实验九酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究

实验九酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究

本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶,

并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。

自1860年Bertholel从酒酵母SacchacomycesCerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它LL

被广泛地进行了研究。蔗糖酶(invertase)((一D—吠喃果糖昔果糖水解酶)

(fructofuranosidefructohydrolase)(EC.3.2.1.26)特异地催化非还原糖中的(一吠喃果糖

昔键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉予糖

水解，生成密二糖和果糖。

本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧,

在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖幅(externalyeastinvertase),其活力占蔗糖前活力

的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖醉

（internalyeastinvertase）,含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两

种形式的幽的氨基酸组成不同，外附每个亚基比内联多两个氨基酸，Ser和Mei,它们的

分子量也不同，外酶约为27万（或22万，与酵母的来源有关），内酶约为13.5万。尽管这

两种能在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实

验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外

瓯

两种随的性质对照表如下：

一

一

底

物

底

物

等

蔗

电

为

为

名糖含棉最适稳定最适

的

子

点

糖

称Mw量亚基糖PHPH温度

的

P范围

KmK.„

外

27万50%双26mM1505.04.9(3.53.0〜60℃

酶

（22万）mM〜5.5)7.5

内13.5<3%双25mM1504.5(3.56.0〜

酣万mM〜5.5)9.0

实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定

的实验条件下，每分钟H解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每亳克蛋白质的

活力单位数。

本实验共有九个分实验：

一、蔗糖酶的提取与部分纯化

二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶

三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定

四、反应时间对产物形成的影响

五、pH对酶活性的影响和最适pH的测定

六、温度对酶活性的影响和反应活化能的测定

七、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数Km和最大反应速度Vgx的测定

八、尿素（服）抑制蔗糖酶的实验

九、棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验

（-）蔗糖酶的提取与部分纯化

一、实验目的：

学习酶的纯化方法.并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。

二、试剂：

.1.啤酒酵母

.2.二氧化硅

.3.甲苯（使用前预冷到0C以下）

.4.去离子水（使用前冷至4c左右）

.5.冰块、食盐

.6.1N乙酸

.7.95%乙醇

三、仪器：

.1.研钵1个

.2.离心管3个

.3.滴管3个

.4.量筒50m.i个

5水浴锅1个

.6.恒温水浴

.7.烧杯l（）0m.2个

.8.广泛pH试纸

・9.高速冷冻离心机

四、操作步骤：

.1.提取

（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。

（2）称取5g干啤酒酵母和20g湿啤酒酵母，称20mg蜗牛酶及适量（约10g）二氧化

硅，放入研钵中。二氧化硅要予先研细。

（3）量取预冷的甲苯30ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60分钟。研磨

时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。

（4）缓慢加入预冷的40ml去离子水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用30分钟。

以便将蔗糖酶充分转入水相。

（5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4℃,lOOOOrpm,

lOmino如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。

（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃,

10OOOrpm,离心lOmin。

（7）将清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入

清洁离心管中。

（8）用广泛pH试纸检查清液pH,用1N乙酸将pH调至5.0,称为“粗级分I”。

.2.热处理

（1）予先将恒温水浴调到50℃,将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中,50℃下

保温30分钟，在保温过程中不断轻描离心管。

（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4C,lOOOOipm,离心10min。

（3）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为“热

级分H"）。

洗至中性。碱洗时因过滤困难，可以先浮选除去细颗粒，抽干后用0.5mol/LNaOH

-0.5mol/LNaCl溶液处理，然后水洗至中性。

3.装柱与平衡：

4.先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02mol/LpH7.3Tris-HCI缓冲液洗纤维素

几次，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的

电导率与缓冲液相同或接近时即可上样。

上样与洗脱：

上样前先准备好梯度洗脱液，木实验采用20ml0.02MpH7.3的Tris-HCl缓冲液和

20ml含0.2M浓度NaCI的0.02mol/LpH7.3的Tris-HCl缓冲液，进行线性梯度洗脱。取

两个相同直径的50ml小烧杯，一个装20ml含NaCI的高离子强度溶液，另一个装入20ml

低离子强度溶液，放在磁力搅拌器上，在低离子强度溶液的烧杯内放入一个小搅拌子

（在细塑料管内放入一小段铁丝，两端用酒精灯加热封口），将此烧杯置于搅拌器旋转

磁铁的上方。将玻璃三通插入两个烧杯中，上端接一段乳胶管，夹上止水夹，用吸耳球小

心地将溶液吸入三通（轻轻松一下止水夹），立即夹紧乳胶管，使两烧杯溶液形成连通,

注意两个烧杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。

用5ml0.02mol/LpH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解醇级分HI,（注意玻璃搅棒头必

