CN119390859A 一种具有降血糖活性的绿茶细胞壁多糖的提取纯化方法及获得的绿茶细胞壁多糖 （上海交通大学）

一种具有降血糖活性的绿茶细胞壁多糖的本发明涉及一种具有降血糖活性的绿茶细胞壁多糖的提取纯化方法及获得的绿茶细胞壁钠以及1MNaOH和4MNaOH溶液提取得到五种不绿茶细胞壁多糖的活性以及最大程度上降低多22.根据权利要求1所述的一种具有降血糖活性的绿茶细胞壁多糖的提取纯化方法，其(3)将步骤(2)得到的经CDTA提取后的茶渣加入饱和碳酸钠溶液，并在溶液中加入(4)将步骤(3)得到的经饱和碳酸钠提取后的茶渣加入1mol/LNaOH溶液，并在溶液中3.根据权利要求2所述的一种具有降血糖活性的绿茶细胞壁多糖的提取纯化方法，其34.根据权利要求2所述的一种具有降血糖活性的绿茶细胞壁多糖的提取纯化方法，其步骤(1)得到的烘干的茶渣按料液比为1：10的比例加入70％乙醇，室温下摇床震荡置于通风橱晾干，得到醇不溶性的茶渣；将醇不溶性的茶渣按料液比为1：10的比例加入5.根据权利要求2所述的一种具有降血糖活性的绿茶细胞壁多糖的提取纯化方法，其将步骤(2)得到的经CDTA提取后的茶渣按1：10的料液比例加入饱和碳酸钠溶液中加入25mmol/L的NaBH4以保护多糖，在37℃下摇床震荡提取12h，离心后上清液使用6.根据权利要求2所述的一种具有降血糖活性的绿茶细胞壁多糖的提取纯化方法，其将步骤(3)得到的经饱和碳酸钠提取后的茶渣按1：10的料液比例加入1mol/LNaOH溶7.根据权利要求2所述的一种具有降血糖活性的绿茶细胞壁多糖的提取纯化方法，其将步骤(4)得到的经1mol/LNaOH溶液提取后的茶渣按1：10的料液比例加入4mol/L48.根据权利要求2所述的一种具有降血糖活性的绿茶细胞壁多糖的提取纯化方法，其9.基于权利要求1_8中任一项所述提取纯化方法制备得到的具有降血糖活性的绿茶细的4mol/LNaOH溶液提取的多糖中除蛋白后的4mol/LNaOH溶液提取的多糖的总糖含量为6所述除蛋白后的CDTA提取的多糖的糖醛酸为265所述除蛋白后的碳酸钠提取的多糖的分子量达到8.95x103Da；所述除蛋白后的CDTA提取的多糖的半乳糖醛酸含量达到49.83%;所述除蛋白后的碳酸钠提取的多糖的氨基葡萄糖含量达到45.32%;所述除蛋白后的1mol/LNaOH溶液提取的多糖5拉伯木聚糖)分子相互连接，这些分子通过氢键连接到纤维素微纤丝的表面并嵌入果胶基糖，因此顺序提取法是研究植物细胞壁多糖及胞内多糖实际状况的一种合适的可选方法。[0004]茶叶中的茶多糖(Teapolysaccharide，TPS)在中国和日本的传统医学中被广泛6了人们的广泛关注。TPS对人体中的糖代谢相关酶系具有较强的抑制作用并且其降血糖活[0005]本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种具有降血糖活性的绿茶细胞壁[0007]本发明的第一个目的是提供一种具有降血糖活性的绿茶细胞壁多糖的提取纯化上清液，经冷冻干燥后获得CDTA提取的多糖(CDTA_extractedteapolysaccharides，C_[0012](4)将步骤(3)得到的经饱和碳酸钠提取后的茶渣加入1mol/LNaOH溶液，并在溶7合并上清液，经冷冻干燥后获得4mol/LNaOH溶液提取的多糖(4MNaOH_extractedtea获得的碳酸钠提取的多糖、步骤(4)获得的1mol/LNaOH溶液提取的多糖、步骤(5)获得的[0020]将步骤(2)得到的经CDTA提取后的茶渣按1：10的料液比并在溶液中加入25mmol/L的NaBH4以保护多糖，在37℃下摇床震荡提取12h8上清液，经冷冻干燥后获得1mol/LNaOH溶液提取的多糖(1MNaOH_extractedtea心取上清，重复3次，合并上清液，经冷冻干燥后获得4mol/LNaOH溶液提取的多糖(4M的1mol/LNaOH溶液提取的多糖、除蛋白后的4mol/LNaOH溶液提取的多糖中的一种或多除蛋白后的CDTA提取的多糖的半乳糖醛酸含量达到49.83所述除蛋白后的碳酸钠提取的多糖的氨基葡萄糖含量达到45.32所述除蛋白后的1mol/LNaOH溶液提取的多糖的葡(细胞壁多糖)总糖含量最高，为631.12mg/g；CDTA提取的多糖糖醛酸含量最高，为9TPS拥有最高的半乳糖醛酸含量49.83N_TPS拥有最高的氨基葡萄糖含量45.321M_TPS拥有最高的葡萄糖醛酸含量50.54通过组成分析各部分对应茶叶细胞壁中不同多糖[0034]1)本发明提出的一种具有降血糖活性的绿茶细胞壁多糖的提取纯化方法及获得[0035]