生物技术制药及名词解释

生物技术制药

第一章绪论

药学一级学科分类：药物化学、药剂学、药理学、药物分析、生药学及微生物与生化药学二级学科

★生物技术与生物技术药物的概念

生物技术药物的分类

＞按用途分类：治疗药物、防止药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放

射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片)

♦按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药

物、RNA干扰(RNAi)药物、基因治疗药物

按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG)化多肽或蛋白质药物

★生物技术药物的特性

♦理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差

♦药理学作用特性：活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、

可产生免疫原性

+生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目的产物的杂质、制备工艺条件

温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染

质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定(原液、半成品及成品

检定等等)

第二章基因工程制药

蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性

临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给

药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性(一般不进行常规的遗传毒性实验)；药代动力学

真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响

基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH

基因工程药物的缺陷：生物运用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性

基因工程菌的修饰改造方法：构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰（减少免疫原性、增长水溶性、延长

tl/2）

基因工程制药基本环节

♦上游阶段：制备目的基因-构建重组质粒f构建工程细胞

下游阶段：培养工程细胞一分离纯叱产物―除菌一半成品、成品检定一包装

>基本工具：目的基因、各种酶（切割酶、连接酶、修饰酶等）、载体、宿主细胞

>酶切结果：5'粘性末端、3,粘性末端、平头末端

>1U核酸内切酶的酶活性：指在最佳反映条件下反映1小时，完全水解Img标准DNA所需的酶量

♦影响限制性内切酶反映的因素：

♦DNA样品的纯度：

♦DNA的甲基化限度：核酸限制性内切酶不可以切割甲基化的核苗酸序列。在基因克隆中要使用甲基化

酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA。

♦酶切反映的温度

♦DNA的分子结构

♦反映缓冲液组成

♦反映时间、反映体积等

>工具酶

•核酸限制性内切酶：辨认、水解外源的双链DNA分子上特定的核昔酸序列。重要存在于原核微生

物中。

同裂酶：指来源不同，辨认序列相同的酶；进行同样的切割，产生相同的末端

♦同尾酶：来源不同，辨认序列不同，但产生相同的粘性末端

♦DNA甲基化酶：具有宿主专一性,对宿主自身DNA上特定核昔酸进行甲基化修饰,避免被自身限制性内

切酶水解

♦DNA连接酶

•T4噬菌体连接酶：连接双链DNA切口，或带粘性末端或平头末端的DNA片段

•大肠杆菌DNA连接酶：连接双链DNA切口，或带粘性末端的DNA片，不能连接带平头末端的DNA

片段

•聚合酶：以DNA或RNA为模板，将核苔酸连续加至3J-OH末端，合成方向为5,DNA

聚合酶、RNA聚合酶

•大肠杆菌DNA聚合酶I:5'-3'DNA聚合酶活性；5'-3'DNA外切酶活性；3'-5'DNA外切

酶活性；RNAH酶活性

•Klenow酶：不具有5'-»3'DNA外切酶活性

・T4噬菌体DNA聚合酶：不具有5'-3'DNA外切酶活性。外切酶活性比Klenow酶强200倍，对单

链DNA作用强于双链DNA

・T7噬菌体DNA聚合酶：不具有5'-3'DNA外切醯活性

•TaqDNA聚合酶

•反转录酶：催化以RNA或DNA为模板，合成DNA;具有RNAH酶的活性

木端脱氧核甘酸转移酶：催化dNTP沿5,-3,聚合，逐个加丁线性DNA分了的3,木端；不需要模板

+载体:(vector)来源于质粒、噬菌体或病毒的DNA分子，可供插入或克隆目的基因或DNA,并具有

运载外源DNA导入宿主细胞的能力。

•质粒载体：共价闭合环状DNA(cccDNA);开环DNA(ocDNA);线状DNA(IDNA)

•质粒的三个重要性质：遗传传递的能力；遗传互换的能力；不相容性

•用于克隆的质粒的三个要素：夏制子、选择标记、多克隆位点

♦常用质粒载体：克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体

入噬菌体载体：插入型裁体、置换载体

来源于噬菌体DNA,因可以插入较大DNA片段，常用于构建基因组文库和CDNA文库。

＞目的基因的常用制备方法

+化学合成法：前提：基因的DNA的序列已知。小于lOObp的片段：直接合成，最常用固相亚磷酸三酯法。

大片段目的基因：小片段粘接法、大片段的促法

+PCR法：前提：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反映必需的双引

物。

♦基因文库法：鸟枪法：合用于原核细菌目的基因的克隆分离

cDNA文库法（与mRNA互补的DNA）并非所有的mRNA分子都具有polyA结构；仅限于克隆蛋白质编

码基因；mRNA含量少且tl/2短，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难

第一链:mRNA模板，引物（polyT）,逆转录酶,dNTPs

♦第二链：自身引导法：取得的双链CDNA5'端会有几对碱基缺失（NQOH,煮沸；Klenow酶，dNTPs;

