性物质。

4两种以上常用吸附剂的性质，用途。

活性炭：吸附能力很强的非极性吸附剂。价格低，来源厂。除朵，生化药物的分离。

人造沸石：人工合成的无机阳离子交换剂。带正电荷。与钠离子交换。

磷酸钙凝胶：吸附作用主要是钙离子与蛋白质负电基团结合。

白陶土：活性物质分离纯化的吸附剂，也可作为助滤剂与去除热原的吸附剂。自陶土能吸附

分子量较大的杂质，包括导致过敏的物质，常用它脱色。

氢氧化铝凝胶：

氧化铝：适用于亲脂性成分的分离价廉，再生容易，活性易控制，操作不便，手续繁琐，处理

量有限

硅胶：活性强弱与自由水的含量有关，自由水多，活性低，自由水少，活性高。

5.大网格高聚物吸附剂与传统吸附剂相比的优点：

选择性好、解吸容易，理化性质稳定，机械强度好，反复使用，流体吸力较小。

1、公式Ve二Vo+KdVi各字母的含义，凝胶层析的原理。

Ve一一淋出体积Vo一一粒尖体积Vi一一填料的孔体积Kd一一排阻系数或分配系

数

凝胶层析原理：平衡排除理论一个高聚物分子的流出体积是由在宏观的流动相和微观的孔

体积中的平衡分配系数所决定的。这里所谓的平衡是指扩散的平衡，即溶质分子扩散进入一

个填料颗粒孔中且再出来所需要的时间远小于溶质区段在此停留的时间。换言之，当溶质分

子流过一个填料颗粒这段电离时，溶质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。平衡条件只

是在流速很慢时一个极端情况。

2.常用凝胶的名称、特点及用途。

名称特点用途

葡聚糖凝胶（SephadexG）最常用，稳定，对阳离子轻微分离

吸附，多次重复使用

修饰葡聚糖凝胶

聚丙烯酰胺凝胶化学稳定好，成分不易脱落，

适用pH广，机械强度好，无

带电基团，分辨率较高

琼脂糖类凝胶

多孔玻璃微球化学稳定性高、强度大、高压

下操作，好的流速；缺点是对

糖类、葡萄糖吸附

疏水性凝胶只适用分离分子量较小的物分离不溶水的有机物质

质

5.溶质通过色谱峰时造成的峰加宽效应包括：

溶液在柱内造成的峰加宽：

（1）分子扩散：使用颗粒度小而均匀的填料可以降低扰动作用。

（2）涡流扩散：涡流扩散对凝胶色谱峰的加宽比较重要。应用小而均匀的填料紧密地装在

内径适当的柱中可以减少由涡流扩散造成的峰加宽，提高效柱。

（3）流动相中传质阻力造成的色谱峰加宽。扩散速度越快，流速不平衡的影响就越小.

