ISO 72512005Amd 12023 食品和动物饲料微生物学推定大肠杆菌检测和计数的水平方法最可能数技术修改件1包括培养基和试剂的性能测试标准立项发展报告

食品和动物饲料微生物学推定大肠杆菌检测和计数的水平方法最可能数技术修改件1：包括培养基和试剂的性能测试标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs—HorizontalmethodforthedetectionandenumerationofpresumptiveEscherichiacoli—Mostprobablenumbertechnique—Amendment1:Inclusionofperformancetestingofculturemediaandreagents摘要大肠杆菌（*Escherichiacoli*）作为指示食品和动物饲料微生物安全性的关键指标菌，其准确检测和计数在食品安全监测体系中具有基础性和全局性意义。ISO7251:2005是国际标准化组织制定的食品和动物饲料中推定大肠杆菌检测和计数的水平方法标准，采用最可能数（MPN）技术实现对低浓度污染样本中目标菌的半定量检测。2023年10月12日，国际标准化组织正式发布ISO7251:2005/Amd1:2023修改件，将培养基和试剂的性能测试纳入标准体系，标志着该标准在质量保证维度上的重要完善。本报告系统梳理该修改件的编制背景、技术内容、修订过程及应用价值，分析其对食品微生物检验标准化体系建设的促进作用。修改件的发布回应了实验室质量管理和方法标准化领域的国际共识，有效弥合了方法操作与质量保障之间的标准缝隙，为食品行业微生物检测结果的可靠性和互认性提供了更坚实的标准基础。本报告旨在为从事食品微生物检验、实验室质量管理和国际标准跟踪研究的专业人员提供系统参考。关键词：大肠杆菌；最可能数技术；水平方法；培养基性能测试；国际标准修订；食品微生物学；实验室质量保证Keywords:Escherichiacoli;Mostprobablenumbertechnique;Horizontalmethod;Culturemediaperformancetesting;Internationalstandardamendment;Foodmicrobiology;Laboratoryqualityassurance一、引言食品安全是全球公共卫生治理的核心议题，微生物污染作为食品安全的重大风险因素，其检测技术的标准化水平直接关系到食品安全监管的科学性和有效性。在食品微生物检验中，大肠杆菌被国际社会广泛用作粪便污染指示菌，其检测结果对于评估食品加工过程中的卫生控制水平和判断产品微生物安全性具有关键参考价值。ISO7251:2005《食品和动物饲料微生物学推定大肠杆菌检测和计数的水平方法最可能数技术》是国际标准化组织食品微生物学技术委员会（ISO/TC34/SC9）制定的基础性方法标准。该标准采用最可能数（MostProbableNumber,MPN）技术，通过多管稀释培养和概率统计推定的方式，实现对食品和动物饲料样本中推定大肠杆菌的定性和半定量检测。MPN方法特别适用于目标微生物含量较低或受损微生物可能存在的样本，在乳制品、肉制品、水产品及动物饲料等类别的微生物检验中发挥着不可替代的作用。然而，随着国际实验室质量管理标准ISO/IEC17025的深入实施和食品微生物检验质量保证理念的持续发展，原有标准中培养基和试剂质量控制要求的缺失日益凸显。在这一背景下，ISO/TC34/SC9启动了标准修改程序，经过多轮国际磋商和专家论证，于2023年10月正式发布ISO7251:2005/Amd1:2023修改件，将培养基和试剂的性能测试纳入标准体系，实现了方法标准与质量保证国际共识的有机衔接。本报告以该修改件为对象，从技术内容、编制过程和应用价值等多维度进行系统分析，以期为我国食品微生物检验标准化建设提供参考借鉴。二、标准修订背景与必要性分析（一）原有标准的技术框架与局限性ISO7251:2005确立了一套完整的MPN检测技术流程，涵盖样本制备、增菌培养、分离鉴定和结果计算等关键环节。该方法的基本原理是将待检样本按照一定比例接种至月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose,LST）肉汤中，经35-37°C培养24-48小时后观察产气情况，阳性管转接至大肠杆菌肉汤（EscherichiacoliBroth,ECBroth）进行44-50°C选择性增菌，最终通过吲哚反应等进行推定确认。