生物化学实验2

实验一、甲醛滴定法测定氨基氮

实验目的：

初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。

实验原理

氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡:

对溶液氨基酸含量的测定主要依据平衡中电离H+的浓度来确定。因此，反应平衡应

向右进行。

平衡向右的促进方式：1）增加底物的浓度——A、增加AA的浓度（本实验目的是测

定氨基酸的含量，必须保证固定的氨基酸浓度；B、加碱，让H+电离。但一NH3+是弱酸，完

全解离时.pH为11〜12或更高，若用碱滴定一NH3+所释放的H+不测量氨基酸，一般指示剂

色域小于10,很难准确指示终点。因此，直接用碱滴定是不可行的。2）降低产物的浓度一

一在本实验中用加入过量甲醛的方式：常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基

化合物，使平衡右移，促使一NH3+释放H+,使溶液的酸度增加，同时也使滴定终点从强碱区

域（pHll〜12）移至弱碱区域（pH9.0左右）。而这一区域正好是酚酸的敏感变色区域（pH8~10）。

因此，可用酚酰用指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定（刚好微红）。

RCHCOO-R-CHCOO^+H：J-----------------------

瓦；一2中和

।।]HCHO

I羟甲基氨基酸一R-CH-COCT

NHCH2OH

________________1]HCHO

二羟甲基氨基酸।<・_RCHCOO-

N（CH20H）2

由滴定所用的NaOH量就可计算出溶液中氨基酸的含量，这就称氨基酸的甲醛滴定法。如

样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。

当然，如样品是蛋白质水解液，（实际上是多种氨基酸的混合物），则滴定结果不能作为

氨基酸的定量依据。但是，基本规律如下：当蛋白质水解时，放出游离的氨基，随着水解程度

的增加，滴定值也增加。当滴定值不再增加，表示水解传用己完全。相反，蛋白质合成时游离

氨基减少。因此可以用此法测定溶液中的氨基量，就能大体判断出蛋白质水解或合成的进

度。

二、实验器材

三、1.25ml锥形瓶2.微量滴定管3.吸管4.移液管

四、实验试剂

1.0.1mol/L标准甘氨酸溶液300ml

准确称取750mg甘氨酸，溶解后定容至100ml。

2.0.1mol/L标准氢氧化钠溶液500ml

3.酚醐指示剂20ml

0.5%酚瞅的50%乙醇溶液

4、中性醛溶液400ml

在50ml36%~37%分析纯甲醛溶液中加入ImLO.l%酚酸乙醇水溶液，用O.lmoUL的NaOH

溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。此试剂在临用前配制。如已放置一段时间，则使用前

需重新中和。

五、实验操作

取3个25ml的12345

锥形瓶，编号。(Control)(StandardGly)(StandardGly)(Sample)(Sample)

向第2.3号瓶内

各加入2ml

0.1mol/L的标准

甘氨酸溶液和

5mL水，混匀。

向1号瓶内加入

7mL水。然后向

3个瓶中各加入

5滴酚酸指示

剂，混匀后各加

2mL甲醛溶液，

再混们，分别用

0.1mol/L标准氢

氧化钠滴定至

溶液显微红色。

重复以上实验

两次，记录每次

每瓶消耗标准

氢氧化钠溶液

的mL数。取平

均值，计算甘氨

酸氨基氮的回

收率C

试剂

甘氨酸（mL）0O.lmol/LGly2mlO.lmol/LGly2ml未知浓度2ml未知浓度2ml

H2O(ml)75555

酚醐（滴）55555

甲醛（ml）22222

O.lmol/LNaOH

计算氨基氮

六、取未知浓度的甘氨酸溶液2mL,依上述方法进行测定，平行做两份（4.5号），取平均

值。计算每mL甘氨酸溶液中含有氨基氮的mg数。

七、实验结果

1.氨基氮的回收率

甘氨酸氨基氮回收率％=—实际测=量X100

加入理论量

Gly4，▲JU理论值=\hx0.hnoLLx14.008gmol

Imolimol

实测值=(V-)x0.1molLx14.DOSgmol

ZxO.lmolLxO.lmolL

V

实测值0对骐）

氮基氮回收率（%）=----------

理论依

公式中实际测得量为滴定（2.3号）瓶消耗用的标准氢氧化钠溶液mL数的平均值与

第1号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液mL数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以14.008o