须烧园、搅拌溶解时不可将离心管划伤）,若溶液混浊，则用小试管,4000rpm离心除去

不溶物。取1.5ml上清液（即醉级分HI样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量），将

剩余的3.5ml清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，注意要从上样开始使用部分收

集器收集，每管2.5~3.0ml/10min。上样后用缓冲液洗两次，然后再用约20ml缓冲液洗去

柱中未吸附的蛋白质，至A280降到0』以卜；夹住层析柱出口，将恒流泵入II的细塑料

导管放入不含NaCI的低离子强度溶液的小烧杯中，用胶布固定塑料管，接好层析柱，打

开磁力搅拌器，放开层析柱出口，开始梯度洗脱，连馍收集洗脱液，两个小烧杯中的洗

脱液用尽后，为洗脱充分，也可将所配制的剩余30ml高离子强度洗脱液倒入小烧杯继

续洗脱，控制流速2.5~3.0ml/10min。

测定每管洗脱液的A&U光吸收值和电导率。（使用DJS-IO电导电极）

测定不含NaCI的0.02mol/LpH7.3Tris-HCl缓冲液和含0.2mol/L浓度NaCI的

0.02mol/LpH7.3Tris-HCl缓冲液的电导率，用电导率与NaCI浓度作图，利用此图将每管

所测电导率换算成NaCI浓度，并利用此曲线估计出蔗糖酶活性峰洗出时的NaCI浓度。

.4.各管洗脱液酶活力的定性测定

在点滴板上每一孔内，加一滴0.2mol/LpH4.9的乙酸缓冲液，一滴。5moi/L蔗糖和

一滴洗脱液，反应5分钟，在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸，10〜20min后观察试纸