该标准在保障检测结果的一致性和可比性方面奠定了坚实基础，但面对国际实验室质量管理领域的快速发展，原标准的局限性日益显现：其一，标准正文中对培养基和试剂的质量验证要求仅以一般性文字描述为主，缺乏系统化、可操作的验收标准和性能测试规程，导致不同实验室间因培养基批次差异而产生的结果偏差难以有效控制；其二，随着商品化脱水培养基的广泛使用，培养基的批间一致性已成为影响检测结果可靠性的关键变量，亟需建立标准化的性能测试方法加以规范。（二）培养基质量控制的国际共识在国际标准化组织层面，ISO/TS11133-1:2009和ISO/TS11133-2:2003等文件对食品微生物检验用培养基的制备和质量保证提出了技术规范，其中涉及培养基的物理特性、生物效能及无菌检查等要求，这些技术规范为ISO7251修订中纳入培养基性能测试提供了方法论参考。与此同时，国际食品法典委员会（CodexAlimentariusCommission,CAC）制定的《食品微生物学检验方法指南》明确强调了方法验证和质量控制对确保检验结果可靠性的关键作用。在国际实验室认可领域，ISO/IEC17025:2017《检测和校准实验室能力的通用要求》明确要求实验室应采用满足规定质量要求的方法，确保用于检测的培养基等关键耗材的质量符合方法要求。这一要求在实际运行中产生了明确的技术需求——实验室需要一套可执行、可量化的培养基性能测试方案，以确保所用培养基批次能够支持目标微生物的有效检出并抑制非目标微生物的干扰生长。（三）修订的必要性和紧迫性在上述背景下，ISO7251:2005/Amd1:2023的制定具有明确的技术必要性和行业紧迫性。一方面，方法标准与质量保证标准之间需要建立更强的技术衔接，以确保实验室在依据ISO7251开展检测时具备明确的培养基质量验收依据；另一方面，微生物检测行业的技术进步和实验室管理水平提升，也要求方法标准不断吸纳新的质量保证理念和技术手段。培养基和试剂的性能测试作为微生物检验质量保障的关键环节，其在标准体系中的明确化和规范化已成为国际上食品微生物检验标准化发展的共同方向。三、修改件的主要技术内容（一）培养基性能测试的系统化纳入ISO7251:2005/Amd1:2023修改件将培养基和试剂的性能测试以规范性内容的形式系统纳入标准框架。这一纳入并非简单地引用外部文件，而是结合ISO7251方法流程的具体技术特征，明确了适用于该方法的培养基性能测试要求和操作方案。（二）参考菌株体系的明确修改件系统规定了性能测试所需的参考菌株体系。针对ISO7251方法中涉及的培养基类型和检测目标，修改件引用了国际公认的标准菌株，这些菌株均来源于国际权威菌种保藏机构，具有明确的遗传特征和稳定的表型特性。参考菌株的选择兼顾了方法的适用范围和检测目标：目标菌株方面，选用典型的大肠杆菌菌株作为生产力测试的标准菌株；非目标微生物方面，选用与大肠杆菌系统发育关系较近、可能在食品样本中共同出现的革兰氏阴性菌作为选择性测试菌株，以确保测试结果具有充分的区分度和方法学意义。菌株的接种水平、培养条件和结果判定标准均以定量指标加以规定，使不同实验室之间的测试结果具备可比性。（三）试剂质量要求的补充规定除培养基外，修改件还对方法涉及的生化鉴定试剂（如柯瓦克氏试剂等）的质量验证提出了明确要求。生化试剂作为MPN方法推定确认步骤中的关键耗材，其灵敏度和特异性直接影响目标菌的推定确认结果。修改件明确了试剂验收的基本要求和验证方法，要求实验室在使用新批次试剂前对其进行质量验证，确保试剂的反应特性符合预期。四、标准编制过程（一）标准制定阶段ISO7251:2005/Amd1:2023的制定遵循了国际标准化组织的标准制定程序，由ISO/TC34/SC9（食品微生物学技术委员会）牵头组织。标准修订工作自国际标准化组织内部提出工作提案（NP）立项建议后，经各成员国表决通过正式立项，随后进入工作草案（WD）阶段。在WD阶段，来自各成员国的微生物学家和方法标准化专家围绕培养基性能测试的技术方案开展了多轮深入讨论。讨论焦点集中于参考菌株的选择标准、性能测试的可操作性和结果判定指标等方面。起草组在充分考虑不同发展水平实验室的技术能力基础上，对测试方案进行了反复优化，力求在严格性、科学性和可操作性之间取得平衡。（二）征求意见与审查阶段工作草案经过多轮修改后形成委员会草案（CD），分发给各成员国征求意见。各成员国在为期三个月的公开征求意见期内提交了系统反馈，反馈意见集中于菌株选择的技术合理性、性能测试方案的经济性和实施可行性等方面。