2mL乘以标准甘氨酸的摩尔浓度再乘以14.008o即为加入理论量的mg数。

2.氨基氮的含量

（-%）Xmol/LNaOHX14.008

氨基氮（mg/inL）=-------------------------------------;---------------------------------------

式中：为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均mL数。为滴定对照液（2.3号瓶）

耗用标准氢氧化钠溶液的平均mL数。mol/LNaOH为标准氢氧化钠溶液的真实摩尔浓度。

实验二、蛋白质的性质实验(一)蛋白质及氨基酸的呈色反应

1、实验目的：

2、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。

3、了解蛋臼质和某些氨基酸的呈色反应原理。

4、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。

二、实验原理(呈色反应)

蛋白质分子结构中某种化学键或氨基酸残基中的某些化学基团能与特定的化学试剂产生特定

的有色物质，称为蛋白质的呈色反应。

各种蛋白质分子中氨基酸残基不完全相同，因此产生的颜色也不完全一样。当然呈色反应并

不一定是蛋白质的专一反应，某些非蛋白质类物质也能产生类似折颜色。因此，不能仅仅根据

呈色反应的结果来判断被测物质是否为蛋白质。

(一)双缩服反应(Birutreaction)

1.原理

尿素加热至180℃左右，生成双缩胭并放出一分子氨。双缩胭在碱性环境中能与Cu2+结合生

成紫红色化合物，此反应称为双缩胭反应。蛋白质分子有肽键。其结构与双缩胭相似，也能发

生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。

注意：双缩曝反应不仅含有两个以二肽键的物质所有。含有一个肽铤和一个一CS—NH2,—CRH-NH2,-CH2

—NH2—CHNH2—CH2OH,或一CHOHCH2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺(O=C(NH2)—C(NH2)=0

等物质有此反应。NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu(NH3)42+,一切蛋白质或

二肽以上的多肽都有双缩腺反应，但有双缩股反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

/NH

弋2

、NH2

/NH2

c=o

、NH2.

2、试剂

1）尿素10g3）2%硫酸铜溶液60mL

2）10%氢氧化钠溶液250mL5）0.5%Glu溶液

4）2%卵清蛋白溶液（1:6）80mL

鸡蛋清用蒸屈水稀释6倍，通过2~3层纱布滤去不溶物即得。

3、操作

取少量尿素结晶123

（火柴头大小），

放在干燥试管中。

用微火加热使尿素

熔化。熔化的尿素

开始硬化时，停止

加热,尿素放出氨

基酸，形成双缩

服。冷却备用，为1

号。

再取两支：分别加

入卵消蛋白溶液和

Glu溶液，为2号

和3号。

编号

双缩服（少许）卵清蛋白（1ml）Glu(lml)

10%NaOH(滴)555

2%CuSOM滴）I1

现象

在上述三支试管中分别进行如下操作：力「10%氢氧化钠溶液约1mL（5滴），振荡混匀，再加

2%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝

色氢氧化铜能掩盖粉红色。摇匀，再加2%硫酸铜溶液1滴，随加随振荡。观察紫玫瑰色的出

现。

（二）萍三酮反应

1.原理

除脯氨酸、羟脯氨酸和第三酮反应产生黄色物质外，所有a-氨基酸及一切蛋白质都能和

年三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，I：1500000浓度的氨基酸水溶液即能反应，是

一种常用的氨基酸定量测定方法。

B-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应。尿素工马尿酸、二酮毗嗪和肽键上的亚氨基不

呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有荀三酮反应，但能与玮三酮呈阳性反应的不一定

就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。

前三酮反应分为两步：第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合荀三酮被还原成还

原型年三酮；第二步是所形成的还原型苗三酮与另一个水合基本分子和氨缩合生成有色物质。

反应机理如下：

此反应的适宜pH为5~7,同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同,

酸度过在时甚至不显色。

2.试剂

1）蛋白质溶液100mL2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：水二1:6）

2）0.3%Glu溶液80mL3）0.1%荀三酮水溶液50mL

3、操作

取2支试管分别加入蛋白质溶液和Glu氨酸溶液1mL,再各加2~3滴0.1%前三酮水

溶液，混匀，在沸水浴中加热1〜2分钟，观察颜色由粉红色变紫红色再变蓝。

1（卵清蛋白）2(Glu)3(Tyr)