（4）固定相中传质阻力造成的色谱峰加宽。填充介质粒度越小所造成的峰加宽效应也小。

溶液在柱外产生的峰加宽：

（1）连接管路

（2）检测池

6.利用凝胶层析测量蛋白质的分子量。

测定的依据是不同分子量的物质，只要在凝胶的分离范围内（渗透限与排阻限之间），洗脱

体枳Ve及分配系数Kd值随分子量增加而下降。对于一人特定体系，待测定物质洗脱体枳与

分子量之间的关系：Ve=-KlgM+C（1）求解法以两个已知分子量的蛋白质过柱，求出C和

K,将待测物的Ve代入得到M。（2）标准曲线法以多人已知分子量的标准蛋白过柱，测取

各自的Ve值。以Ve作纵坐标.IgM作横坐标.，制作标准曲线。在同一测定体系中测取未知

物质的Ve,由标准曲线求得分子量。

（1）1.离子交换常用洗脱方法：

（2）从树脂上洗脱目的物的方法主要有两种：

（3）调节洗脱液的pH,使目的物粒子在此pH下失去电荷，甚至带相反电荷，从而丧

失与原离子交换树脂的结合力而被洗脱下来。

（4）用高浓度的同性离子根据质量作用定律将目的物离子取代下来。

3.离子交换的选择性的因素：

一、离子化合价与水合半径的影响二、离子化合价与离子浓度的影响三|、交换环境的影

响（1）溶液的pH（2）离子强度（3）有机溶剂四、树脂结构的影响（1）树脂载体交

联度（2）辅助力（3）其他结合力五、偶极离子排斥作用。

4.偶极离子的交换特点：冷电荷为零时，正电中心和负电中心并不重叠，遂成偶极。

钠型树脂，被吸附的氨基酸的粉基所带的负电荷与树脂磺酸基的负电荷产生排斥力。偶极离

子的排斥作用，所以使树脂对氨基酸的吸附量大大降低。

氢型树脂：由于氨基酸的解离度低，被取代之氢离子为援基所固定，使被吸附的氨基酸不能

形成偶极，故与树脂磺酸基没有排斥力。

偶极离子的排斥力随飒基酸的R基碳链的加长而减弱。适当增加溶液中离子强度，偶极排斥

力减弱。

6.离子交换纤维素的特点及洗脱。

离子交换纤维素为开放的长链骨架，大分子物质能自由地在其中犷散和交换，亲水性强，表

面积大，易吸附大分子；交换基团稀疏，对分子的实际交换容量大；吸附力弱，交换和洗脱

条件缓和，不易引起变性：分辨率强，能分离复杂的生物大分子混合物。

洗脱：对离子交换纤维素进行吸附后的洗脱一般比从离子交换树脂的洗脱缓和。升高环境的

pH或是降低环境的pH或增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来。

7、酸碱性蛋白选择合适的离子交换纤维素。

酸性蛋白质（等电点约pH5），作为一个阴离子，它的DEAE-纤维素柱层析可在pH5。5~9。

。之间进行，蛋白质和交换剂都是解离的，带有相反的电荷。在CM-纤维素.上层析则需限制

在（pH3.5~4.5）之间。

碱性蛋白质（等电点约pH8）作为一个阳离子，用按甲基纤维素层析可在pH3.~7.5进行。

8、离子交换聚焦色谱的原理：

（l）pH梯度的形成：色谱聚焦利用离子交换剂本身的芍电基团的缓冲作用，当洗脱缓冲液

不断滴到离子交换柱上时.柱内自动形成pH梯度。

（2）蛋白质的色谱行为：蛋白质所带电荷取决与他们的等电点和介质的pH.当介质的pH

低于它的等电点时，蛋白质带正电荷，它不与阴离子交换剂结合，随洗脱液向下移动。

（3）聚焦效应：当一种蛋白质在柱上随洗脱液下移至等电点处，移动速度明显减慢。加上

相同的第二个样品，它将以洗脱液移动的速度下降，，直到追到正在慢移的第一个样品成分

处（聚焦）。然后这两个样品一起下移，往柱下一起洗脱出来。所有的样品必须在第一个样

品峰尚未被洗脱前加入。

I、亲和层析原理，主要特点。

利用生物体中多数大分子物质具有与某些相应的分子专一型可逆结合的特性。

主要特点：经过•此简单的处理就可以获得所需的高纯度活性物质。对设备要求不高，操作