起草组对全部反馈意见进行了逐条处理和书面回复，在此基础上形成了国际标准草案（DIS）。DIS阶段是标准制定过程中的关键节点。各成员国对修改件的技术内容进行了最终审查和投票表决，草案以高赞成率获得通过，随后进入最终国际标准草案（FDIS）阶段。在FDIS阶段，未收到实质性技术反对意见，标准文本经国际标准化组织中央秘书处编辑审定后，于2023年10月12日正式发布。（三）标准发布的技术共识修改件在制定过程中凝聚了国际食品微生物检验领域的技术共识，体现了以下三个方面的核心共识：第一，方法标准的可靠性不仅取决于操作步骤的精确规定，还取决于关键试剂和耗材的质量保障，两者不可偏废；第二，培养基性能测试应作为实验室日常质量保证的常规环节，其技术要求应明确、可执行、可验证；第三，国际标准应在技术严苛性和实施可行性之间寻求合理平衡，以利于不同发展水平国家的广泛应用。五、主要参与单位介绍ISO/TC34/SC9食品微生物学技术委员会ISO/TC34/SC9是国际标准化组织专门负责食品微生物学方法标准制定的技术委员会，其工作范围涵盖食品和动物饲料中微生物的检测、计数、鉴定和分型方法的标准化。作为ISO7251系列标准的归口管理机构，该委员会在本次修改件的编制过程中发挥了核心组织作用。该委员会的构成体现了广泛的国际代表性。委员会成员包括来自数十个P成员（参与成员）国家和O成员（观察成员）国家的标准化技术专家，各成员国通过本国标准化机构参与标准制定工作。委员会与联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）下设的食品法典委员会微生物学方法分委员会保持密切合作，还与世界动物卫生组织（WOAH）等国际组织开展协作，确保标准制定工作与国际食品安全治理体系接轨。在ISO7251:2005/Amd1:2023的编制过程中，ISO/TC34/SC9承担了以下主要工作：组织修订工作组的组建和运行，明确工作范围和分工；协调各成员国专家的技术意见，推动技术共识的形成；组织标准草案的多轮技术审查和修改完善；与ISO中央秘书处保持沟通，确保标准制定程序合规推进。委员会的工作机制以技术论证为核心，通过工作组会议、电子邮件通信和全体会议等形式开展技术讨论，确保标准内容的科学性、严谨性和国际适用性。六、结论ISO7251:2005/Amd1:2023修改件的发布是食品微生物检验标准化领域的一项重要进展。该修改件将培养基和试剂的性能测试系统纳入ISO7251方法标准的技术框架，有效填补了原有标准在关键耗材质量保障方面的技术空白，实现了方法标准与实验室质量保证国际共识的有效衔接。本次修改件的技术价值体现在多个层面：在方法可靠性层面，培养基性能测试的明确化有效降低了因培养基批次差异导致的检测结果变异性，提升了MPN方法在不同实验室间的结果一致性；在实验室质量保障层面，修改件为实验室执行ISO/IEC17025关于培养基质量验证的要求提供了明确的技术方案；在国际贸易层面，标准的一致性完善有助于促进各国基于相同技术基准开展食品微生物安全评价，减少技术性贸易壁垒。展望未来，随着食品微生物检验技术向分子生物学方法和自动化检测方向持续发展，ISO7251系列标准仍将面临新的修订需求。建议相关技术机构持续跟踪该标准的后续修订动态，关注培养基性能测试在实际应用中的反馈信息，为我国食品微生物检验标准体系建设提供有益的参考和借鉴。同时，建议国内相关标准化技术委员会适时评估将该修改件转化为我国标准技术内容的可行性，以保持我国食品微生物检验标准与国际标准的同步发展。参考文献[1]ISO7251:2005,Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs—HorizontalmethodforthedetectionandenumerationofpresumptiveEscherichiacoli—Mostprobablenumbertechnique[S].Geneva:InternationalOrganizationforStandardization,2005.[2]ISO7251:2005/Amd1:2023,Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs—HorizontalmethodforthedetectionandenumerationofpresumptiveEscherichiacoli—Mostprobablenumbertechnique—Amendment1:Inclusiono