S1内切酶）

♦引导合成法：获得的cDNA能保持完整的5'端序列（TdLDctp;NaOH;退火；Klenow酶,dNTPs）

♦基因文库的完备性：指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间

的关系可用下式表达:N=ln（l-P）/In（l-f）,P=完备性,f二克隆片段的平均大小/生物基因组的大小

♦双酶切产生的粘性末端，最常用，可以保证连接方向的对的性

>影响连接效率的因素：连接方式；目的基因与载体的浓度比例摩尔数比大于1；连接温度、时间、酶的活

性、反映缓冲体系

>重组DNA导入宿主细胞

♦导入大肠杆菌:CQQ2法；转染法

+导入酵母：电转化法；化学转化法；原生质转化法

>导入链霉菌：原生质转化法；电穿孔法

重组DNA导入哺乳动物细胞：显微注射法；DEAE葡聚糖转染法；DNA-磷酸钙转染法；阳性脂质体介导法；

电穿孔法；细胞融合法；病毒感染法

>重组子的筛选与鉴定

♦遗传标记筛选法：抗生素抗性筛选法；。互补筛选法（蓝白斑筛选一载体具有LocZ。基因，X-gol培养基,

成功导入的菌落显示为蓝斑:；营养缺陷型筛选法；噬菌斑笫选法

+核酸分子杂交法：菌落原位杂交法；DNA印迹法；RNA印迹法

♦限制性内切酌图谱法：琼脂搪凝胶电泳鉴定各片段分子量，具后目的基因的为阳性克隆

+DNA序列测定法

+目的基因表达产物测定法

原核细胞表达的特点及选择

＞大肠杆菌（首选，遗传背景研究清楚；适合大规模生产（成本低,同期短，效率高，操作简朴）、芽抱杆菌、链

霉菌等

缺陷：缺少翻译后修饰系统；容易以包涵体形式存在；外源蛋白容易被宿主酶系统水解

士★外源基因表达的调控原件：复制子、启动子（表达效率的关键因素）和终止子、核糖体结合位点（即

SD序列及SD序列到起始密码子AUG的距离）、辨认翻译后修饰信号

用于原核表达的载体必须具有的条件：具有复制子、灵活的克隆位点和方便的选择标记、很强的启动子、

阻遏子（一般有）、强的终止子，所产生的mRNA应具有翻译起始信号（起始密码子AUG以及SD序列）

★外源基因在大肠杆菌中的表达方式

胞内表达：

+非融合蛋白表达：蛋白质接近天然状态，易被降解，易形成包涵体。有原核多肽基因

融合蛋白表达：表达效率高；产物稳定；可以切除原核多肽，获得天然外源蛋白

分泌表达：有信号肽基因，形成周质表达或细胞外表达

★外源蛋白表达效率的影响因素

+外源基因密码子：大肠杆菌具有偏好密码子和稀有密码子，外源基因应尽量设计成为大肠杆菌的偏

好密码子

+mRNA的结构：改变一级结构；减少5'端二级结构稳定性；调控3'端非翻译区二级结构

♦表达载体的选择：表达方式；强的复制子（拷贝数高）；强的启动子（转录效率高）；高效率的核糖体结

合位点；强的终止子（提高mRNA稳定性）；适应范围广；稳定性高；产物易纯化。

外源蛋白的稳定性：采用融合蛋白形式表达；采用蛋白酶缺陷的突变菌株

真核细胞表达的特点及选择

常用的真核表达系统：酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统

大肠杆菌和酵母表达系统的比较

大肠杆菌巴斯德毕赤酵母

载体原核载体穿梭载体

调控序列原核原核和真核

表达形式包涵体、融合蛋白、分泌分泌

翻译后修饰基本无有

发酵，操作简朴、经济发酵，操作较简朴、较经济

生产方式

★酵母表达体系的影响因素

+外源基因的结构

人外源基因5,端非翻译区的序列和长度影响mRNA的翻译效率

人起始密码子两侧若容易形成RNA二级结构，将阻止翻译进行

人富含A-T序列导致转录提前终止

人密码子的偏好性

人高度复杂的胱氨酸结构基序影响表达效率

+表达形式及信号肽的选择：无信号肽常胞内表达；有信号肽，胞外分泌型表达

♦启动子：多数毕赤酵母采用乙醇氧化酶AOX1.AOX2启动子

+转化子的拷贝数：拷贝数越高，表达水平也越高

诱导条件：甲醇诱导的浓度、时间以及温度的选择

外源蛋白的降解：采用酶缺陷型官主、加入底物蛋白或调节pH值克制蛋白酶活性，提高外源蛋白的稳定

性。

>哺乳动物细胞表达系统

>表达载体：病毒载体（腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒等）；质粒载体

》表达方式：瞬时表达、稳定表达、诱导表达

>基因重组蛋白的重要分离技术：离心、沉淀（等电点沉淀法、盐析法）、膜分离、双水相萃取

>基因重组蛋白的重要纯化技术：离子互换层析、亲和层析、凝胶过滤层析、反相色谱和疏水色谱

>选择分离纯化方法的依据

♦根据表达形式选择

♦分泌型：沉淀和超滤

♦周质表达：溶菌酶解决+渗透压休克

♦胞内可溶表达：亲和层析或离子互换层析

♦胞内不溶表达（包涵体）：易与杂蛋白分开，但需要复性形成有活性的蛋白质。

♦根据分离单元之间的衔接选择

♦先采用低分辨、分离规模大的方法，后采用高分辨的方法，最后采用分离规模小、速度慢的方法。合理选

择色谱分离顺序

＞根据分离纯化工艺的规定选择

♦具有良好的稳定性、反急性和较高的安全性：尽量较少组成工艺环节；所用时间尽也许短：工艺和技

术必须高效

.★基因工程药物的质量控制与小分子药物质量控制相比，不同的方面

♦Mr远大于小分子化学物质，致使合用于小分子药物的鉴别方法无法用于基因工程药物。如质谱

♦基因工程药物结构复杂，常需多种检测方法

♦两者杂质性质差别较大。小分子药物杂质重要来源于合成中原料残留、合成副产物和纯化中溶剂残留；

基因工程药物多为宿主蛋白残留和宿主基因残留，其检测一般都用专用的试剂盒。

药物定量方面，基因工程药物一般采用生化反映的方式

★基因工程药物的质量控制

.1.蛋白质含量的测定

♦紫外吸取光谱：在280nm有最大吸取值。快速，无破坏性。不是严格定量，核酸可引起强干扰作

用。

♦BCA法：碱性条件与Cu2+络协议时将Cu2+还原成Cu+（双缩胭反映），再与二辛可宁酸形成

紫色复合物，在562nm有最大吸取值。需短时间lOmin内完毕

♦Lowry法：碱性条件蛋白质与铜形成复合物可还原磷铝酸-磷铐酸试剂，产生深蓝色。特点：灵

敏，准确度高；操作环节多，繁琐；影响因素多(盐酸服、尿素、EDTA等)