颜色的变化。用“+”号的数目，表示颜色的深浅，即各管随活力的大小。合并活性最高

的2〜3管，量出总体积，并将其分成10份，分别倒入10个小试管，用保鲜膜封口，冰冻

保存，使用时取出一管。此即“柱级分IV”。

注意：从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附

物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。

在同一张图上画出所有管的酶活力,NaCI浓度（可用电导率代替）和光吸收值A280

的曲线和洗脱梯度线。

（三）蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定

一、实验目的

掌握蔗糖酶活性测定方法，了解各级分酶的纯化情况。

二、原理

为r评价酶的纯化步骤和方法，必须测定各级分酶活性和比活。

测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、Nelson's试剂法、水杨酸试剂法等，本

实验先使用费林试剂法，以后测米氏常数Km和最大反应速度Vmax时再用NelsonJs

试剂法。

费林试剂法灵敏度较高，但数据波动较大，因为反应后溶液的颜色随时间会有变化，因

此加样和测定光吸收值时最好能计时。其原理是在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解、

生成一分子葡萄糖和一分子果糖•这些具有还原性的糖与碱性铜试剂混合加热后被氧化,

二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀，氧化亚铜与磷相酸作用，生成兰色溶液，其兰色

深度与还原糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。

三、试剂

.1.碱性铜试剂（用毕回收）

称10g无水NaCO3,加入100ml去离子水溶解，另称1.88g酒石酸，用100ml去离子

水溶解，混合二溶液，再加入1.13克结晶CuSO4,溶解后定容到250ml。

.2.磷铜酸试剂（用毕回收）

在烧杯内加入铝酸17.5g,鸨酸钠2.5g,10%NaOH100ml.去离子水100ml,混合后

煮沸约30min（小心不要蒸干），驱大铝酸中存在的氨，直到无氨味为止，冷却后加85%

磷酸63mL混合并稀释到250ml。

30.25%苯甲酸200ml,配葡萄糖用，防止时间长溶液长菌，也可以用去离子水代替。

.4.葡萄糖标准溶液：

（1）贮液：精确称取无水他萄糖（应在105℃恒重过）0.1802克，以0.25%苯甲酸溶

液溶解后，定容到100ml容量瓶中（浓度lOmmol/Do

（2）操作溶液：用移液管取贮液10ml,置于50ml容量瓶中,以用0.25%苯甲酸或去

离子水稀释至刻度（浓度为2mmol/L）。

.5.0.2mol/L蔗糖溶液50ml,分装于小试管中冰冻保存，因蔗糖极易水解，用时取出一管

化冻后摇匀。

.6.0.2mol/L乙酸缓冲液,pH4.9,200mL

.7.牛血清清蛋白标准蛋白质溶液（浓度范围：200-5CO（g/ml,精确配制50ml）。

.8.考马斯亮兰G-250染料试剂，lOOmg考马斯亮兰G-25O全溶于50m.95%乙醇后，加入

120m.85%磷酸，用去离子水稀释到IL（公用）。

四、仪器

.1.试管20支，试管架I个

.2.秒表1块，或用手表。

.3.移液管:0.1、0.2、2.0、5.0ml

.4.塑料可见比色杯（杯上和器皿染色后可用少量95.的乙醉荡洗）

・5.水浴锅

.6.电炉

.7.保鲜.

8橡皮筋

五、各级分蛋白质含量的测定

采用考马斯亮兰染料法（Bradford法）的微晶法测定蛋白质含品，参见实验一“蛋

白质含量的测定法”（因Tris会干扰Lowry法的测定）。标准蛋白的取样量为

01.0.2.03.04.05.06.08、1.0ml,用去离子水补足到1.0mL

各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数，并详细记录稀释倍数的计算（使用移液

管和量筒稀释）。下列稀释倍数仅供参考：

粗级分I:10〜50倍

热级分n：io〜50倍

醇级分III:10〜50倍

柱级分IV:不稀释

确定了稀释倍数后，每个级分取3个不同体积的样进行测定，然后取平均值，计算

出各级分蛋白质浓度。

六、级分I、H、HI蔗糖酶活性测定

用0.02mol/LpH4.9乙酸缓冲液（也可以用pH5〜6的去离子水代替）稀释各级分施

液，试测出测酶活合适的稀释倍数：

1:100070000倍

II:1000〜10000倍

III:1000〜10000倍

以上稀释倍数仅供参考。

按“表1”的顺序在试管中加入各试剂，进行测定，为简化操作可取消保鲜膜封口,

沸水浴加热改为用90〜95℃水浴加热8〜lOmin。

七、柱级分IV酶活力的测定

.1.酶活力的测定参照“表1”设计一个表格，反应混合物仍为1mL

.2.第1管仍为蔗糖对照,9、10管为葡萄糖的空白与标准，与“表1”中的11.12管相同。

.3.2〜7管加入柱级分IV（取样前先试测出合适的稀释倍数），分别为O.O.ml、O.O.ml、

O..ml>O..ml>0..ml和0.6ml,然后各加0.2ml乙酸缓冲液（0.2mol/.pH4.9）,每管用去离

子水补充到0.8mlo

.4.1-7管各加入0..m.0.2mol/L的蔗糖，每管由加入蔗糖开始计时，室温下准确反应

lOmin,立即加入1ml碱性铜试剂中止反应，然后按“表1”中的步骤进行测定。

.5.第8管为0时间对照，与第7管相同，只是在加入O.2ml蔗糖之前，先加入碱性铜试剂,

防止酶解作用。此管只用于观察，不进行计算。

.6.计算柱级分IV的酶活力.UniL.ml原始溶液。

7以每分钟生成的还原糖的（moles数为纵座标，以试管中1ml反应混合物中的酶浓度

（mg蛋白/ml）为横座标，画出反应速度与酶浓度的关系曲线。

表1级分I、II、III的酶活力测定

各管名称f对照粗级分I热级分II醇级分川葡萄糖

管数f123456789101112

酶液（ml）0.00.050.200.500.050.200.500.050.200.50//

H2O(inl)0.60.550.400.100.050.200.100.550.400.101.00.8

乙酸缓冲液0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2/

(0.2mol/LpH4.9)