体积（ml）111

年三酮（滴）333

（三）黄色反应

1、原理

含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合

物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醍酸钠。反应式如下：

NaOHO=

HNOHO

+3—<11

+

N—O-Na

NOII

2O

硝基粉f美色）外硝此破.钻f谷为色）

2、多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少

量浓硫酸才有黄色反应。

3、试剂

1)鸡蛋清溶液100mL将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1:2（）混匀，然后用六层纱布过滤。

2)头发3)指甲

4)0.3%色氨酸溶液10mL5)0.3%酪氨酸溶液10mL

6)0.5%苯酚溶液50mL7)浓硝酸200mL

8)40%氢氧化钠溶液100mL

4、操作

向六个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置，或

用微火加热。等各管出现黄色后，于室温下逐滴加入40%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变

化。

管号123456

材料0.5%苯酚鸡蛋清指甲头发0.5%色氨酸0.3%酪氨酸

（滴）44少许少许44

浓硝酸/（滴）428-108-1044

显色时间

加氢氧化钠

现象

实验三蛋白质的性质实验（二）蛋白质的沉淀反应

一、注：实验前将水浴锅的水加热。

二、目的

1）加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。

2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。

3）了解蛋白质变性与沉淀的关系。

三、原理

蛋白质在水溶液中是稳定的胶体溶液：1）蛋白质颗粒表面有很多极性基团，与水有很高

的亲和性。水易在蛋白质颗粒外形成一层水化膜，使蛋白质颗粒相互分开，避免相互碰撞形成

大颗粒而沉淀；2）蛋白质颗粒在非等电点状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥,

不致聚集而沉淀。因此，在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成稳定的

亲水胶体颗粒。在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。

蛋白质的沉淀反应可分为两类：

1）可逆的沉淀反应在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体

溶液中沉淀分离。此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质

的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用

或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。（等电

点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法等）

2）不可逆沉淀反应在强烈条件卜，破坏蛋白质的水化层或电荷。此时蛋白质分子内

部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。引起不可逆沉淀的因素:

加热、重金属盐、生物碱（如苦味酸、筲酸、糅酸）以及某些酸（如三氯醋酸、过氯酸、硝酸）、

强酸或强碱等。

四、蛋白质的变性、沉淀、凝固之间有很密切的关系。但蛋白质变性后并不一定沉淀，变

性蛋白质只在等电点附近才沉淀，沉淀的变性蛋白质也不一定凝固。例如，蛋白质被强

酸、强碱变性后由于蛋白质颗粒带着大量电荷，故仍溶于强酸或强减之中。但若将强碱和

强酸溶液的pH调节到等电点，则变性蛋白质凝集成絮状沉淀物，若将此絮状物加热，则

分子间相互盘缠而变成较为坚固的凝块。

五、因此变性蛋白质并一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质（如可逆性沉淀）也未必都已

变性。

六、试剂与材料

1.蛋白质溶液⑴（2）（3）

5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清：水=1:9）

2.3%硝酸银溶液10mL（2）

3.5%硫酸铜溶液10mL（2）

4.饱和硫酸核溶液250mL（1）

5.硫酸钱结晶粉末1000g（1）

6.0.1mol/L盐酸溶液300mL

7、0.01%氢氧化钠溶液100mL(2)

8、0.05mol/L碳酸钠溶液100mL

9、1（）%醋酸溶液100mL(2)(3)

10、1%醋酸溶液20mL(3)

11.饱和NaCl溶液(3)

七、12.10%氢氧化钠溶液(3)