+考马斯亮蓝法：灵敏，操作简朴，反复性好；抗干扰能力弱

♦SDS-凝胶染色与扫描分析法

2.蛋白质纯度的测定：电泳(SDS)、质谱法、色谱法、末端氨基峻分析法

3、蛋白质分子♦的测定:SDS、凝胶色谱、质谱法

4.蛋白质等电点的测定

♦5.蛋白质序列分析

N末端氨基酸序列分析：鉴定蛋白质的种类；C末端分析：判断表达、纯化过程中有无加工

6.蛋白质二硫键分析

7、蛋白质活性的测定

8、免疫测定法

9、内毒素分析、宿主蛋白和核酸残留分析

基因工程药物的实例：干扰素(FN)、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(CMCSF)、人白细胞介素-2(IL-2)、

胰岛素、人生长激素(hGH)

第三章动扬细胞工程制药

动物细胞的体外培养

♦★体外培养动物细胞的形态：贴壁依赖性细胞，非贴壁依赖性细胞，兼性贴壁细胞

♦贴壁依赖性细胞：成纤维样细胞型(重要来源于中胚层组织)；上皮样细胞型(重要来源于外胚层和内胚层

组织)

♦非贴壁依赖性细胞：又叫悬浮细胞，一般呈圆球形。重要来源于血液、淋巴组织、杂交瘤细胞

兼性贴壁细胞：如CHO细胞、小鼠L929细胞

动物细胞的生理特点

1)细胞的分裂周期长，一般为12~48h(GlfS-G2fM：

2)细胞生长需贴附于基质，并有接触克制现象

3)正常二倍体细胞的生长寿命是有限的

4）动物细胞对周边环境十分敏感（如渗透压、PH、离子浓度、剪切力、微黄元素等的变化耐受力很弱）

5）动物细胞对培养基的规定高（需要12种必需氨基酸、8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为

重要碳源的葡萄糖，以及多种细胞生长因子和贴附因子，并且不同种类规定又有变化。）

6）动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同

培养条件规定高、成本贵，产量低；多半是分泌在胞外的，收集纯化方便，得到了较完善的翻译后修饰

★动物细胞培养的条件

（一）环境条件：直接接触的器材、防止污染（显著地污染标志:PH值迅速改变，细胞外形模糊，甚至出

现细胞集落）、水质、pH（大多是7.2-7.4）、渗透压、温度、通氧量、基本营养物质

♦（二）营养规定：水、碳源、氮源、维生素、激素、无机盐等

♦碳源不能为无机物，大多只能运用葡萄糖

氮源不能为无机物，重要运用各种氨基酸

在多数情况下，需要添加5%-20%的小牛血清，或适量动物胚胎浸出液。

♦培养基：天然培养基，合成培养基，无血清培养基

♦天然培养基：重要见于初期阶段，来源：血浆凝块、淋巴液、血清（最常用有效）、羊水、腹水等。分

维持液（低或不含牛血清）和生长液（5%-20%牛血清）

♦合成培养基：重要成分：糖、氨基酸、核苔酸前体、维生素、激素、缓冲体系、无机盐等

♦无血清培养基

①提高了细胞培养的可反复性，避免了由于血清批之间差异的影响；

②减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；

③供应充足、稳定；

④细胞产品容易纯化；

⑤避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；

⑥减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析

血清的作用：提供各种生长因子和激素，贴附因子和伸展因子，可辨认金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白,