葡萄糖2mmol/L///////////0.2

蔗糖0.2mol/L0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2//

加入蔗糖，立即摇匀开始计时,室温准确反应lOmin后，立即加碱性铜

试剂中止反应~

碱性铜试剂1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0

用保鲜膜封口，扎眼，沸水浴加热8min,立即用自来水冷却。

磷铝酸试剂1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0

H2O5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0

A650nm

E'=umol/min-ml

平均E，

Umol/min,ml

Units/ml原始绢

分

稀释后酶液的活力（按还原糖计算）：

式中：A650——第2~10管所测A650

A%。一第12管所测A65o

0.2—第12管葡萄糖取样量

2------标准葡萄糖浓度2mmol/L=2Pmol/ml

10------反应lOmin

B—每管加入酶液ml数

原始防液的睡活力E=（平均E，⑵义稀释倍数（Urits/ml原始组分）

八、计算各级分的比活力，纯化倍数及回收率，并将数据列于下表：

为了测定和计算下面纯化表中的各项数据，对各个级分都必须取样，每取一次样，芯于

下一级分来说会损失一部分量，因而要对下一个级分的体积进行校正，以使回收率的计

算不致受到不利的影响。

酶

记录校正蛋白质总蛋白Units/总比活回

的

体积体积(mg/ml)(mg)mlUnitsUnits/收

纯

(ml)(ml)mg率％

化

表

如

下

：

级

分

I1.0100

11

III

IV

［注］:•个酶活力单位Units,是在给定的实验条件下，每分钟能催化l(mole蔗糖水解

所需的能量，而水解l(mole蔗糖则生成2(moles还原机计算时请注意。

下面是对假定的各级分记录体积进行校正计算的方法和结果：

记录体积取样体积校正后体积

级分ml核正体积计算mlml

I15151.515.00

II13.513.5X(15/13.5)1.515.00

III55X(15/13.5)X(13.5/12)1.56.25

N66X(15/13.5)X(13.5/12)X(5/3.5)—10.71

(四)反应时间对产物形成的影响

酶的动力学性质分析，是酶学研究的重要方面。下面将通过一系列实验，研完pH、

温度和不同的抑制剂对蔗糖酹活性的影响，测定蔗糖的的最适pH、最适温度、蔗糖酹催

化反应的活化能，测定米氏常数Km、最大反应速度Vmax和各种抑制剂常数KI,由此

掌握酶动力学性质分析的一般实验方法。

本实验是以蔗糖为底物，测定蔗糖酶与底物反应的时间进程曲线，即在酶反应的最

适条件下：每间隔一定的时间测定产物的生成量，然后以酸反应时间为横座标，产物生

成量为纵座标，画出酹反应的时间进程曲线，由该曲线可以看出，曲线的起始部分在某

一段时间范围内呈直线，其斜率代表酶反应的初速度。随着反应时间的延长，曲线斜率

不断减小，说明反应速度逐渐降低，这可能是因为底物浓度降低和产物浓度增高而使逆

反应加强等原因所致，因此测定准确的酶活力，必须在进程曲线的初速度时间范围人进

行，测定这一曲线和初速度的时间范围，是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基

础。

实验方法见“表2”：

.1.准备12支试管，按“表2”进行测定。用反应时间为。的第一管作空白对照，此试管

要先加碱性铜试剂后加酶。第10支试管是校正蔗糖的酸水解用第11管作为对照，测

定第12管葡萄糖标准的光吸收值，用以计算第2〜9各测定管所生成还原糖的“(moles”