八、操作

（一）蛋白质的盐析

无机盐（硫酸镂、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白

质也不同。

5%卵清蛋白（5mL）+5mL饱和硫酸钱

］混匀后静置数分钟

过滤（改用吸管吸出上清液）

沉淀（即为球蛋白）上清液

（改用吸管吸出上清液）［加少量水［加入硫酸钱粉末

观察现象过滤

上清液（弃去）沉淀（即为清蛋白）

|加少量水

观察现象

如球蛋白可在半饱和硫酸镀溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸镀溶液中才能析出。

由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆

过程。

加15%卵清蛋白溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸钺溶液，混匀后静置数分钟则析出球

蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤

液中添加硫酸铉粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。

取出部分清蛋白，加少量蒸像水，观察沉淀的再溶解。

（二）重金属离子沉淀蛋白质

重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。

原理：当溶液的1234

pH＞蛋白质等电点时，

蛋白质颗粒带负电，

此时的蛋白质一旦遇

到重金属盐类（如：

Pb2+、Cu2+、Hg2+、

Ag+等）就易形成不溶

性盐而沉淀。

重金属盐类与蛋

白质发生的沉淀反应

通常较为完全，故常

用重金属盐除去液体

中的蛋白质。（在实践

中，如误服重金属盐

的病人可口服大量牛

奶或豆浆等，缓解中

毒，其原因是牛奶是

高蛋白食品。蛋白质与

重金属离子形成的不

溶性盐可以通过服用

催吐剂排出体外）。但

要注意：在使用重金

属盐（如CuS04、

PbAc2）沉淀蛋白质时，

不可过量，否则将引

起沉淀再溶解。

取一支试管，加

入蛋白质溶液2mL,

再加3%硝酸银溶液

1~2滴，振荡试管，有

沉淀产生，放置片刻，

倾去上清液，向沉淀

中加入少量的水，沉

淀是否溶解，为什

么？

j一、管号

试剂

蛋白质样液（mL）2222

0.01%NaOH(ml)-1--

10%HAc(mL)1-11

金属离子--

5%CuSO411

（滴）

3%AgNO3--11

现象

加H2O是否溶解

酸性碱性酸性碱性

（三）加热沉淀蛋白质

1、原理

几乎所有的蛋白质都因加热变性而沉淀或凝固。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因是

由于高温破坏了蛋白质的水化层，使蛋白质天然结构解体，疏水基团外露。

A.蛋白质的热变性作用与加热时间和温度有关。加热的温度越高，时间越长，沉淀越彻

底。

B、蛋白质的热变性与溶液pH有关。在强酸或强碱溶液中，蛋白质分子带正电或负电荷,

即使加热也不会发生沉淀；当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速。这是因为，一

方面，加热破坏了水化层，另一方面，蛋白质处于等电点时也破坏了它的带电状态。

C、少量盐类可以促进蛋白质的加热凝固。我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加

热并点入少量盐卤（含CaS04）的制豆腐；即使在强酸或强碱状态，加入一定的中性盐后就

可使蛋白质加热而凝固。

、一—_管号12345

试剂

蛋白质样液（mL）11111

10%HAc（滴）55000

H2O（滴）00500

10%NaOH（滴）00050

饱和NaCl（滴）05005

现象

沉淀溶于水的现象

实验四、蛋白质的性质实验（三）蛋白质的等电点测定

1、实验目的：

2、了解蛋白质的两性解离性质。

3、学习测定蛋白质等电点的一种方法。

二、实验原理

蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：

其分子中所含的自由氨基和酸基均可能解离。当溶液的pH值大于蛋白质的等电点，氨基

的解离胺到抑制而竣基的解离度增大，此时蛋白质分子为带负电荷的阴离子。反之，当溶

液的pH小于蛋白质等电点时，竣基的解离受到抑制而氨基的解离增加，而使蛋白质分子

带正电荷。

「OOH

R-CH

NH2

蛋白质分子

11

COOHCOO-COO-

I+OH-I+OH-I

R-CHR-CHR-CH

++

I.+HI++HI

NH3NH『NH2

阳离子兼性离子用离子

pH<pIpH=pIpH>pI

电场中：移向阴极不移动移向阳极

三、蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值

时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极

移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其等电点「在等电点

时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常

用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。

四、本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸

钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入

酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH即为酪蛋白的等电点。

五、实验器材

水浴钠、温度计、200ml锥形瓶、100mL容量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵

六、实验试剂

1.0.5%酪蛋白醋酸钠溶液200mL

取纯酪蛋白（干酪素）0.05g加蒸镭水20mL及Imol/LNaOH溶液5mL,混合使之溶解，再

加1mol/LHAc溶液5mL,定容至50mL即可。

2.1.00mol/L醋酸溶液100mL

3.0.10mol/L醋酸溶液100mL

4.0.01mol/L醋酸溶液50mL

七、实验操作

取同样规格的试管5支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。

剂蒸储水0.01mol/L醋酸O.lmoLL醋酸1.0mol/L醋酸pH

编号、

(niL)(mL)(mL)(mL)

14.190.31——5.9

24.37—0.13——5.3

34.0——0.5——4.7

42.5——2.0——4.1

53.7——0.83.5

Pl

2)向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL,加一管，摇匀一管。此时1.234.5管的pH

依次为5.9、5.347、4.1.3.5。

观察其混浊度，静置10分钟，再观察其混浊度。最混浊的一管即为酪蛋白的等电点。

实验五酪蛋白的制备

一、目的

学习从牛乳是制备酪蛋白的原理和方法。

二、原理

三、牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物,

等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀

出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。

四、器材

1.离心机2.抽滤装置

3.精密pH试纸或酸度计3.电炉

五、5.烧杯6、温度计

六、试剂与材料

1.牛奶2500mL

2.95%乙醇1200mL

3.无水乙醛1200mL

4.0.2mol/LpH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液3000mL

先配制A液与B液。

A液:0.2mol/L醋酸钠溶液称NaAc.3H2O54.44g,定容至2000mL<>

B液:0.2mol/L醋酸溶液称优级纯醋酸(含量大于99.8%)12.0g定容至1000mL0

取A液1770mL,B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000mLo

5.乙醇-乙醛混合液2000mL

七、乙醇-乙醛=1:1(V/V)

八、操作

1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲溶液

lOOmLo用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7o

将上述悬浮液冷却至室外温。离心15min(3OOOr/min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。

4、2.用水洗沉淀3次,离心lOmin(3000r/min),弃去上清液。

3.在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙

醇■乙醛混合物液洗沉淀2次。最后用乙酸洗沉淀2次，抽干。

将沉淀摊开在表面皿上，风干；得得酪蛋白纯品。

准确称重，计算含量和得率。

含量：酪蛋白g/100mL牛乳(g%)

加南,测得含量

xlOO%

式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。

思考题

制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？

常见的溶剂按极性大小顺序依次排列

水〉甲酸〉廿汕〉二甲基亚碉〉甲醇〉乙醇〉正丙醇,丙酮〉乙醛〉醋酸〉乙酸乙醋〉隹麻油＞乙

醛,氯仿,植物油,四氯化碳,液体石蜡。

实验六蛋白质含量测定和纯度鉴定一双缩胭法

目的

1、掌握双缩胭法定量测定蛋白质含量的原理和方法。

2、学习使用721型分光光度”。

实验原理

尿素在180℃条件下脱氨生成双缩服:

/NH2

c=o

/NH2

2C=ONH+NH3f

\NH

2C=0

\NH2

在碱性溶液中双缩喔与Cu2+作用形成稳定的紫红色络合物，称为双缩腺反应。蛋白质中

的肽键实际上就是酰胺键。凡是具有两个或两个以上的酰胺基，或通过甲叉相连的寡肽、多

肽及蛋白质等，都有双缩胭反应。当Cu2+与蛋白质作用时，存在着严格的定量关系，即一个

Cu2+与四个肽键的N原子络合，络合物溶液颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的

氨基酸组成及分子量无关，故可用比色法测定蛋白质的含量。

A=KCL

三、实验材料

四、双缩胭试剂：CuSO4・5H2O1.5g,酒石酸钾钠1NaKC4H406-4H2O)6.0g,加500ml

蒸储水溶解之，边搅拌边加300ml10%NaOH(10%NaOH配法：将65%-75%的NaOH溶

液放置一定时间，使混入的碳酸钠沉淀，取其透明的上清液稀释之)用水定容至1000ml,

用聚苯乙烯瓶贮存。此试剂可长期保存，为了增加试剂的贮藏性，可加入0.1%的碘化钾,

此时兼有防止析出铜的还原作用。

五、蛋白质标准溶液：配制酪蛋白(10mg/ml)溶液。

六、操作；

制作标准曲线:

按下表加入试剂：123456

试剂

标准酪蛋白溶液(ml)00.40.81.21.62.0

蒸储水(ml)2.01.61.20.80.40

双缩嘛(ml)333333

OD540

蛋白质浓度(mg/ml)00.81.62.43.24

2、上述各管试剂混匀后，室内温静止20〜30min后于540nm处比色，以第一管作为空白

对照管。以蛋白质浓度为横坐标,OD值为纵坐标，作蛋白质与OD的标准由线图。

3、知浓度酪蛋白样品测定:

4、取未知浓度样品1ml,加水补至2ml,再加4ml双缩胭试剂，混匀后，静止20~30min,

于540nm处比色。根据蛋白质与OD标准曲线图，计算样品中酪蛋白的含量。

蛋白纯度鉴定：

纯度（％）=样品中酪蛋白实测量（mg）/添加酪蛋白量（mg）X100%

七、结果与讨论

物理法：射率法、比浊法、放射性同位素法

利用共性凯氏法

蛋白质定量法双缩胭法：比色法

「Lowry法、

利用特定氨基酸残基J紫外法a比色法

I色素结合法,

蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农副产品品质分析、食品营养价值比较、

生化育种、临床诊断等的重要手段。蛋白质定量的意义是：测定或算出一定数量或容量的样

品中所含蛋白质成分的数量。

现有的多种蛋白质定量法，都是根据蛋白质分子的理化性质进行的。这些方法大体可分为利

用蛋白质药共性（含氮最、肽键、折射率等）和利用蛋白质含有特定氨基酸残基（芳香族、

酸性、碱性等）两类。

实验七紫外吸收法测定蛋白质的含量

一、目的要求

1、掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理和操作。

2、了解紫外分光光度计的原理及使用方法。

二、原理

三、由于蛋白质分子结构中具有芳香族氨基酸（如色氨酸、苯丙氨酸和和酪氨酸）残基，因

此，对280nm的紫外光有最大吸收，而且280nm的吸收值与蛋白质溶液的浓度成正比,

可用干蛋白质的定量测定.