必须的脂肪酸和微量元素

★其他常用溶液：平衡盐溶液；培养基pH调整液；细胞消化液（胰蛋白酶,EDTA）;抗生素溶液

动物细胞培养的基本技术和方法★

♦★动物细胞培养的方法：原代培养、传代培养、克隆培养

.细胞的原代培养：组织块培养法、单层细胞培养法。取动物组织块f剪碎T分散解决（加胰蛋白酶或胶

原蛋白和EDTA）-洗涤纯化-计数稀释-培养

♦细胞的传代培养：离心或薛消化法收获细胞，计数后，以适当浓度接种到新的培养环境中

♦单克隆培养

♦动物细胞培养的基本技术：细胞分离（离心法；蛋白醉消化法）；细胞计数；细胞传代；细胞的冻存

（慢冻，液氮,-196度）和复苏（快融，投入37七水浴融化）

冻存重要环节：活性好的细胞，加保护剂（DMSO等）混合；做好标记（细胞种类、日期等）；逐渐减少温度，最后

放至液氮中；降温梯度要合适，总的原则是慢冻

生产用动物细胞

人原代细胞：费钱费力，少用

人传代细胞系：安全，特点：2n核型，贴壁依赖，接触克制，有限传代（50代）

人转化细胞系：自发转化或人为转化，失去了正常细胞的特点，可=无限增殖传代，适宜大规模工业培养

♦工程细胞系：融合细胞系（仙台病毒融合法、聚乙二醇融合法、电融合法）；基因工程细胞系

病毒载体：牛痘病毒。腺病毒和逆转录病毒载体，杆状病毒载体-昆虫细胞系统

基因工程细胞重要的筛选系统，

①HAT（次黄喋吟、氨基喋吟、胸腺嘴碇）选择系统，筛选tk+、hgprt+的转化细胞

②GPT（HAT、黄瞟岭、甘氨酸、霉酚酸）选择系统，筛选gpt+的转化细胞

③G4】8（Geneticin）选择系统，筛选Neor的转化细胞

④MTX选择系统，筛选dhfr+的转化细胞

细胞库的建立：原始细胞库（MCR）f生产用细胞库（MWCR,又称工作细胞库，主细胞库f生产细胞库）

常用生产用动物细胞:BHK-2LC127细胞,CHO-KLCOS细胞MDCK细胞,WI-38,MRC-5,Namalwa,

Sf-9,Vero,SP2/0-Agl4

动物细胞大规模培养

★动物细胞的大规模培养方法

悬浮培养:合用于非贴壁依颇细胞或兼性贴壁细胞

•优点：操作简便，培养条件均一，传质传氧较好，容易扩大培养，可以借鉴细菌培养的经验。

•缺陷：细胞培养密度较低。

•微载体培养:用于培养贴壁细胞。充足发挥悬浮培养的一切优点。抱负的微载体应具有:生物相容

性、无毒性、表面惰性、比重适当(1.030~1.045g/ml).粒径均一,在60~250(m之间(溶胀

后)、光学透明、素软、耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简朴、原料充足

•多孔载体培养:可用于悬浮细胞及贴壁细胞。细胞在网格内,能避免受到剪切力的损伤,因此培养

体系可以提高搅拌速度和通气量。多孔载体的一般条件:具有生物相容性、机械稳定性和热

稳定性

微囊化培养:避免剪切力对细胞导致的损伤;获得较高细胞密度107-108个/ml;利于纯化;可采用多种

生物反映器进行培养

中空纤维培养:把细胞接种在中空纤维的外腔,运用中空纤维模拟毛细血管提供营养。

①抱负的动物生物反映器必须具有的基本规定：

②体系中的各种材料，对细胞必须无毒性。

③生物反映器结构的传质、传热和混合性能好。

④密封性能良好，可避免一切外来微生物的污染。

⑤培养环境多种物化参数可自动检测和调节控制，控制的精确度高，且能保持环境质量的均一。

⑥可长期连续运转，特别对于动物细胞而言。

⑦容器加工制造时规定内直光滑，无死角。

⑧拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒便于操作消毒。

⑨设备成本尽也许低。

★动物细胞生物反映器

+规模：实验室规模:<20L;中试规模:20-100L;生产规模:>100L

+类型：搅拌罐式；气升式；中空纤维式；透析袋或膜式；固定或流化床式；一次性摇袋式细胞培养

♦重要操作方式：

♦分批式操作：可以控制的参数只有PH、温度和通气・

♦补料-分批（或流加式）操作：不断地向系统中补充新的营养成分

♦半连续式操作

连埃式操作和灌流式操作：后者取出部分条件培养基时，绝大部分细胞仍保存在反映器内，而连续式培养则同

时也取出了部分细胞。

转基因动物

基本原理及环节：外源目的基因的制备一外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞f选择获得携有

目的基因的细胞f选择合适的体外培养系统和宿积极物一转基因细胞胚胎发育及鉴定f筛选所得的转基

因动物品系

转基因动物制作方法

♦经典的技术路线：基因显微注射法，最常用、成功的方法，成功率低

+整合胚胎移植的技术路线：受精卵的成活率高达90%以上，外源基因整合率高，提高受孕率

+核移植（克隆）的技术路线体细胞核移植；核移植前导入目的基因。

士整合卵受精的技术路线：卵母细胞导入目的基因后再与精子受精。

具体方法：基因显微注射法、反转录病毒感染法、胚胎干细胞方法，精子载体导入法、基因打靶法、人工

酵母染色体法★

转基因动物研究出现的问题：制作转基因动物效率低；外源基因在宿主基因组中的行为难以控制；转基因

表达水平低

转基因动物反映器：（bioreoctor）目的片段在器官或组织中表达的转基因动物。如乳腺、膀胱、血液等

动物细胞产品制造实例：类淋巴细胞干扰素、组织型纤溶酶原激活剂、单链尿性纤溶酶原激活剂-尿激酶原、

促红细胞生成素（EP。）、凝血因子VIII、乙型肝炎疫苗

第四章抗体工程制药

概述

抗体工程应用于医学领域：研究，以免疫转印法检测特定抗原；医疗，以毒素连结抗体袭击病变细胞；检

查，以ELISA侦测特定病原体;

多克隆抗体（polyclonolantibody,pAb）简称多抗。如:免疫血清（含多种特异性抗体）

实际意义：防止、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清（抗破伤风）；胎盘球蛋白（抗病毒感染）。副作用：（超