数。

.2.“表2”中底物蔗糖的量为每管0.2.(moles,全部反应后可产生0.5(moles的还原糖，

所有的蔗糖和酶浓度应使底物在20min内基本反应完c

3画出生成的还原糖的(moles数(即产物浓度(moles/ml)与反应时间的关系曲线，即反

应的时间进程曲线，求出反应的初速度。

表2反应时间对产物浓度的影响

管数一123456789101112

2.5mmol/L蔗糖0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1//

乙酸缓冲液0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2//

H2O0.40.40.40.40.40.40.40.40.40.71.00.8

葡萄糖2mmol/L///////////0.2

碱性铜试剂1.0///////////

由加酶开始计时

蔗糖悔(~1:5)0.30.30.30.30.30.30.30.30.3///

反应时间min0134812203040

反应到时后立即向“2〜12”管加入1ml碱性铜试剂中止反应

碱性铜试剂/1.01.01.01.01.0101.01.01.01.01.0

盖薄膜，扎孔，沸水浴上煮8min后速冷

磷铝酸试剂1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0

H2O5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0

测定A650

生成还原糖的

pmolcs数

（五）pH对蔗糖酶活动性的影响

酶的生物学特性之•是它对酸碱度的敏感性，这表现在酶的活性和稳定性易受环境

pH的影响。

pH对酶的活性的影响极为显著，通常各种酶只在一定的pH范围内才表现出活性,

同一种酶在不同的pH值下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH值称为酶的最适

pHo各种酶在特定条件下都有它各自的最适pH。在进行酶学研究时一般都要制作一条

pH与防活性的关系曲线，即保持其它条件恒定，在不同pH条件下测定防促反应速度,

以pH值为横座标，反应速度为纵座标作图。由此曲线，不仅可以了解反应速度随pH值

变化的情况，而且可以求得酶的最适PH。

酶溶液pH值之所以会影响酶的活性，很可能是因为它改变了酶活性部位有关基团

的解离状态，而陋只有处于一种特殊的解离形式时才具有活性，例如：

H+H+

+-

EH2+AEHAE

pKai（有活性）pKa2

酶的活性部位有关基团的解离形式如果发生变化，都将使海转入“无活性”状态。在最

适pH时，酶分子上活性基团的解禽状态最适合于酶与底物的作用。此外，缓冲系统的高

子性质和离子强度也会对酶的催化反应产生影响。

蔗糖前有两组离子化活性基团，它们均影响防水解蔗糖的能力。其解离常数分别是pKa

=7和pKa=3o

I.实验方法:

按下表缓冲试剂体枳ml缓冲试剂体积ml

配制12

种缓冲

溶液

（公

用）：

将两

种缓冲

试剂混

合后总

体积均

为10ml,

其溶液

pH值以

酸度计

测量值

为准。

溶液pH

2.50.2mol/L磷酸氢二钠2.()00.2mol/L柠檬酸8.00

3.0O.2niol/L磷酸氢二钠3.650.2mol/L柠檬酸6.35

3.50.2mol/L磷酸氢二钠4.850.2mol/L柠檬酸5.15

3.50.2mol/L乙酸钠0.600.2mGl/L乙酸9.40

4.00.2moI/L乙酸钠1.800.2mol/L乙酸8.20

4.50.2mol/L乙酸钠4.300.2mol/L乙酸5.70

5.00.2mol/L乙酸钠7.000.2mol/L乙酸3.00

5.50.2mol/L乙酸钠8.800.2mol/L乙酸1.20

6.00.2mol/L乙酸钠9.500.2mol/L乙酸0.50

6.00.2mol/L磷酸氢二钠1.230.2mol/L磷酸二氢钠8.77

6.50.2mol/L磷酸氢二钠3.150.2mol/L磷酸二氢钠6.85

7.00.2mol/L磷酸氢二钠6.100.2mol/L磷酸二氢钠3.90

.2.准备二组各12支试管，第一组12支试管每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，然

后加入一定量的蔗糖酶1此时的蔗糖酶只能用H2O稀释，酶的稀释倍数和加入量要选择

适当，以便在当时的实验条件下能得到0.6~1.0的光吸收值（A650））。另一组12支试管

也是每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，但不再加酶而加入等量的去离子水，分别

作为测定时的空白对照管。所有的试管都用水补足到0.8mL

.3.所有的试管按一定时间间隔加入0.2ml蔗糖（0.2mol/L）开始反应，反应10min后分别

加入1.0ml碱性铜试剂，用保鲜膜包住试管口并剌-小孔，在沸水浴中煮8分钟，取出速

冷，分别加入1.0ml磷钥酸试剂，反应完毕后加入5.0m1水，摇匀测定A650。

.4.本实验再准备二支试管，一支用水作空白对照；另一支作葡曲糖标准管。

.5.画出不同pH下蔗糖酹活性（（moles/min）与pH的关系曲线，注意画出pH值相同，

而离子不同的两点，观察不同离子对酶活性的影响。

（六）温度对酶活性的影响和反应活化能的测定

对温度的敏感性是酶的又一个重要特性。温度对酶的作用具有双重影响，一方

面温度升高会加速酶反应速度：另一方面又会加速酷蛋白的变性速度，因此，在较低的

温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大，但是超过一定温度后，反应速度反而下降。

酶反应速度达到最大时的温度称为酶反应的最适温度。如果保持其它反应条件恒定，在

一系列不同的温度下测定酹活力，即可得到温度〜陋活性曲线，并得到酶反应的最足温

度。最适温度不是i个恒定的数值，它与反应条件有关。例如反应时间延长，最适温度

将降低。大多数酹在60C以上变性失活，个别的前可以耐IOOC左右的高温。本实验除

门则定蔗糖酶催化蔗糖水解反应的热稳定温度范围与最适温度外，还可以同时测定反应

的活化能。活化能越低，反应速度就越快。酶作为催化剂可以大大降低反应的活化能，从

而大大增加反应的速度,本实验除了测定蔗糖酶催化反应的活化能外，还要测定酸催化

这一反应的活化能，后者比前者要大的多，说明酸催化的能力远不及蔗糖酶。

活化能可用阿累尼乌斯方程式计算：

,.Ea1.