四、材料

（一）试剂

标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的蛋白质（酪蛋白或牛血清白蛋白），用蒸馈水

精确稀释成1mg/ml的浓度。

样品液：浓度为lmg/ml左右的酪蛋白溶液（配制2mg/ml）。

（二）器材

五、1.紫外分光光度计；试管；吸管

六、实验方法

1、标准曲线的绘制

取五支试管编号，按下表加下12345

各试剂：

管号

标准蛋白质溶液（ml）01.02.03.04.0

蒸饰水（ml）4.03.()2.01.()0

蛋白质浓度（mg/ml）00.250.50.751.0

2、试剂加完后混匀，在紫外分光光度计上于280nm处测定其0D值，作0D值.蛋白质浓

度曲线。

3、样品测定

七、取待测蛋白质样品1.0ml,加蒸偏水3.0ml在波长280nm处测OD值，从标准曲线上查

其浓度。

八、结果讨论

1、紫外吸收法可测定0.1〜0.5mg/ml的蛋白质溶液，该法迅速、简单，不消耗样品，低浓度

盐类不干扰测定。因比在蛋白质和酶的生化制备中广泛应用，特别是在柱层析分离中,

利用280nm进行紫外检测来判断蛋白质吸附或洗脱情况最常用的方法。

对于测定那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适

于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

核酸在280nm处也有吸收，对蛋白质的测定有干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处,

如同时测定260nm处的吸收值，通过计算就可以消除其对蛋白质测定的影响，不过因不同的

蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过计算校壬，测定结果还存在着一定的误差。

实验八血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳

一、实验目的

二、学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。

三、实验原理

蛋白质是两性电解质，在溶液的pHvpI,带正电荷；pH>pI时，带负电荷。在外电场的作用下,

带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。由于不同蛋白质的分子量不

同，所带的电荷不同，因而在电场中移动的速度也不相同，通过电泳就可以将分子大小不同

的蛋白质分开。

醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。

醋酸纤维薄膜由醋酸纤维素制成（醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化而得，将其溶于有

机溶剂如丙酮、氯仿、氯乙烯、醋酸乙酯等后，涂抹成均一薄膜，即为醋酸纤维素薄膜），它

具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120pm,有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的

支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优

点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白和同工酶的分离及用在免疫电泳

中。

血清中含有数种不同的蛋白质，血清中含有多种蛋白质：有四种球蛋白即Q1球蛋白、a

2球蛋白、B球蛋白、丫球蛋白；一种清蛋白。由于它们的分子量各异，所带电荷不等，因而

在电场中移动速度各不相同，可以利用醋酸纤维薄膜作为支持物进行电泳将它们分开。

血清各蛋白清蛋白ai球蛋白（12球蛋白。球蛋白7球蛋白

质的分子量：

血清组分

分子量（MW）690002000003000009万~15万15.6万

Pl4.645.065.065.126.35〜7.30

四、电泳所用的缓冲溶液是巴比妥缓冲液（pH8.6）,因此各种蛋白质带负电荷，在电场中

向正极移动。

五、器材

1.醋酸纤维薄膜（2X8cm）2.常压电泳仪

3.点样器4、培养皿（染色及漂洗用）

5.粗滤纸6、玻璃板

7、竹镶7、白磁反应板

六、试剂

1.巴比妥缓冲液（pH8.6,离子强度0.07）1000mL

巴比妥2.76g,巴比妥钠15.45g,加水至1000mLo

2.染色液300mL

含氨基黑10B0.5g,甲醇50mL,冰醋酸10mL,水"）mL（可重复作用）。

3.漂洗液2000mL

含甲醇或乙醇45mL、冰醋酸5mL、水50mL

4.透明液300mL

含无水乙醇7份，冰醋酸3份。

七、操作

1、浸泡用镣子取醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光泽面，并在角上用笔做上记

号）放在巴比妥缓冲液中浸泡20分钟。

1）点样把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺

在玻璃板上（无光泽面朝上），将点样器先在放置在白磁反应板上的血清中沾

一下，再在膜条一端2〜3cm处轻轻地水平地落下并随即提起，这样即在膜条上

点上了细条状的血清样品。

2）电泳在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电

泳槽支架的滤纸桥上（先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽

的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。

用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧巾在支架上，即为滤纸桥（它

是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁粗糙面朝下，膜条上点样

的一端靠近负极。盖严电泳室。通电。

3）稳流15min:0.3mA/cm,每一膜条的电流为2X0.3=0.6mA；总电流为：膜条数X

0.6mA；

2、稳压25min：电压至160V,电流强度0.4〜0.6mA/cm膜宽。待电泳区带展开25〜35mm

后关闭电源。

3、染色电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡lOmin.

漂洗将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可

得色带清晰的电泳图谱。

定量测定时可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在体积0.4mol/L氢氧化

钠溶液中半小时，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，在A650nm进行比色。或者

将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2〜3分钟后取出贴于洁净玻璃板上，干后即为

透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。

思考题

1、用醋酸纤维薄膜做电泳支持物有什么优点？

电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？

绘图：蛋白质在薄膜上的位置与形状。

实验九凯氏定氮法测定蛋白质的含量

一、实验目的

掌握凯氏定氮法的基本原理和操作

二、实验原理

凯氏定氮法是分析有机化合物含氮量的常用方法。要测定有机物含氮量，通常是设法使

其转变成

无机氮，再进行测定。

凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等

复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸钺，这一过程称为有机物的消化。为了加速和完全

有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等

试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，除硫酸钾外，也可以加入硫酸

钠、氯化钾等盐类类提高沸点，但效果不如硫酸钾。硫酸铜起催化剂的作用。凯氏定氮法中

可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、铝酸钠等，但考虑到效果、

价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸

钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过

量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3,通过蒸播把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸

接受氨后，形成四硼酸钱，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。滴

定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。在滴定过程中，滴

定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。测定出的含氮量是样品的总氮量,

其中包括有机氮和无机氮。

以蛋白质为例，反应式如下：

消化：蛋白质+H2S04-*(NH4)2S04+S02t+C02t+H20

蒸储：(NH4)2S04+2NaOH-Na2S04+2H20+2NH3t

2NH3+4H热)l(NH,)RO：+5比0

滴定：(NH4)2B4O7+2HC1+5H20f定H4cl+4I13B03

蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量［约在14%~18%,平

均为16%(质量分数)］。凯氏定氮法测定出的含氮量，再乘以系数6.25,即为蛋白质含量。

本法适用于测定0.27.Omg氮的样品测定。

通过本实验使学生能理解凯氏定氮法的原理，掌握凯氏定氮法的操作方法。

三、器材

1.凯氏定氮仪（消化炉、蒸馀仪）一套

2.消化管4支

3.10ml滴定管

4.150nli锥形瓶4个

5.100ml容量瓶2个

四、试剂

1.待测样品

2.无水K2S04

3、硒粉

4.浓硫酸

5、混合指示剂（1%次甲基蓝：1%甲基红=1:1）

6.40%Na0H

7、0.Olmol标准HC1溶液

8、2%硼酸

五、方法和步骤

（-）消化

1.准备2个消化管，标号。2号管作为空白对照，向1号消化管中加入lOOmgBSA,再分

别向1.2号管依次加入混合催化剂（无水硫酸钾:硒粉=3:1）1.0g,硫酸10mL。

2、将加好试剂的消化管放置消化炉上，接好抽气装置。先用微火（200℃）加热煮沸，此

时烧瓶内物质炭化变黑，并产生大量泡沫，务必注意防止气泡冲出管口。待泡沫消失停止产

生后，加大火力（400℃）,保持瓶内液体微沸，至溶液澄清后，再继续加热使消化液微沸

15nlin,以保证样品完全消化，整个过程大约1.5个小时•。消化时放出的气体内含S02,具有

强烈刺激性，因此自始自终应打开抽水泵将气体抽入自来水排出。整个消化过程均应在通风

橱中进行。消化完全后，关闭火焰，使消化管冷却至室温。冷却后，分别将1、2号管的消化

液用100ml容量瓶定容。

（二）蒸储和吸收

蒸储和吸收是在微量凯氏定氮仪内进行的。凯氏定氮蒸储装置种类甚多，大体上都由蒸

气发生、氨的蒸储和氨的吸收三部分组成。

1.仪器的洗涤

仪器安装前，各部件需经一般方法洗涤干净，所用橡皮管、塞须浸在10%Na0H溶液中，煮约

lOmin,水洗、水煮lOmin,再水洗数次，然后安装并固定在一只铁架台匕

仪器使用前,微量全部管道都须经水蒸气洗涤，以除去管道内可能残留的氨，正在使用的仪

器，每次测样前，蒸气洗涤5min即可。较长时间未使用的仪器，重复蒸气洗涤，不得少于三

次，并检查仪器是否正常。仔细检查各个连接处，保证不漏气。

首先在蒸气发生器（消化管）加2/3体积蒸镭水，加入数滴硫酸使其保持酸性，以避免

水中的氨被蒸出而影响结果。打开蒸汽开关，连续蒸煮5min,进行管道冲洗，如此清洗2〜3

次，再在冷凝管下换放一个盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶使冷凝管下口完全浸没在溶液

中，蒸锵1〜2min,观察锥形瓶内的溶液是否变色。如不变色，表示蒸储装置内部已洗干净。

移去锥形瓶，再蒸储1〜2min,用蒸储水冲洗冷凝器下口，关闭蒸汽开关，仪器即可供测样

品使用。

2.样品的蒸储吸收

由于定氮操作繁琐，为了熟悉蒸