2027创新设计一轮生物 高考共鸣点13　特殊PCR技术、双标记基因技术、基因编辑技术

特殊PCR技术、双标记基因技术、基因编辑技术高考共鸣点13热点考情速览重叠延伸PCR技术、大引物PCR技术、巢式PCR技术、反向PCR技术等2023·辽宁卷，25；2022·全国乙卷，38；2022·江苏卷，24；2021·天津卷，6双标记基因载体、影印接种与蓝白斑筛选2025·安徽卷，15；2024·安徽卷，20；2024·天津卷，15；2023·湖北卷，4；2023·辽宁卷，18基因编辑技术及其应用2025·甘肃卷，21；2025·重庆卷，19；2024·新课标卷，35；2023·海南卷，201目

录特殊PCR技术2双标记基因载体与蓝白斑筛选3基因编辑技术及其应用热点一特殊PCR技术题型一重叠延伸PCR技术(1)以上操作中哪些引物应含有拟突变位点？提示引物2和引物3。(2)过程②和③，应分别选择哪些引物？提示过程②时需选择引物1和引物2，过程③时需选择引物3和引物4。(3)经过过程④获得的杂交DNA有2种，都可以经过过程⑤获得目的基因吗？(4)为获得大量目的基因序列，应在突变后的基因中加入哪两种引物？提示引物1和引物4。拓展

两个引物均从内部扩增，在某一引物引入突变位点若两个引物均从内部扩增，其中一个引物引入突变位点，则至少第3次扩增后才可获得双链等长的突变DNA片段，n轮扩增后可获得2n－2n个突变DNA。题型二大引物PCR技术大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。题型三反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列反向PCR技术是根据DNA片段中间的已知序列设计引物，扩增已知序列两侧的未知序列的思路是：先从未知序列的两侧把DNA切成片段，然后通过DNA连接酶将DNA片段环化；再利用已知序列的两端设计引物，只不过引物相对于已知序列是反向配置的，所以子链反向延伸(如图)。反向PCR可用于检测目的基因在受体细胞基因组上的插入位点等未知DNA片段。题型四巢式PCR首先将目标的DNA模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种产物)。然后使用第二套引物(内引物)对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。

由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片段。

这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如下图所示。

[例1]

(2026·河南名校联盟)常见PCR只能扩增两引物之间的DNA序列，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。

下列叙述错误的是(

)DA.酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列B.环化阶段，可选用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶C.图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对D.PCR扩增，将温度调至72℃的目的是使引物与模板链结合解析在酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然会将已知序列L切断，造成序列识别混乱，A正确；T4DNA连接酶或E.coliDNA连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段，可选用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶，B正确；PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，C正确；PCR扩增中，将温度调至72℃的目的是耐高温的DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，D错误。A.酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列B.环化阶段，可选用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶C.图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对D.PCR扩增，将温度调至72℃的目的是使引物与模板链结合[例2]

(2026·湖南长沙一中联考)基因定点突变的目的是通过定向改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列叙述错误的是(

)CA.第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度B.PCR扩增的定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译C.第一轮PCR的产物的两条DNA链作为第二轮PCR所用的引物D.将某蛋白质的第21位组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)，属于蛋白质工程解析为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，

引物设计时应考虑不同的复性温度，第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度，A正确；若要使目的基因可以表达出蛋白质，则产物需具备启动子和终止子，诱导基因转录和翻译，B正确；除了第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误。[例3]

(2026·广东茂名调研)水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。(1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过_______________________________________来完成。(2)若拟突变位点的碱基对为A—T，则需要让其突变为

才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为

(假设引物为单链DNA)。(3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生

种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为__________________________________________________________________。改造基因(或基因定点突变)T－A或C－GA或G3引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会因相结合而失去作用(4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是__________________________________________________________________。M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段解析

(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为T－A或C－G，对应的密码子由AAU变成AAA或由AAC变成AAG，可使天冬酰胺替换为赖氨酸。(3)若两个反应系统均进行一次复制，则会产生3种不同的DNA分子，因为引物1和4产生的DNA分子是一样的。(4)重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。拼接基因M和N时，需要找到两种基因的重叠部分，即M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段。热点2双标记基因载体与蓝白斑筛选1.利用双标记基因与影印接种技术筛选

双标记技术使用两个标记基因(如两个不同的抗性基因)，在构建重组表达载体时，将目的基因插入其中一个标记基因内，导致该标记基因无法正常表达，失去抗性，而空载体具有两种抗性，由此区分空载体和重组表达载体。但由于构建成功的载体失去一种抗性，在含相应抗生素的选择培养基中反而会被淘汰，所以需要一种特殊的影印培养法(也叫印章法)，对失去抗性的受体菌进行筛选，原理如下。2.利用蓝白斑显色法筛选

蓝白斑筛选是另一种双标记技术，通过破坏一个和色素有关的基因，判断目的基因是否导入载体，在操作上更加方便，原理如下。

蓝白斑筛选利用β－半乳糖苷酶基因作为第二个标记基因，β－半乳糖苷酶基因(LacZ)编码β－半乳糖苷酶，β－半乳糖苷酶可以催化无色的X－gal分解产生蓝色的产物，使菌落呈现蓝色。如果目的基因破坏LacZ，则菌落呈白色，从而筛选出转化成功的细胞。注：上图固体培养基中添加了X－gal和氨苄青霉素。[例1]