简便，使用范围广，特异性强，分离速度快，分离效果好，分离条件温和。缺点是吸附剂的通

用性较差。

2、选择配基的注意点：

（1）配基与配体由足够大的亲和力

（2）配基与配体的结合应是专一的

（3）配基应具有化学活性。

4.制作高亲和力的亲和吸附剂

提高亲和层析效果，固定相的配基和流动相的配基具有较强的亲和力。配基浓度对亲和力的

影响。为了将亲和配体和其他物质分开，在实际亲和层析时，通常需要阻流值210。空间障

碍的影响：插入适当长度的手臂。配基与载体的结合位点的影响。载体孔径的大小对吸附剂

的亲和能力有决定性的作用。微环境的影响，包括载体及手臂的电性、极性、次级键对配基

亲和力的影响。

6、亲和层析洗脱方法：

（1）非专一性洗脱改变洗脱剂的pH以影响电性基团的解离程度而洗脱（2）特殊洗脱（3）

专一性洗脱竞争性效应非竞争性效应反竞争性效应

8、亲和膜分离原理及特点：

亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层

析的变型。优点：（1）传质阻力小，达到吸附平衡的时间短，配基利用率高。（20压降小,

流速快，设备体积小，配基用最低。缺点：理论塔板很低，吸附和清洗率低。

1、相对离心力：（RCF）离心力与重力的比值。用符号“Xg”或“g”表示。

RCF=11.18X10/N2r（Xg）

2.离心机转子有几种，各自特点（了解）。

（1）角度转子：机械强度高，重心低，运转平稳，寿命长，管内温度分布均匀，温差对流小,

离心时间短，使用方便，但离心管外壁易产生强烈对流和涡流，同时管外侧会出现沉淀，形

成壁效应。

（2）水平转子：结构复杂，加工困难，机械强度低，重心高，容量小，低速运转时易摇摆，离

心时间长，寿命短而价格高。对流作用小，“壁效应”弱。

（3）区带转子:Anderson转子，无离心管，“十”字隔板将样品槽分为四个扇形室。无壁效

应，适用于大量样品的密度梯度及等密度梯度离心。配有附属设备和仪器，操作过程豆杂,

设备较贵，但离心机使用效率高。

2、（4）垂直管转子：特殊类型的定角转子。离心时的碰撞及温差引起的对流不显著。颗粒

沉降时间短，可用于差速、密度梯度及等密度离心，用于平衡等密度离心时效果最佳。

3、（5）连续离子转子：低速或高速离心机转子，可用于超速离心机。结构简单，低速时加

样，高速时排出清夜。用于实验室，也可用于小规模生产，最适宜自培养液中收集菌体及

细胞。

4、（6）细胞洗脱转子：低速离心时连续分离型转子，最高转速不超过6000r/mino最适于

自动植物培养液或发建液中连续分离单细胞和菌体，回收浓度及回收率均较高。

1、克服浓差极化现象的措施：

2、克服极化的主要措施有振动、搅拌、错流、切流等技术，但应注意过于激烈的措

施易使蛋白质等生物大分子变性失活。此外，将某种水解酶类固定于膜上，能降解造成

极化现象的大分子，提高流速。不过这种措施没有速用性，只适用于一些特殊情况。

（1）透析装置的类型：

（2）旋转透析器（2）平面透析器（3）连续透析器（4）浅流透析器

膜孔径检测技术：

1、（1）气泡压力法D=4KocosO/P修正为:D=4o/P

2、（2）水流量法：将滤膜以蒸镭水完全润湿，装于滤器中，下接抽气瓶。开动真空泵，使

压力稳定于700mmHg柱，然后加入洁净蒸储水100间，记录下抽滤100ml水所需要的时间。

3、计算孔径：r=（其中r——滤膜孔隙半径，cm;K——0.265;S——膜的厚度，mm;V

----蒸储水体积,ml;G---干湿膜重量差,g;P---压力差,dyn/cm;t----时间，s。）

HPLC的组成部分：

进样器、高压泵、预柱、色谱柱、柱头、检测器

理论塔板数及分离度的计算公式：

理论塔板数N:

分离度Rs:R=--——

KI

州）1+叫♦

3.制备型高效液相色谱的重要参数：

分离度（resolution）、分离速度（speed）、回收率（recovery）、样品容量（capacity）

主要考虑样品容量、回收率、和产率。

5.色谱介质按分离机理分为：

液固色谱、键合相色谱、离子交换色谱、离子交换色谱、离子对色谱、凝胶色谱、疏

水色谱、亲和色谱、聚焦色谱、金属整合亲和色谱

1、生化药物的特点及主要资源。

主要奥源：

（1）氨基酸类药物（2）多肽与蛋白质类（3）核酸类药物（4）酶类药物（5）糖类药

物（6）脂类药物（7）维生素及辅酶类

2、药理学特性：（1）药理活性高（2）治疗的针对性强，治疗的生理、生化机制合理，疗

效可靠。（3）毒副作用较少，营养价值高。（4）生理副作用常用发生。

3、理化特性：（1）生物材料中的有效物质含量低，杂质种类多且含量相对较高。（2）生物

活性物质组成结构复杂、稳定性差。（3）生物材料易染菌，腐败。（4）生物药物制剂

的特殊要求。

4、氨基酸的生产方法及各自特点

（1）水解法最早发展起来生产氨基酸的方法，以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料,

通过酸、碱或水解成多种敏基酸混合物，经分离纯化获得各种药用氨基酸。水解•、

分离、结晶。

4、发酵法：微生物通过固氮作用，硝化还原及外界吸收氨使酮酸氨基化成相应的氨基酸。

酶转化法：反应大多在水溶液中进行，条件温和、选择性高、副产物少、生产工艺简单，分

离精制容易。

化学合成法：以石油化工产品为原料，价格低廉，成本低、适合工业化生产。

以生物组织为原料提取纯化多肽和蛋白质，在选择材料及选择分离纯化方法时注意点：

（1）材料选择：

（2）种属（2）发育生长阶段（3）生物状态（4）原料来源（5）原料解剖血部位

（1）分离纯化方法：

（2）根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质

（3）根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质

（4）根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质

（5）根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质

（6）根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质

（7）根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质

（8）根据蛋白质在溶剂系统种分配的不同来纯化蛋白质

（9）根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质

（10）根据蛋白质的某些特殊性质进行纯化

（1）纯化注意点：

（2）分离纯化早期使用方法的选择

（3）各种分离纯化方法的使用顺序

（4）分离纯化后期的保护性措施

（5）对分离纯化每一步骤的优劣进行综合评价

7、酸醇提取法以胰脏为原料生产胰岛素的工艺

5、工艺流程：23-2.6倍的86%〜88%乙醇（W/W）和5%草酸提取一用pH8.0〜8.4浓氨水碱

化，用硫酸酸化pH3.6~3.8-减压浓缩，蒸去乙醇一去脂、27%（W/V）固体氯化钠盐析

一精制一除酸性蛋白质一锌沉淀一结晶一回收

（1）在多肽的固相合成方法中，常用的氨基保护剂有：

（2）Boc（叔丁氧世基）（2）Fmoc（9-笏甲氧皴基）

12.用营养缺陷型菌株发醉生产核普及核昔酸的原理和方法。

14.从生物材料中提取酶的主要过程和分离纯化过程中应注意的问题

酶的纯化：凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化

注意两个问题：1.建立快速的测定酶活力的方法

2.建立活力回收表

酶的分离纯化工作中的注意事项：

1.防止酶蛋白变性

2.防止复因子丢失

3.防止酶被蛋白水解酶降解

15.CuZn-SoD和Mn-SoD的生产工艺及测定方法。

（1）以牛血红细胞提取Cu、Zn-SOD的工艺：

【收集】【洗条】【溶血】

新鲜牛血等;红细胞-------,干净红细胞--------,

的一千十1111离D2%NaQH2O,30min

上清智沉淀生上清液

溶血液

纯氯仿，离心

SOD粗提液翳-浓缩液酒鬻1a

60~70°C,10min,商心nisfsutzAtz-oepriaoexMou

6辍】毓】【肝】

吸附%6*5。3位洗脱浓缩液一冻干粉

牛肝［例］皿上清液?客】「海3吐清液

十盯生嘱水PH7.8PBS65C5mn

言置产沉淀皿溶液典透析液

黯心流出液殿】【冻干】»冻干粉

（1）16.粘多糖的特点

（2）粘多糖：是指含有氨基糖与糖醛酸或它的衍生物的多糖。

粘多糖基本上是由特殊的重复双糖单位构成，在此双糖单位中包括一个N-乙酰氨基己糖

（2）粘多糖的组成结构单位中有两种糖醛酸。即D-葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸；有两种氨

