CN118652923B 一种酵母表达三螺旋结构ⅰ型重组人胶原蛋白的制备方法及其应用 （江苏创健医疗科技股份有限公司）

该工程菌的构建方法包括将pMChZ-α1(Ⅰ)、2将pMCrN-α2(Ⅰ)质粒转化入所述菌株KM71H/pMC所述pPIC9K-P4H(DP)-1质粒是将P4H9KDP质粒中的KanR替换为如SEQIDNO.12所示2α2(所示的DNA分子替代所述pPIC9K质粒的4648-9221bp；将所述pPIC9K质粒中位于αMF上游的所述pMCrN-AOX载体是以核苷酸序列如SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示的DNA分子分别替代所述pMChZ-AOX载体上的PpHIS4和Zeo所述pMCeH-AOX载体是以核苷酸序列如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示的DNA分子分别替代所述pMChZ-AOX载体上的PpHIS4和PEM7-BleoR-CYC1t2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述pPIC9K质粒中位于αMF上游的3.一种根据权利要求1-2任一项所述的构建方法构建得到的表达三螺旋结构Ⅰ型重组3[0002]胶原蛋白是生物体内一种非常重要的蛋白质，由三条左旋α肽链互相缠绕形成右2α2([0009]所述pPIC9K-P4H(DP)-1质粒是以核苷酸序列如SEQID4[0014]所述pMChZ-AOX载体是对pPIC9K质粒进行如下改造得到：以核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的DNA分子替代所述pPIC9K质粒的4648-9221bp；将所述pPIC9K质粒中位于αMF上[0015]所述pMCrN-AOX载体是以核苷酸序列如SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示的DNA分子分别替代所述pMChZ-AOX质粒上的PpHIS4和Zeocin筛选标记[0016]所述pMCeH-AOX载体是以核苷酸序列如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示的DNA分子分别替代所述pMChZ-AOX质粒上的PpHIS4和PEM7-BleoR-CYC1t5[0042]应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发[0046]以下实施例中使用的毕赤酵母KM71购自Invitrogen；pPIC9K载体购自6在AOX1tt(也称为AOX1transcriptiontermination或AOX1termination)下游(1583-于同尾酶构建体外多拷贝质粒。原始质粒pPIC9K和本发明构建的pMChZ-AOX的质粒图谱如[0055]其中，核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的替代序列两端含lox71和lox66序列，BleoR上游有原核和真核启动子，可用于原核生物和真核生物筛选，AmpR上游有原核启动为AmpR，所示为pAmpR(AmpR启动子)，"__"所示为突变SacⅠ位点的promoter)，"…."同时小写字母部分为pEM7(对应图中EM7promoter)，"__-."所示为789[0065]合成SEQIDNO.10序列(PpENO)和SEQID[0067]ATGGGTAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTCCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAATCAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCGTCAATCGT2α2(2α2([0073]合成SEQIDNO.12序列替换P4H9K法(Lin-CereghinoetaL，2005)制备毕赤酵母菌感受态；将上述4.1中获[0082]6、将上述获得的工程菌株接种于装有10mLBMGY培养基的100mL三角瓶中，于28体，使OD600为2左右，放置于28℃、220rpm的摇床上继续生长3天，每24h向培养基中添加2α2(-P4H可正常表达