抗Tac单抗注射液质量标准HS20010022

PAGE1PAGE5抗Tac单抗注射液质量标准DaclizumabInjection(Zenapax)物理检查：无色透明或微乳白色液体，无可见颗粒。最低装量检查：按《中国药典》附录IB：“注射液装量”检查法要求，应不少于标示装量（5ml/瓶）。pH值：按《中国生物制品规程》（2000年版）电位法测定，应为6.7-7.1。等电点测定：按《中国生物制品规程》（2000年版）中《生物制品化学及其他检定方法》，应与参比品一致。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：非还原法：与参比品一致。还原法：应分别为两条蛋白染色带，扫描后计算出免疫球蛋白含量，应95%。高压液相色谱（SEC-HPLC）：单体95%。蛋白质含量（紫外法）：应在4.5-5.5mg/ml。生物活性

抗CD25单抗活性测定方法，与参比品相比，抗体活性应为3.15-6.88mg/ml。（方法见附录I）特异比活性：生物活性/紫外法蛋白含量应为0.7-1.3。无菌试验

按照《中国生物制品规程》通则《生物制品无菌试验规程》A项测定，应无菌生长。细菌内毒素（LAL法）

细菌内毒素含量应1.2EU/mg。异常毒性试验

按照《中国生物制品规程》通则《生物制品异常毒性试验规程》，豚鼠应无明显异常反应，动物健存，体重增加；小白鼠应无明显异常反应，动物健存，体重增加。*13组织交叉反应性测定：与阳性对照细胞（CD25）有反应，与人体其他正常组织、人体

肿瘤组织和胎儿组织无交叉反应。(方法见附录2)注：*在首次进口注册和再次注册换证时对其中的一批进行测定。[规格]25mg/5ml[生产国别及生产厂]瑞士 F.Hoffmann-LaRocheLtd,Basel[复核单位]中国药品生物制品检定所[报验单位]上海罗氏制药有限公司附录I抗CD25单抗活性（Zenapax）测定方法实验材料：对照标准品：6.2mg/ml,-20C保存。培养基：RPMI1640液体培养基。B-IL-2：生物素化IL-2，30g/ml于TBS-BSA中，100l分装于-70C保存18个月。Strept-Av-PO：1.0mg/ml，-20C保存。PBS：无菌，保存于2-8C。FCS：胎牛血清，购自Hyclone公司。抗生素：青霉素/链霉素溶液，含有10,000U青霉素/ml和10,000g链霉素/ml。L-谷氨酰胺：200mML-谷氨酰胺溶液。-ME：50mM-巯基乙醇于PBS中。BSA：牛血清白蛋白组份五。其他试剂：Tris，NaCl，KCl，TMB，2.5M硫酸，底物液（磷酸-柠檬酸缓冲液）实验器材：无菌96孔板：用于样品稀释96孔板：用于收集过滤样品及显色96孔微膜过滤板（filtermanifold）：MilliporeMADVS6510，0.65m。真空抽滤器（MultiScreenVacuumholder）：MilliporeMAVM0960。无菌滤器：可滤过500ml及1000ml样品的0.2m无菌滤器。其它仪器：CO2培养箱，离心机，pH计，微孔板振荡箱，酶标仪数据分析软件：Select2.2。实验步骤：A：溶液配制：TBS：称取2.4gTris，8.0gNaCl和0.2gKCL，加入800ml蒸馏水溶解，用1MHCL调pH至7.4，补足体积至1000ml，无菌过滤后，保存于4-8C，于2个月内使用。

10贮存液：称取10倍上述量溶解于1升蒸馏水中，无菌过滤于4-8C最多保存6个月。实验前，用蒸馏水进行10倍稀释，并调pH值至7.4。此溶液必须当天使用。TBS-BSA：将1克BSA溶解于100mlTBS中，制成1%溶液。实验前新鲜配制。链亲和素-过氧化物酶溶液：用TBS-BSA将1mg/ml的链亲和素-过氧化物酶贮存液稀释至64ng/ml（稀释倍数为1：15625）。当作为空白对照时，将此溶液用TBS-BSA进行1：1稀释。融解后的贮存液4-8C保存3个月。底物液：即用型TMB溶液。终止液：量取200ml2.5MH2SO4搅拌状态下缓慢加至50ml蒸馏水中，配制成2M溶液。亲和素-生物素复合物：用TBS-BSA将生物素标记的IL-2稀释至267ng/ml，然后与链亲和素-过氧化物酶溶液（64ng/ml）1：1混合，置于冰上备用（30-60分钟）。培养基：400mlRPMI1640中加入50mlFCS、5ml谷氨酰胺、5ml抗生素和0.5ml-巯基乙醇，并用RPMI1640补足体积至500ml。无菌过滤，4-8C保存二周。细胞培养：细胞复苏：