基己糖，即：氨基-D-葡萄糖和氨基-D-半乳糖。

（3）粘多糖中还有若干其它单糖作为附加成分，如半乳糖等

17、多糖结构和多糖活性的关系

（1）多糖的高级结构与生物活性的关系

（2）多糖的分支度及其侧链与生物活性的关系

（3）多糖的分子量与活性的关系

右旋糖苗:MwlO万〜20万。红细胞聚集。

Mw2万〜4万红细胞解聚，治疗血栓。

（4）多糖中的取代基与生物活性的关系

乙酰基：改变多糖的定向性和横次性

硫酸基：抗凝血

抗病毒（包括抗艾滋病病毒）

a多糖本身结构（均一多糖）

b分子量

c硫酸基团的含量

B-内酰胺类抗生素，氨基糖甘类抗生素\大环内酯类抗生素以及四环类抗生素结构上特点,

熟悉代表品种的理化性质，

（I）B-内酰胺类抗生素

B-内酰胺类抗生素是一类在结构上具有B-内酰胺环（B-lactam）,呈抗菌活性的天然的或化

学改造的化合物的总称。青霉素的基本母核为B-内酰胺环核口塞嚏烷环并联组成的N-酰基-6-

氨基青霉烷酸，其侧链上的R基可为不同基团取代。青霉素是弱酸性物质，易溶于醉类、酮

类、醛类和酯类溶剂中，其游离酸在水中的溶解度很小，但其金属盐类易溶于水，而几乎不

洛J•乙醛、.三氯甲烷和醋酸丁酯。工业上利用此原理，通过将青毒素G游离酸与醋酸钾反应

生成钾盐，使之从醋酸丁酯相中析出，可得到高纯度的青霉素G钾盐。青霉素是不稳定的化

合物，它在水溶液中极易被破坏而失活，温度升高或在酸、碱性条件下分解更快。头抱菌

素C为两性化合物，分子中有2个粉基和一个氨基，pK值分别为<2.6（侧链竣基）、3.1（核竣

基）、9.8（侧链NH）,在中型和偏酸性下呈酸性，能与碱金属结合生成盐类。其钠盐含2个

结晶水，为白色或淡黄色结晶性粉末，易溶于水，不溶于有机溶剂。对稀酸及重金属离子均

稳定，水溶液pH>ll时迅速失活。

（2）氨基糖首类抗生素

氨基糖昔类抗生素失在分了•中含有氨基糖昔结构的一大类抗生素。它们的化学结构都是以氨

基酸醇与氨基酸缩合而成的俘，其名称应为氨基糖甘-氨基环醇类抗生素。链霉素是由链霉

胭同链霉糖和葡萄糖胺衍生物所构成的糖甘。其分子中含胭基，呈强碱性，比较稳定，易溶

于水，难溶于有机溶剂。性毒素盐酸易溶于甲醇，难溶于乙醇，而硫酸盐即使在甲醇中也很

难溶解。硫酸卡那霉素为白色或类白色粉末，无臭，味苦，有吸湿性。易溶于水，在乙醛或

三氯甲烷中几乎不溶，不溶于乙醉、丙酮、茉及醋酸乙酯。在pH2~ll范围内较稳定，在pH6~8

加热煮沸时，活力可维持30min;加热至120℃lh,活力仅破坏5%,暴露在阳光中变黑，但对效

价没有影响。

（3）大环内酯类抗生素

大环内酯抗生素是以一个大环内酯为母体，通过羟基，以昔键和1~3分子糖相连的一类抗生

素物质。红霉素14元环是白色或类白色的结晶，微有吸湿性，味苦，易溶于醇类、丙酮、三

氯甲烷、酯类、微溶于乙甦。溶解度在55c时为最小。在室温和pH6~8条件下其水溶液最

稳定。麦迪霉素16元环内酯抗生素，白色结晶性粉末，无臭、有苦味，易溶于甲静、乙醇、

丙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯等溶剂，极微溶于水，不溶于石油醛及正己烷，在水

中的溶解度随温度的升高而降低。在PH2.0〜9.0之间的水溶液中最稳定，遇碱水解产生丙酸,

遇酸水解产生氨基碳霉糖，对热、湿、光稳定。

（4）四环类抗生素

四环类抗生素系以四并苯（蔡并蔡）为母族的一族抗生素。固体四环类抗生素很稳定。四环

类抗生素的水溶液在不同pH下稳定性差别大。四环类抗生素对各种氧化剂，包括空气中的

氧气在内，都是不稳定的。其碱性水溶液特别容易氧化，颜色很快变黑形成黑色色素。四环

类抗生素在弱酸性溶液中比较稳定。四环类抗生素能和很多高价金属离子如钙离子、镁离子

等形成螯合物，这一性质用于从发酵液中提取四环素。四环类和尿素形成等摩尔比复合物,