2)本发明提出的一种具有降血糖活性的绿茶细胞壁多糖的提取纯化方法及获得[0036]3)本发明提出的一种具有降血糖活性的绿茶细胞壁多糖的提取纯化方法及获得均对α_葡萄糖苷酶具有抑制作用，其中4M氢氧化钠提取的多糖的抑制率达[0037]图1为本发明的具有降血糖活性的绿茶细胞壁多糖的提取纯化方法的流程示意[0039]图3为标准单糖和宜昌炒青绿茶水提及细胞壁多糖的离子色谱图(稀释25倍)(其[0045]如图1所示，本实施例提供一种具有降血糖活性的绿茶细胞壁多糖的提取纯化方入2mmol/LCaCl2和淀粉酶，淀粉酶和醇不溶性的茶渣的比例为20mg淀粉酶/5g茶渣(20mg洗涤3_5次后离心取沉淀放置于通风橱中干燥，将干燥后的除去淀粉的茶渣按料液比为1：上清，重复3次，合并上清液，经冷冻干燥后获得CDTA提取的多糖(CDTA_extractedtea[0048](3)将步骤(2)得到的经CDTA提取后的茶渣按1：10的料液比例加入饱和碳酸钠溶[0049](4)将步骤(3)得到的经饱和碳酸钠提取后的茶渣按1：10的料液比例加入1mol/L合并上清液，经冷冻干燥后获得1mol/LNaOH溶液提取的多糖(1MNaOH_extractedtea[0050](5)将步骤(4)得到的经1mol/LNaOH溶液提取后的茶渣按1：10的料液比例加入获得的碳酸钠提取的多糖、步骤(4)获得的1mol/LNaOH溶液提取的多糖、步骤(5)获得的4mol/LNaOH溶液提取的多糖中分别加入三氯乙酸至溶液体系含10％质量浓度的三氯乙[0060]利用高效凝胶渗透色谱法对除蛋白后的水提多糖和四种除蛋白后的茶细胞壁多控制在25℃和30℃,流速为0.3mL/min。[0067]使用戴安DionexICS5000+系统进行分析，[0069]通过傅立叶变换红外光谱法对顺序提取法得到的5种茶多糖(除蛋白后的水提多糖和四种除蛋白后的茶细胞壁多糖(除蛋白后的CDTANaOH溶液提取的多糖、除蛋白后的4mol/LNaOH溶液提取的多糖))的α_葡萄糖苷酶抑制活物，整个实验过程在96孔板中进行。实验中按不同分组依次向板中加入PBS磷酸盐缓冲液10min，然后加入质量分数为1％的淀粉溶液(溶于PBS缓冲液，pH＝6.8)100μL混[0079]根据先前测定α淀粉酶抑制活性描述的方法测定茶多应完毕后加入200μLDNS溶液于沸水浴条件下反应5min，然后快速置于冷水中降至室温终[0082]将经体外降血糖酶抑制活性筛选得到的粗多糖样品溶于磷酸盐缓冲溶液PBS(pHSepharoseFastFlowgel填料的凝胶柱冲洗至平衡后上样，用滴管将多糖溶液缓慢均匀[0084]模拟唾液的配制：准确称取15.1mmolKCl、1.5mmolCaCl2、0.15mmolM[0085]模拟胃液的配制：准确称取6.9mmolKCl、0.15mmolCaCl2、0.12mmolMgC[0086]模拟肠液的配制：准确称取6.8mmolKCl、0.6mmolCaCl2、0.33mmolMgCl2、0.2g胃蛋白酶(3000U/g)和150.0mL模拟胃液混合并快速调节至pH＝3.0以触发模拟胃消发现，不同溶剂提取多糖的得率具有很大差异，其中水提和CDTA提取得率较高，分别为糖提取率下降至1.48其在除蛋白过程中样品损失较大。而CDTA提取的多糖含量在经过2CO3[0105]利用凝胶渗透色谱对顺序提取法得到的5种茶多糖的重均分子量进行测定，测试TPS结构中的主要糖单元。阿拉伯糖主要来源于水提过程中茶叶细胞壁中木质纤维素的分[0119]红外光谱测试结果如图4A，五种多糖样品在多个波数范围内都具有类似的吸收表非共振双键(C＝C)的伸缩振动，指示在多糖组分中存在着酯化的羧基或者不饱和键。1400cm_1处的峰代表C_H键的弯曲振动，这个峰可能来自多糖分子中的碳氢键。1100cm_1_的峰通常代表烯烃或芳烃的C_H面外振动，660cm_1_600cm_1处的峰通常代表糖环的弯曲振存在表明样品中含有糖醛酸结构；在CDTA提取的多糖组分中观察到在915和830cm_1出现吸收峰，表明其中多糖以α_D_吡喃形式的存在；水提多糖及CDTA提取多糖和碳酸钠提取在[0121]使用扫描电子显微镜(SEM)对通过顺序提取法获得的五种多糖成分进行了分析。在提取过程中结构相对完整。使用环己烷二胺四乙酸(CDTA)提取的多糖(C_TPS)显示出松[0125]在茶多糖的纯化过程中，经常使用不同浓度的盐溶液进[0127]通过测定p4M_TPS的化学组成，发现中性糖、糖醛酸和还原糖的含量分别为明DEAE_SepharoseFastFlow离子交换色谱柱具有强大的分离和纯化效果。如图2F所示，