敏反映。临床诊断，如：肥达氏反映（伤寒、副伤寒）。缺陷：特异性差

单克隆抗体（monocloncilantibody,mAb）简称单抗★

优势：特异性高：只辨认某一个特定的抗原决定簇。均一性好：其H链、L链及V区独特性其完全一致，所得

到的抗体结构和生物学性状完全一致。

杂交瘤细胞：既能产生单一抗体，又能无限增殖

抗体分子的结构和功能★

＞基本结构：四肽链结构

＞重链（H链）和器链（L链）天然1g分子中，重链同类，密链同型。

＞重链可分为五类：U、Y、。、6、£链——IgM、IgG、IgA、IgD、IgE;轻链可分为K、入型。

＞可变区（V区）、恒定区（C区）和钱链区（木瓜蛋白酶、胃蛋白酶）

＞VL、VH区各有3个超变区（也称互补决定区,CDR1-3）,共同组成1g的抗原辨认部位，形成与抗原决定簇

互补的表位。可变区中的其它部分变化较小，称为骨架区（FR）

C区决定1g分了的异种抗原性，重要发挥抗体分了的效应功能。

抗体分子的价位：指抗体分子能结合的抗原表位数的多少。VH和VL的CDR区共同构成抗原的结合位点,

因此一个单体免疫球蛋白分子有两个抗原结合点，故习惯将单体抗体分子称为2价分子。

单克隆抗体的制备

＞产生杂交瘤细胞的三个关键点:B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的特性、细胞融合技术、杂交瘤细胞的筛选

＞单克隆抗体制备的基本过程（理解）：抗体与动物免疫，提取可以产生抗体的B淋巴细胞，B淋巴细胞与

小鼠的骨髓瘤细胞在灭活的仙台病毒/聚乙二醇的诱导下融合，并在特定的选择培养基下筛选出

杂交瘤细胞。在体外条件下做大规模培养/注射到小鼠腹腔内增殖。再提取出大量的单克隆抗体,

最后进行纯化。

＞抗原和免疫：抗原的制备（通常和佐剂混合，增强免疫应答）、免疫动物（体内/体外免疫方法；动物的选

择：一般采用与骨髓瘤供体细胞同一品系的动物）

＞细胞的融合和杂交瘤细胞的筛选

入细胞的融合：制备脾细胞悬液：最后一次免疫后三天，IX108个；制备骨髓瘤细胞悬液：对数生长期细

胞,（2〜3）X107个；融合:40-50%PEG（MW4000）,37c5min

人★HAT培养基筛选杂交瘤细胞

HAT培养基筛选原理:H［次黄哪吟）；A（氨基蝶吟）；T（胸腺喀咤）。骨髓瘤细胞不具有HGPRT和TK,B

淋巴细胞寿命短。影响细胞DNA的合成:H促进了次黄喋吟鸟嚅吟磷酸核糖转移酶（HGPRT）途径；T

促进了胸腺暗症激酶（TK）途径；内源性途径（谷氨酰胺、鸟核昔酸单磷酸，二氢叶酸还原酶途径）被A（叶

酸的拮抗物）阻断

▲环节：融合后细胞fHAT培养基fHT培养基-＞正常培养基

▲杂交瘤细胞的检测和克降

抗体的检测：仅少数杂交瘤细胞可以分泌预期抗体。酶联免疫吸附法（ELISA）、间接免疫荧光法、放射免

疫测定法、流式细胞仪法

▲杂交瘤细胞的克隆：有限稀释法、软琼脂培养法。通过3-4轮克隆化，才干达成100%孔内均为阳性

细胞克隆。耗时长（3-4月）

＞杂交瘤细胞的冻存：冻存原始细胞

＞单克隆抗体的大量制备：体内接种法（皮下接种、腹腔接种）；体外培养法

＞单克隆抗体的鉴定和检测

人单克隆抗体的检测

♦McAb特异性检测：检测有无抗原抗体结合；检测有无交叉反映。ELISA.间接免疫荧光法

♦McAb类和亚类的鉴定：类的鉴定一般在杂交瘤的克隆化过程中可以拟定（兔抗鼠IgG或IgM作

为二抗用于ELISA）亚类的拟定需要用标准抗亚类血清系统做双扩散电泳或夹心ELISAo

▲其他鉴定：中和活性鉴定；辨认抗原表位鉴定；亲和力鉴定；效价（滴度鉴定）；纯度鉴定

杂交瘤细胞的鉴定：重要是对杂交瘤细胞进行染色体分析

抗体治疗疾病的机制：中和作用、导向作用、拈抗作用、ADCCSCDSAonist

抗体在疾病治疗中的应用

♦作为诊断试剂：病原微生物抗原抗体的检测、肿瘤抗原的检测、免疫细胞及其亚群的检测、激素测定、细

胞因子的测定

作为治疗药物：抗肿瘤、抗感染、抗器官移植排斥反映、治疗自身免疫性疾病和变态反映性疾病

制约抗体药物迅速发展的重要障碍：免疫原性；分子量大

基因工程抗体

＞单克隆抗体的人源化

▲嵌合抗体：人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。特点：具有

亲本鼠源单抗相同的特异性和亲和力；对人的免疫原性大大减少；可以接上不同亚类的人C区基因，改

变抗体功能；半衰期长；工程细胞系比人-人杂交瘤细胞藻定：由于鼠VL和VH区的存在，仍有较强

免疫原性

＞改形(型)抗体：把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改形抗

体，也就是人源化抗体。，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，

＞小分子抗体

人涉及FobsFv、单链抗体及单域抗体等

♦Fob片段：由重链V区及CH1功能区与完整的轻链以二硫键连接而成。1/3

♦FV片段：由VH与VL丰共价结合而成。在VH与VL的适当区域个引入一个半胱氨酸，形成锥内二硫键，成

为二硫键稳定的Fv(disulfide-stablizedFv,dsFv)l/6

人单链抗体(ScFv):在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，即单链抗体。常用的连接肽是

(GGGGSJ3

＞单域抗体：即为VH或VL,约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所

减少，但仍保持着原单抗的特异性。

＞优点：可以用细菌发酵生产，成本低；分子小，穿透力强；不含Fc,没有Fc带来的效应；在体内循环的半

哀期短，易消除，利于解毒排出；易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。

＞多功能化抗体

▲双功能抗体（bsAb）:又称双特异性抗体，两个针对不同抗原决定簇的ScFv以共价键或非共价键连接在

一起。

人融合抗体:Fc抗体融合蛋白；Fv抗体融合蛋白

细袍内抗体：指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体，也称内抗体。在scFv的C端/N端插入其他靶向信