不溶于水，当溶于有机溶剂时，复合物即分离成四环素和尿素。

a.青霉素：性质很不稳定，提炼过程应在低温、快速、严格控制pH下进行，注意对设备清洗

消毒减少污染，尽量避免青霉素效价的破坏损失。

工艺要点：发酵液预处理和过滤一萃取一脱色和脱水一结晶一洗涤干燥

c.链霉素：提取日前均采用离子交换法、二次洗脱

工艺要点：预处理及过滤一交换和洗脱一精制一脱色、干燥

已红霉素：溶剂萃取法和大孔树脂吸附法

工艺要点：发酵液的预处理和过滤一吸附一洗涤、解吸一反萃取一结晶

g.四环素：

1、工艺要点：酸化过漉一粗品结晶一溶解一连续结晶一分离洗涤一气流干燥一尿素复盐结

晶f溶解f结晶f分离洗涤f固定床气流干燥

离子交换法分离纯化链霉素时用的离子交换树脂，它们的作用和原理是什么？

110-Na型树脂吸附，链霉素在中性溶剂中，是三价的阳离子，可用阳离子交换树脂吸附。

2、NaOH中和后401树脂吸附，一次洗脱液还存在链毒胭、链孤双氢链毒糖、一链霉胺、

色素等杂质，应用苇胺树脂与链霉素形成席夫碱反应排除上述杂质，吸附饱和树脂用无

盐水洗净后同前用低温硫酸洗脱得到二次洗脱液。

3、1X14-H型树脂精制，以禽子筛的作川达到分禽FI的。330-OH型树脂去除硫酸根等

阴离子。

4、列举两种微生物产生的酶抑制剂和免疫调节。

酶抑制剂：（1）内酰胺类酶抑制剂克拉维酸

....（2）胆固醇生物合成酶抑制aHMG-CoA还原能抑制.美伐他汀

b.HMGCoA合成酶抑制剂1233A

（3）鲨烯合成南抑制剂

免疫调节剂：（1）微生物产生的免疫抑制剂：环狗菌素A

（2）微生物声生的免疫增强剂乌苯美司

2.简述疫苗的一般制备方法：

（1）毒种的选择和减毒（2）病毒的繁殖（3）疫苗的灭活（4）疫苗的纯化（5）冻干

3.病毒类疫苗的制备过程中，病毒的扩增方法：

（1）动物培养（2）鸡胚培养（3）组织培养（4）细胞培养

6.基因治疗中常用的载体：

病毒载体

（1）逆转录病毒载体（2）腺病毒载体（3）腺病毒相关病毒载体（4）单纯疱疹病毒载体

非病毒载体

（1）裸露DNA（2）基因缝合线法（3）脂质体载体（4）哺乳动物人工载体

7应用基因药物治疗癌症用哪些抑癌方法

（1）导入抑癌基因或细胞因子

（2）抑制血管生成

（3）自杀基因

（4）反义药物

（5）导入MHCI类抗原基因进行基因治疗

（6）导入MDR1基因进行治疗

8、表达载体的一般要求：

（1）能进行自我复制功能（2）带有选择标记的载体

（3）9、常见的基因工程宿主有哪些，各有什么特点。

（4）基因工程包括转录、翻译及翻译后加工等过程。根据宿主细胞种类不同，分为原核

基因工程和真核基因工程。原核基因工程以原核细胞作为表达宿主，如大肠杆菌、

枯草杆菌等；而真核基因工程则以真核细胞为表达宿主，如酵母、昆虫细胞、哺乳

动物细胞、植物细胞等。

大肠杆菌表达系统：遗传背景比较清楚，使用安全、技术操作简便.繁殖力强（20~30min即

可繁殖一代），便于大规模培养，成本较低，表达水平较高（可达总蛋白的5%〜6%）,下游

技术成熟、易于控制。目前使用最广泛、最成功的表达系统。

酵母表达系统：①是真核表达体系，对表达蛋白可进行折叠和翻译后的修饰与糖基化；②表

达量高，如明胶表达屋达14。8g/L;③培养成本低；④适用高密度发酵；⑤杂蛋白少，产物易

纯化。

哺乳动物表达系统：中国仓鼠卵巢细胞（CHO）和猴肾细胞（COS）优点是能识别和剪切

外源基因的内含子并加工成为成熟的mRNA.但其培养技术难度大，成木高，研究与生产周

期长。

三体系表达特点比较

表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危

险

大肠杆菌多肽、菌体内容易一般对原核者好不大

蛋白质部分可获得真核者稍差

或融合高产

蛋白质

酵母多肽、菌体内或容易菌体内，真核的接近不大

蛋白质分泌出细可高产稍复杂天然