InK=------x——FA

RT

式中：Ea为话化能（Cal/mole）,k为反应速度菖'数（（moles/min）,R为气体常数

（1.987Cal/deg.mole）,T为绝对温度（C+273）,人为常数。

本实验中的速度常数“k”，可以直接用所测定的吸光度值或反应速度v代替，进行

作图和计算，请对此进行推导和论证（提示：蔗糖酶催化蔗糖底物水解的反应是一级反

应）。

实验方法：

本实验要测定o℃iio（rc,之间16个不同温度下蔗糖酶催化和酸催化的反应速度。这

16个温度是冰水浴的0C,室温（约20℃）,沸水浴的10（）℃和13个水浴温度：1（）℃、

30℃、40℃、50C、55C、60℃、65℃、70℃>75℃、80℃、85℃、90℃、

95℃。

每个温度准备2支试管，一支加酶，测酶催化，1支不加，以乙酸缓冲液作为酸，测

酸催化。

.1.确定酶的稀释倍数，试管中加入0.2m.0.2moi/.pH4.9的乙酸缓冲液,0.2ml稀释的酶，加

水至0.8m.加入0.2m.0.2mol/L的蔗糖开始计时，在室温下反应lOmin,仍用费林试剂法

进行测定，须得到0.2〜0.3A的吸光度,准备一个水的空白对照管（0.8ml去离子水加

0.2m.0.2moi/L的蔗糖），用于测定所有的样品管。

.2.测定上列各个温度下的反应速度，每次用2支试管，均加入0.2ml乙酸缓冲液，一支

加0.2ml酶，另一支不加酶，均用水调至0.8ml,放入水浴温度下使反应物平衡30秒，

加入0.2mol/L蔗糖0.2ml,准确反应10分钟，立即加入1.0ml碱性铜试剂中止反应，按

规定进行操作，测定各管A650值，记录每个水浴的准确温度。

3酶催化的各管A65.值均进行酸催化的校正。用分别画出酶催化和酸催化的反应速度对

温度的关系曲线和lnk-1/T的关系曲线，用二条Ink〜1/T关系曲线的线性部分计算两

种活化能。

（文献值：蔗糖能催化蔗糖水解的活化能为:Ea=8000Cal/moIc

酸催化蔗糖水解的活化能为:Ea=25000Cal/mole）

.4.计算温度系数Q10,即温度每升高10℃,反应速度提高的倍数：

八V（T+10）k（T+10）

Qio=-----------g-----------

Vrkr

请推导计算公式：

10xEa

InQ\o=

Rx7x(7+10)

（七）底物浓度对催化反应速度的影响及来米氏常数（和最大反

应速度V皿的测定

根据Michaclis-Mcntcn方程:

V.nax[S]

v=

K,,,+[S]

可以得到Lineweav?r-Burk双倒数值线方程:

111

-=---x---4----

VV,nax[S]Vmax

在l/v纵轴上的截距是1/Vmax,在1/[S]横轴上的截距是一1/Km。

测定Km和Vmax,特别是测定Km,是酶学研究的基本内容之一，Km是酶的一个

基本的特性常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质，特别是同•种酶能够作用于几

种不同的底物时，米氏菖数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力强弱，Km值越大,

说明酶与底物的亲和力越弱，反之,Km值越小，酶与底物的亲和力越强。

双倒数作图法应用最广泛，其优点是：①可以精确地测定Km和Vmax；②根据

是否偏离线性很容易看出反应是否违反Michaelis-Menten动力学；③可以较容易地分

析各种抑制剂的影响。此作法的缺点是实验点不均匀,V小时误差很大。为此，建议采用

一种新的Eisenthal直线作图法，即将Michaelis-Menten方程改变为：

作图时，在纵轴和横轴上截取每对实验值:VI〜[S]I；V2〜[S]2；V3〜[S]3;

——连接诸二截点，得多条直线相交于一点，由此点即可得Km和Vmax。

此作图法的优点是：①不用作双倒数计算；②很容易识别出那些不正确的测定结

果。

还可以用Hanes方程进行作图，斜率是1/Vmax,截距分别是一Km和

Km/Vmax:

实验方法：

.1.本实验和下一个实验均采.Nelson's法分析反应产物还原糖，Nelson's法的试剂配制见

本实验最后.页的“试剂配制方法”。因为使用了剧毒药品，操作必须十分仔细小心！为

了掌握Nelson、法测定的范围，可先作一条标准曲线。按下面的“表3”进行实验操作：

Eisenthal直线作图法：

表3Nelson、法测定葡萄糖的标准曲线

2345678910

葡萄糖(4mmol/L)/0.020.050.100.150200.250.30//

果糖(4mmol/L)////////0.20/

蔗糖(4mmol/L)/////////0.20

HO1.00.980.950.900.850.800.750.700.800.80

21.0>

Nelson's试剂

盖薄膜，扎孔，沸水浴中煮20min后速冷

神试剂1.0----------------------------------------------------------------------------►

充分混合，除气泡，放置5min

HO7.0----------------------------------------------------------------------------►

2旋涡混合器上充分混合

每管中糖的

Nmoles数

A510

用第1管作空白对照，测定其余各管510nm的吸光度A510。用A510值对还原糖

的（mole数作图。

.2.按下面的“表4”测定不同底物浓度对催化速度的影响。（表4见下页）

为使Km测掂，必须先加蔗糖，精确移液，准确计时，每隔30秒钟或I分钟加酿一

次，加酶后要摇动一下试管，每支试管都要保证准确反应10分钟，然后加1.0mlNelson's

试剂，立即用保鲜膜盖住管口，绕上橡皮筋，用针剌一小孔，几根试管用一根橡皮筋套

住放入沸水浴，煮20分钟后取出放入冷水中速冷。加碎试剂时移液管身不要接触试管

壁。最后加7.0mlH2O以后，要充分摇匀，必要时可用一小块保鲜腴盖住管口，反复倒转

试管，混匀。用塑料比色杯测定时，空白对照管溶液必须充分摇匀，彻底除去气泡，测

A510值时要检查参比杯内壁上是否有气泡，若有，须倒回原试管，再摇动除去残余气

泡。

实验中不允许用嘴吸伸试剂。实验完毕后要注意洗手。

.3.第9、10二管是先加中止反应的Nelson1试剂，后加悔，以保证加防后不再产生任何

还原糖，用以校正蔗糖试剂本身的水解和酸水解。用.9、10二管的数据画一直线，求出

其他各管的校正数据，对所测各管的A510值进行校正，然后计算每管的［S］,V和

1/Vo

.4.画出反应速度V与底物浓度［S.的关系图，（米氏曲线）和1/V〜1/［S］双倒数关系图，（不

要直接用A5I0值作图），计算Km和Vmax,并与文献值进行比较。

表4底物浓度时能催化反应速度的影响（Km和Vmax测定表）

管数一123456789101112

0.5mol/L/0.020.030.040.060.080.100.200.100.20//

蔗糖

H2O0.60.580.570.560.540.520.500.400.500.401.00.8

乙酸

0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2//

缓冲液

Nelson's

试剂////////1.01.0//

*蔗糖睡0.2().20.20.20.20.20.20.20.20.2//

葡萄糖

4mmol/L///////////0.2

由加酶开始准确计时，反应lOmino

Nelson's

试剂1.01.01.01.01.01.01.01.0//1.01.0

盖薄膜，扎孔，沸水浴中煮20min后速冷

神试剂1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0

充分混合，除气泡，放置5min

H2O7.07.07.07.07.07.07.07.07.07.07.07.0

旋涡混合器上充分混合

A510

校正值

校正后

Asio

[S]

1/[S]