号

最小辨认单位：约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性

噬菌体抗体工g

噬菌体抗体库技术的三个关键:RT-PCR技术；噬菌体展示技术；抗体原核表达技术。

★噬菌体抗菌库技术的筛选：。固相或液相纯化抗原的筛选、全细胞筛选、用切片组织进行筛选

第五章疫苗及其剌备技术

1.活疫苗（livevaccine）选用无毒或弱毒但免疫原性高的菌种，经培养、繁殖后制成的。活疫苗株进入机体

后，能继续生长繁殖，对机体呈长时间刺激，连续产生抗体。这类菌（疫）苗有卡介菌（防止结核病的菌

苗）、炭疽菌苗、牛痘疫苗、狂犬病疫苗、鼠疫菌苗、脊髓灰质炎疫苗以及麻疹苗等。

2.死疫苗（killedvaccine）涉及灭活疫苗

（由完整的病毒或细菌经灭活剂灰活后制

成，即要使病原体充足死亡，丧失感染

性或毒性和致病性，又要保存其免疫原

★死疫苗特点★

性）和亚单位疫苗（将病原体经物理或化

学方法解决，除去无效物质，提取其有

效抗原部分制备的一类疫苗）

★活疫苗特点★

♦丕能在体内繁殖,..性质稳定..安全性高

♦可在体内繁殖

♦有助于制备多价或多联疫苗

♦系统免疫反映和局部免疫反映

♦比较安全，.不发生全身性副反虬.无毒力反祖.现象

♦免疫力持久一之星高成本低

♦受外界影响小，有助于保存运送

♦有毒力增强和反祖危险

♦免疫剂量大，需多次免疫，成本高

♦抗原干扰现象

♦只能诱导机体产生体液免疫

♦保存条件苛刻

♦通常需.要用佐.剂或携.带系统来增强.其免疫效果

★活疫苗★死疫苗DNA疫苗

♦可在宿主细胞中复制♦不能在宿主细胞中复制♦可刺接抗原在细胞内合成

♦毒力减少♦无毒，不返强♦可诱导细胞免疫

♦免疫反映比较全面♦免疫反映不太全面♦制备技术容易标准化

♦免疫剂量小♦不会传染给其它个体

♦免疫保护期长♦制备技术相对容易

重组亚单位疫苗

♦将病原的重要保护性抗原蛋白基因在体外进行大量表达，纯化其表达产物辅以佐剂制成疫苗--亚单位疫

苗

♦良好的安全性和稳定性。运用非疫苗用蛋白作为抗原建立的诊断方法将可以区分亚单位疫苗免疫的动物和

自然感染的动物

合用于发病快，病程急，中和抗体能有效控制发病的传染病。

不适于病程发展缓慢，潜伏期长，感染巨噬细胞且有ADE效应的疾病。

活载体疫苗

运用低致病力的痘病毒、疱疹病毒、腺病毒或细菌作为载体，将其它病原的重要保护性抗原基因插入到载体基

因组的非必需区形成新的重组体，在同源或兼容性好的启动子驱动下随载体的复制表达插入的外源基因。

病毒活裁体疫苗的缺陷：使用同一载体的不同疫苗不能同时使用

疫苗制造流程

制造优良疫苗的关键：优良的菌种；适宜的培养方法；良好生产工艺；严格的检查和标准。

生产工艺流程：菌（毒）种f培养物（培养基、动物、禽胚或细胞等）一收获抗原（培养液、含毒组织、胚液或

细胞液等）f配苗一分装一冻干成活疫苗或灭活后制成灭活疫苗。

毒种的选择与减毒

1）★毒株须具有的条件：

2）持有特定的抗原性；

3）有典型的形态和感染特定组织的特性，并能保持其生物学特性；

4）易在特定组织中大量繁殖；

5）不产生神经毒素或能引起机体损害的其它毒素；

6）如制备活疫苗，繁殖过程中无恢复原致病性的现象；

7）未被其它病毒污染。

强毒种的选育：毒力强，纯粹，抗原好，稳定的菌种，最后冻干保藏。这就是强毒菌种的标准

弱毒种的选育：初选的依据：生物性状改变

细菌灭活疫苗制造：种子f培养f灭活和无菌检查f浓缩提高含菌量f配佐剂f分装f动物安全实验

细菌弱毒疫苗制造：菌种-培养f浓缩T配苗和冻干f动物安全实验

病毒性动物组织苗（自家组织灭活苗；病毒弱毒疫苗）、病毒禽胚疫苗、病毒细胞疫苗、寄生虫疫苗的制备

★疫苗产品的质量检定：外观检查、pH值检测、纯度、宿主细胞DNA和蛋白残留量、无菌检查、热原、

抗生素检测、灭活效果的验证、异常毒性检查、稳定性实验、效力实验（生物效价）、佐剂的质量评价、

疫苗标准品或参考品的研究

甲型肝炎减毒活疫苗：生产用细胞（人二倍体细胞）、细胞库管理及检定、细胞制备、细胞培养液、毒种名

称及来源、种子批的建立、对照细胞外源因子检查、病毒接种和培养、病毒提取（检定合格的病毒收获物

经冻融和（或）超声波解决，并采用适宜浓度的三氯甲烷抽提以提纯病毒）、原液（同一细胞批生产的病毒收获

物经提取病毒后合并为一批原液）

流行性乙型脑炎疫苗：收液作毒力滴定与无菌实验，加入福尔马林,22℃恒温灭活8d

灭活剂、保护剂和免疫佐剂

灭活剂种类

1.甲醛溶液：最常用。①蛋白质②核酸烷基化（不加中断剂）作用于氨基、较基、羟基、鑫基

2.烷化剂：乙酰基乙烯亚胺（A日）；二乙烯亚胺（B日）；缩水甘油醛。（使微生物核酸烷基化，灭活后加2%硫

代硫酸钠中断灭活）。烷化DNA分子中的鸟噤吟或腺喙吟等，妨碍RNA的合成。使病毒完全丧失

感染力，而保存其保护性抗原。

3,苯酚（石炭酸）：用于防腐，很少用于疫苗研制

4.结晶紫：蛋白质变性（溶于有机溶剂）；用于诊断抗原的制备：鸡白痢抗原