或糖基甩

化蛋白

哺乳动物细完整糖分泌出细较难成本高简单几乎可为天需注意

胞基化蛋胞可高产然产物有致癌

白质因素

生物药物：（biopharmaccutics）是利用生物体、生物组织、细胞或其成分，综合应用生

物学与医学、生物化学与分子生物学、微生物学与免疫学、物理化学与工程学和药学的原理

与方法加工制造而成的一大类用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品。

DNA重组药物：即应用重组DNA技术（包括基因工程技术和蛋白质工程技术）制造的重

组多肽、蛋白质类药物和疫苗、单克隆抗体与细胞因子等。

基因药物：以基因物质（RNA和DNA及其衍生物）作为治疗的物质基础，包括基因治疗用

的重组目的DNA片段、重组疫苗、反义药物和核酸等。

生化药物：是运用生物化学的理论、方法、技术与研究成果，从生物体（包括动物、植物、

微生物和海洋生物）分离、纯化得到的一些重要生理活性物质，经药效学和毒理学研究证明

对于疾病的防治是安全有效的•大类药物，如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、维生素、

激素、糖类、脂类、核酸、核甘酸及其衍生物。

反义药物：是以人T合成的10~几十个反义寡核甘酸序列与模板DNA或mRNA互补形成稳

定的双链结构，抑制靶基因的转录和mRNA的翻译，从而起到抗肿瘤和抗病

毒作用，目前有20多种反义药物进入临床试验，其中ISIS是FDA批准的第一

个反义药物用于治疗AIDS病患者的巨噬细胞病毒性视网膜炎。

蛋白质工程：在基因水平上设计表达新功能蛋白。

1、蛋白质组学：研究细胞、组织或个体全部蛋白质的全部表达状态与功能状态，是后基因

时代重要研究方向，

凝聚作用：（coagulation）是指在某些电解质的作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥作

用降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。

絮凝作用：（flocculation）是指在胶体悬泞液中加入絮凝剂后，胶粒可强烈吸附在絮凝剂表面

的功能团上，而且一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同颗粒的表面上，产生架桥联

接，形成粗大的絮凝团沉淀的过程。

双水相萃取：不同的高分子溶液相互混合可产生两相或多相系统，利用物质在互不相溶的两

水和分配系数的差异来进行萃取的方法。

多级错流萃取：料液经萃取后的萃余液再用新鲜萃取剂进行萃取的方法。

多级逆流萃取：在第一级中加入料液（F）,萃余液”页序作为后一级的料液，而在最后一

级加入萃取剂（S）,萃取液顺序作为前一级的萃取剂。由于料液移动的方向和萃取剂移动

的方向相反，故称为逆流萃取。

反胶束萃取：表面祜性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界股束浓度，在有机溶剂

内形成聚集体，其中表面活性剂的非极性基团在外，与非极性的溶剂接触，而极性基团在外,

形成极性核，从而能够溶解极性物质，进行萃取。

超临界流体萃取：（supercriticalfluidSCF）是利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶

剂流体所具有特异增加物质溶解能力来进行分离纯化的技术。

Ks盐析：在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析。

B盐析：在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析。

止吸附：吸附提取液中的有效成分。

负吸附：去除提取液中的杂质。

大网格高聚物吸附剂：与