液氮中取出冻存管，37C水浴融解细胞转移至50ml离心管中轻轻摇动离心管并缓慢加入1ml培养液混匀静置5分钟如上法加入2ml培养液静置5分钟如上操作分别加入4ml和8ml培养液终体积为16ml250Xg，10分钟离心5ml新鲜培养液重悬沉淀细胞计数并将细胞浓度调整至约4105细胞/ml转入细胞培养瓶中培养2天后计数，将其稀释至4105细胞/ml，并取5ml转至新瓶培养至细胞浓度达到106/ml转入细胞培养阶段。细胞培养：

C8166于20ml培养液中在5%CO2孵箱中培养。当细胞浓度达到1.0-1.5106细胞/ml时通过稀释培养物传代，大约每周两次。如果3天后使用或传代，细胞接种浓度大约为1.5105细胞/ml；若在4天后进行，细胞接种浓度大约为8104细胞/ml；如果传代当天不进行实验，细胞接种浓度大约为3.0105细胞/ml时，2天后可以使用。准备实验用细胞：

细胞转至50ml离心管中，用PBS补足至50ml混匀后，室温250Xg离心10分钟，弃上清用50mlPBS洗涤一次，同上离心每20ml细胞培养物用20mlPBS重悬沉淀活细胞计数应大于80%同上离心，用TBS重悬细胞使其浓度为2106/ml将细胞置于冰上，使用前最多放置30分钟。若使用一瓶以上的细胞，洗涤及重悬细胞用的PBS应按比例增加。实验程序：将96孔微膜过滤板放于冰箱（4-8C）。取一支样品，用TBS-BSA将样品（5mg/ml）及标准品（6.2mg/ml）稀释至1000ng/ml。同时将标准品（6.2mg/ml）稀释至10g/ml作为阳性对照。在无菌96孔板（稀释板）中分别加入100lTBS-BSA，但A2-A10及A11-D11孔中不加。取300l标准品（1000ng/ml）分别加于A2，A3，A4孔中；取300l样品1（1000ng/ml）分别加于A5，A6，A7孔中；取300l样品2（1000ng/ml）分别加于A8，A9，A10孔中。在板上进行1：1.5倍系列稀释：用多道加样器从A2-A10孔中取200l加至B2-B10孔中，混合3次。然后从B2-B10孔中取200l加至C2-C10孔中，混合。如此反复至H2-H10孔，并从H2-H10孔中取出200l弃去。取100l标准品（10g/ml）分别加于A11-D11孔中，将稀释板置于冰上待用。取100l冰箱预冷的TBS湿润96孔微膜过滤板，并真空抽滤。从最低浓度至最高浓度，将样品、标准及空白转移到96孔过滤板上。为确保精确，将加样器调到80l吸取液体，加50l于滤膜上，剩余30l样品重新放回相应的稀释孔中。按照下列顺序在96孔微膜过滤板上分别加入下列试剂：

1）在第1和12列中分别加入100l链亲合素过氧化物酶（64ng/ml，1：1）；

2）在第2到11列中分别加入100l亲合素-生物素复合物；

3）在1到12列中分别加入50l细胞，先加第1和第12列。

冰箱（4-8C）中孵育9010分钟。同时将底物液放置室温平衡。孵育后，将液体抽滤出去，加入200l冰上预冷的TBS振摇洗涤5分钟，转速约在100转/分钟。抽滤，重复步骤8两次。抽滤，用吸水纸擦去过滤板下任何残留液滴。每孔中加入200l室温平衡的底物液，同上振摇条件下反应155分钟。在真空泵下层组件放置一块平底96孔板，上面放96孔微膜过滤板，将反应上清通过过滤转移到下层板中。各孔中加入50l终止液，先加第1和第12列，振摇5分钟以终止反应。测定450nm下的读数。数据处理：试验有效标准：在数据进行统计学分析前，首先进行反应系统的适合性检验。

（1）所有有效空白孔（第1和第12列）的平均OD值应不高于0.5。

（2）阴性对照均值/阳性对照均值应等于或大于3。

（3）样品或对照品的剂量反应曲线上离群值不得多于4个。采用酶标分析软件Select2.2，根据四参数回归方程，求出半数有效浓度：

Y=（A-B）/[1+（X/C）ˆD]+B，其中C值为半数有效浓度（ED50）。

1）生物活性（mg/ml）=蛋白含量（mg/ml）（样品ED50/参比品ED50）

2）特异比活性=生物活性（mg/ml）/蛋白含量（mg/ml）结果判定：

抗体活性为：3.15-6.88mg/ml。附录2组织交叉反应检测材料和设备

37ºC温箱；显微镜实验步骤2.1实验前准备工作：正常人组织石蜡切片、胎儿组织石蜡切片、胎儿组织冰冻切片制备。免疫组织试剂盒、抗体、PBS缓冲液配制。2.2具体操作步骤：2.2.1切片脱蜡至水；3%双氧水室温孵育10-30分钟；蒸馏水洗，PBS浸泡5分钟；修复，将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中，置微波炉内加热使温度保持在92至9