V

I/V

*：表4中酶的稀释倍数需仔细试测，使第2管的A5I0值达到0.2~0.3,以便能同时

适用「下面的眼抑制实验。

催化反应速度的计算：

Asio（校正）x0.2乂4

V=---------------------------

A'siox10x2

V:每ml反应液，每min消耗掉的蔗糖底物的Mmol数

A'510:第12管的吸光度值，以II管为参比

0.2X4:4Pmol/ml葡萄糖取0.2ml

10:反应lOmin

2:每umol蔗糖水解成2umol还原糖

（A）尿素（服）抑制蔗糖酶的实验

抑制剂与醉的活性部位结合，改变了酶活性部位的结构或性质，引起酶活力下降。

根据抑制剂与酶给合的恃点可分为可逆与不可逆抑制剂。可逆抑制剂与酶是通过共价健

结合，不能用透析等物理方法解除。这二种抑制剂类型可以通过实验进行判断。实验方

法为：在固定抑制浓度的情况下，用一系列不同浓度的酶与抑制剂结合，并测定反应速

度。以反应速度对酷浓度作图，根据曲线的特征即可判断之。如卜图所示：

在可逆抑制类型中可分为竞争性抑制，非竞争性抑制和反竞争性抑制三种：

.1.竞争性抑制：

在竞争性抑制中，酶既可以与底物结合，又可以与抑制剂结合，但却不能与二

者同时结合，即有ES和EI,而不存在ESI。其动力学特征是表观值Km，增加，而最大反

应速度Vmax不变，公式为:

表观米氏常数Km'为：

已知抑制剂浓度[I],由斜率计算出抑制剂常数KI,即可算出表观米氏常数Km'。

.2.非竞争性抑制:

在非竞争性抑制中，酶可以与底物和抑制剂同时结合，形成EIS,但EIS不能进一步

转变为产物.其动力学恃征是Vmax降低而Km不变，公式为：

表观最大反应速度Vmax'为：

己知[I],由斜率计算出K1,即可计算出表观Vmax'。

实验方法：

.1.判断可逆与不可逆抑制的实验可选做。

.2.不含抑制剂（服）的实验，可用实验（七）的数据，但必须是用同一稀释倍数的两，也

可以重做，注意酶浓度要大些。

.3.含腺抑制剂的实脸可参照“表4”设计实险方案。共做三种抑制剂浓.11.的实脸，即分

别为加4mol/L的朦0.10m.、0.20m.和0.30ml,（注意：此时要分别少加H2.0.1m.、

0.2ml.0.3ml）,仍为12支试管，每支试管都要加服,第9、10两管仍为校正酸水解。第

11、12标准管也要加腺，以消除腺对显色的影响。

.4.画出反应速度与底物浓度的关系图，和关系图，计算Km、Vma.sKI和相应

的表观值，讨论版对蔗糖能活性的影响。

（九）棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验

棉子糖是一种非还原性三糖，与蔗糖有相似的结构：

蔗糖酶水解棉子糖，可得到双糖（密二糖）和单糖（果糖），果糖是还原糖。棉子

糖水解的速度可以用所生成的还原糖来进行测定，由于本实验是要测定棉子糖和果糖对

蔗糖陋水解蔗糖的抑制作用，为了排除果糖的干扰，就要选用一种专一地特异性测定葡

蜀糖的方法，本实验采月葡萄糖氧化酶法来测定反应中生成的葡萄糖。这一方法的反应

如下：

葡蜀糖氧化酶

Glucose+H2O------------------------H2O2+Gluconicacid

GlucoseOxidase

过氧化物IW

H2O2+o—Dianiside+H+------------------H2O+Yellowpigment

(Reduceddye)Peroxidase(Oxidizeddye)

邻联茴香胺黄色色素

反应生成的黄色色素与葡萄糖含鼠成正比，用分光光度法测定420nm的吸光度值

A420。

葡萄糖氧化酶试剂的配制方法为：

溶液A:40mg辣根史氧化物酶（存于冰冻格）溶于100（）mlO.lmol/LpH7.0的磷酸钠

缓冲液，加1500单位葡萄糖氧化酶（每组学生150mli（当日新鲜配制）（教师配）

溶液溶解0.66go-DianisidediHCI邻联茴香胺染料于100mlH2O中（先用少量冰

乙酸溶解后再加H2O）,置于棕色瓶冷藏。不可接触皮肤，是致癌物（教师配）。

使用时取“溶液A"100ml加“溶液B”1ml。（称G-O试剂）

表5葡萄糖氧化语法测定匍萄糖的标准曲线

1234567

葡萄糖(2mmol/L)/0.050.100.200.300.500.60

1.00.950.900.800.700.500.40

H2O

G-O试剂4.04.04.04.04.04.04.0

混合，室温下每管准确反应15min

4NIIC10.10.10.10.10.10.10.1

混合，至少放置5min

混合，至少放置5min

A420

葡萄糖jimoles数

表6抑制剂（棉子糖与果糖）对酶活性的影响

12345678910

（空白）（校正）

0.5mol/L蔗糖/0.020.040.060.100.130.150.200.100.20

0.70.680.660.640.600.570.550.500.700.60

H2O