丙酰内酯：病毒灭活剂，重要用于狂犬病灭活苗制备

!注意：灭活剂对人有害，有时对皮肤粘膜有强烈刺激性如：甲醛、B-丙酰内酯

影响灭活作用的因素：灭活剂特异性；微生物种类和特性；灭活剂浓度；灭活温度；灭活时间；灭活PH

值；有机物存在

保护剂的用途

①菌种或毒种保存：常用甘泊作保护剂

②细胞株保存：常用二甲基虫飒（DMSO,一种细胞的保护剂）

③疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或_甲基亚项I）和蔗楣等（不同国家后不同配方）

④干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖

保护剂分类：机理一渗透剂（DMS。、甘油和蔗糖）非渗透剂（聚乙烯毗咯咤酮（PVP）和蛋白质）；分子量

大小一高分子物质、低分子物质；化学性质一复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物

疫苗冻干保护剂组成：营养液；赋形剂；抗飙化剂

常用的冻干保护剂（稳定剂）

＞细菌的保护剂

①需氧或兼氧厌氧菌：5%蔗糖脱脂乳或5%蔗糖、1.5%明胶；

＞②厌氧性细菌：含1.5%谷氨酸钠的1%乳糖或10%脱脂乳或7.5%葡糖血清。

＞注:脱脂乳:20%脱脂奶粉溶于水配制而成。

＞病毒的保护剂

①5%蔗糖脱脂乳；

②马立克814活细胞疫苗：保存液氮.稳定剂为10%二甲基亚飒和50%犊牛血清的199液。

注:微生物保护剂缓冲液的组成比例,不同厂家有不同的配方。

常用的保护剂：5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂；明胶蔗檐保护剂；SPGA保护剂

♦免疫佐剂：

♦氢氧化铝胶（铝胶）•油乳佐剂•乳化剂•白油佐剂•蜂胶佐剂♦脂质体佐剂

♦细胞因子类免疫佐剂（IL-2.IL-4.IL-12.IFN-Y）

♦CpGDNA（指具有非甲基化CpG（胞II密咤鸟嗓吟二核苔酸）基序的脱氧核糖核酸DNA）

♦CpGOND（具有非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苗酸）

♦基因工程减毒素（霍乱毒素.CT;大肠杆菌不耐热毒素,LT;破伤风类毒素,TT）

免疫刺激复合物（ISCOM,抗原：糖苔QuilA:胆固醇=1:1:1）

♦作用机理：抗原递呈；抗原寻的；免疫调节

•CpGDNA对多种免疫细胞有激活作用：引起B细胞分化，直接激活单核细胞、巨噬细胞和树突细胞,

在IL-12协同下激活NK细胞，协向刺激抗原特异性B细胞和T细胞分化

CpGODN的体内效应与应用：对天然免疫系统的刺激活性（抗感染、抗肿瘤活性）；对特异性免疫反映的

调节作用一疫苗佐剂（对蛋白质抗原的作用；对DNA疫苗的作用）；过敏性疾病治疗

第六章酶工程制药

概述

酶是一类具有催化活性的生物大分子，涉及蛋白质和核酸

2.可以缩短化学反映到达平衡的时间，而不改

着翻籍顺强舞

酶的来源和生产：直接从动植物获得，即从生物体中分离和提纯；化学合成方法；工业微生物发酵

发酵法产酶的优点：微生物种类繁多，制备出的酶种类齐全。微生物繁殖快，生产周期短，酶的产量高，成本低。

微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法哺育出新的

高产酶的菌株。

研究内容：酶的大量生产和分离纯化；新奇酶的发现、研究和应用；酶的固定化技术和固定化酶反映器；

基因工程技术应用于酶制剂的生产；酶分子改造与化学修饰；有机介质中酶的反映；酶克制剂、激活剂的

开发及应用研究；抗体酶、核酸酶的研究；模拟酶、合成酶的研究；酶的定向进化研究

酶的分离纯化

♦分离纯化遵循蛋白质分离纯化的一般原则，但又有特殊性：

♦低温：一般1〜4℃

♦条件温和：避免极端条件（剧烈搅拌、pHs盐浓度等）

加入保护剂：EDTA.2-琉基乙醇等

对纯化过程进行监测：不断检测酶活力和蛋白浓度

＞★酶分离纯化的环节：预解决f初步纯化-高度纯化-浓缩与干燥

＞酶的提取

♦来源选择：含目的多的原料。同时考虑原料的来源、取材方便经济等方面因素

♦细胞破碎：机械法、物理法、化学法（有机溶剂、表面活性剂）、生物法（酶解）

＞保护措施：采用缓冲系统；添加保护剂；克制水解酶的作用；其他：注意温度、搅拌、紫外光等的影响

♦酶的抽提：

♦目的：将目的酶最大限度地溶解出来；保持生物活性。

♦原则：相似相溶；使用远离等电点的PH值，溶解度增长。

＞方法：盐溶液提取（常用NQQ溶液）；酸、碱溶液提取；有机溶剂提取

＞沉淀分离：等电点沉淀；盐析；有机溶剂沉淀

＞酶的纯化

♦根据分子量大小分离：离心、膜分离、凝胶层析等

♦根据电荷性质进行分离：离子互换、电泳等

♦根据疏水作用进行分离：疏水层析、反相色谱等

根据亲和作用分离：亲和层析

酶和细胞的固定化

游离酶的缺陷：酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。酶不能回收，无法反复使用。产物中