(2025·安徽卷，15)质粒K中含有β－半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X－gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是(

)CA.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数B.如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株C.因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株D.若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌解析提高大肠杆菌转化效率的常用方法是使用氯化钙(或Ca2＋)处理细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；若筛选平板中仅含卡那霉素，目的基因成功插入的重组质粒导入的大肠杆菌以及目的基因未插入成功的质粒K导入的大肠杆菌在平板上均为白色菌落，故无法判断哪个是含目的基因的菌株，B正确；因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落应为含目的基因的菌株，能否表达相应蛋白，需进一步检测，C错误；如果筛选平板上蓝色菌落明显偏多，说明大量没有插入目的基因的质粒K导入了大肠杆菌，推测原因可能是酶切后的载体发生自身环化并导入了大肠杆菌，D正确。[例2]

(2026·江西临川一中模拟)不同的启动子活性不同，可引起基因表达强度的差异。MCS是一段含多种限制酶切割位点的DNA序列，广泛用于插入不同外源启动子，但MCS自身序列也可能会启动下游基因的表达，对外源启动子活性检测造成干扰。为了构建能灵敏检测外源启动子活性的质粒，科研人员利用无启动子的LacZ基因和质粒p构建出质粒p－LacZ(如图甲)，并以此进行进一步研究。回答下列问题。注：LacZ基因编码产物为β－半乳糖苷酶。EcoRⅠ、Sac

Ⅱ、Bgl

Ⅱ、Xba

Ⅰ、Sph

Ⅰ、BamHⅠ为相应限制酶可识别并切割的位点。箭头表示基因转录方向。(1)为构建更为灵敏的外源启动子活性检测质粒，最好选择限制酶____________切割质粒p－LacZ，然后将MCS与p－LacZ连接构建成质粒p01。在此基础上对MCS序列进行不同改造分别得到质粒p02、p03、p04、p05、p06。(2)将质粒p01～p06分别与LacZ基因缺失菌株混合后接种至含

的液体培养基中培养并筛选出成功转入质粒的菌株，然后分别于28℃和37℃条件下培养后进行β－半乳糖苷酶活性测定，结果(如图乙)表明，应选择质粒

并在

的温度下用于插入外源启动子进行活性检测最灵敏，理由是__________________________________________________________________。Sac

Ⅱ、Bgl

Ⅱ氯霉素p0628℃在28℃条件下，β－半乳糖苷酶活性最低，对外源性启动子活性检测干扰最小(3)β－半乳糖苷酶可以分解X－gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色。请利用(2)筛选得到的质粒(记为pR)为工具，用固体培养基初步比较外源启动子A和B的活性，试写出简要的实验思路：_____________________________________________________________________________________________________________________________________________。

将pR空质粒、pR－A、pR－B分别导入LacZ基因缺失菌株中，并接种到含有X－gal的培养基上，在适宜条件下培养，检测不同组平板上菌落蓝色深浅解析

(1)MCS为包含多种限制酶切割位点的DNA序列，用于插入不同外源启动子，但MCS自身序列也可能会启动下游基因的表达，对外源启动子活性检测造成干扰，质粒p－LacZ上的LacZ基因不含启动子，产物为β－半乳糖苷酶，可用于检测MCS启动下游基因表达的活性，因此，要将MCS插入质粒p－LacZ中LacZ基因的上游，为保证MCS正确插入，应选择双酶切，即选择Sac

Ⅱ、Bgl

Ⅱ限制酶切割质粒p－LacZ。(2)重组质粒含有氯霉素抗性基因，可用于筛选出成功转入重组质粒的菌株，即需要在含氯霉素的液体培养基中培养；分析图乙，不同质粒和不同温度下β－半乳糖苷酶活性不同，质粒p06在28℃时，β－半乳糖苷酶活性最低，说明MCS自身序列启动下游基因表达的干扰最小，在此基础上插入外源启动子进行活性检测最灵敏。(3)本实验的目的是利用固体培养基初步比较外源启动子A和B的活性，将外源启动子A和B分别插入质粒pR中，检测β－半乳糖苷酶活性，β－半乳糖苷酶可分解X－gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，该酶活性越强，菌落蓝色越深，因此，可通过检测菌落蓝色深浅表示该酶活性大小。热点3

基因编辑技术及其应用1.基因组编辑的含义

对基因进行定点修改，以改变目的基因的序列和功能，进行基因治疗和物种改良。2.应用最广泛的技术——CRISPR/Cas9技术 (1)CRISPR/Cas9组分及功能短链RNA(sgRNA、向导RNA)作为“向导”，部分序列通过碱基互补配对，与目的基因中希望被编辑的DNA序列结合细菌的核酸酶Cas9与短链RNA结合，切割与向导RNA结合的DNA，使DNA双链断裂(2)CRISPR/Cas9技术的主要应用利用CRISPR/Cas9技术可以实现基因的敲除、特异突变的引入和定点转基因等。[例]

(2026·西安高新一中质检)CRISPR/Cas9是目前应用最广泛的基因组编辑技术，能对DNA分子中的基因进行编辑，引入人们想要的基因或破坏已有的基因。使用该技术，需要向待编辑的细胞中加入以下主要组分：人工合成的向导RNA和一种来自细菌的核酸酶Cas9蛋白。其原理是向导RNA与DNA分子中希望被编辑的序列通过碱基互补配对