混杂酶蛋白，分离纯化困难。

.★固定化酶：

优点：（1）可提高酶的稳定性。（2）酶能回收，易与产物分离，可反复使用。

缺陷：（1）存在扩散限制。适于催化小分子物质。（2）酶活性下降。

♦固定化细胞：

优越性：（1）减少成本，省去酶的分离纯化工作：（2）既可作为单一函，也可作为复合酶系完毕部分代谢过程。

局限性：（1）细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物。（2）细胞膜、细胞壁和载体都存在看扩放限制作用。

固定化酶（细胞）的制备

★传统的酶固吸附法

定化方法：裁

体结合法（物理

吸附法、离子结

合法、共价结合

包埋法共价结合法交联法

法）交联法（常物理吸附法离手吸附法

用戊二醛试

剂）、包埋法（网

格型、微囊型）

固定化方法

制备难易易易较难难较难

结合限度弱中档强强强

高，酶易流失

活力回收高高低中档

费用低低低中档

底物专一性不变不变不变可变可变

酶固定化的新方法：光偶联法；等离子体法：偶合固定化法：无裁体固定化酶的新技术

★固定化酶（细胞）的性质和指标

固定化酶活力的改变：通常低于天然酶（有例外）

因素:酶的构象发生变化,影响活性中心的氨基酸;空间障碍:形成立体屏蔽;内扩散阻力使底物分子与活

性中心的接近受阻;包埋时,大分子底物不能透过膜

＞固定化酶的稳定性：酶的耐热性提高，对变性剂、克制剂、pH值、蛋白酶以及操作条件的抵抗力增

长。

＞也许的因素：固定化增长了酶活性构象的牢固限度,可防止藕分子伸展变形。克制酶的自身降解。固定化

部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。

＞固定化酶的最适温度变化：最适温度与酶稳定性有关。多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上

升（有例外）

＞固定化酶的最适pH变化：带负电荷载体：最适pH向碱性偏移。带正电荷载体：最适pH向酸性偏

移。

＞固定化酶的表观米氏常数Km的变化：固定化酶的表观Km随载体的带电性能变化。

＞固定化载体与酶的底物电荷相反时，固定化酶的表观Km值减少；相同时，表观Km值显著增长。

＞固定化酶的作用专一性改变：与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一性发

生改变

＞固定化细胞的性质：有活性升高的现象；稳定性的增长；最适温度和最适pH常保持不变

固定化酶（细胞）的评价指标：活力、偶联率及相对活力、半衰期、熟稳定性

♦活力回收=（加入酶蛋白活力一上清液酶蛋白活力）/加入酶蛋白活力x100%

♦偶联率=固定化酶总活力/（加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力）x100%

偶联率=1,表白固定化对酶活性影响不明显；

偶联率＜1,表白固定化对减少酶活性；

偶段率＞1,也许有细胞分裂，或从载体中排除影响酶活性的克制剂

♦酶传感器：重要由固定化酶膜和变换器组成

♦生物传感器：酶传感器(酶电极，热敏电阻酶传感器，离子敏场效应晶体管酶传感器，光纤酶传感

器)、组织传感器、微生物传感器、免疫传感器

酶传感器的应用：水质监测；葡萄糖传感器和血糖测定仪；肉鲜度传感器

.酶反映器★:

♦按结构区分：搅拌罐式反映器(STR);鼓泡式反映器(BCR);填充床式反映器(PCR);流化床式反映器

(FBR);膜反映器(MR)

♦按操作方式区分：分批式反映；连续式反映；流加分批式反映

＞混合形式：连续搅拌罐反映器【CSTR)分批搅拌罐反映器(BSTR)

＞间歇式酶反映器

＞又称为批量反映器(BotchReactor,BSTR)、间歇式搅拌罐、搅拌式反映罐。其特点是：底物与酶一次性投

入反映器内，产物一次性取出;反映完毕之后，固定化前(细胞)用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反映。

＞优点是：装置较简朴，造价较低，传质阻力很小，反映能很迅速达成稳态。

＞缺陷是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反映器很少用于

固定化酶，但常用于游离酶

＞连续式酶反映器

♦又称为连续搅拌釜式反映器(ContinuousStirredTankReactor,CSTR)、连续式搅拌罐。向反映器投入

固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反映达成平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相

同流速输出反映液(含产物)。

＞优点是：在抱负状况下，混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致。

＞缺陷是：搅拌浆剪切力大，易打坏磨损固定化酶颗粒。

＞填充床酶反映器