猪病毒病病毒样颗粒疫苗研究进展

猪病毒病病毒样颗粒疫苗研究进展于新友',李天芝I,李峰之(1.山东绿都生物科技,山东滨州256600;2.山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600)摘要:病毒样颗粒(VLPs)是由病毒的一种或多种结构蛋白在异源系统内重组表达,并自动装配成的一种不含病毒核酸的空心颗粒。与传统疫苗相比,VLPs具有相当的免疫原性和更好的平安性而成为一种理想的疫苗形式,是最有开展潜力的新型基因工程疫苗。本文就VLPs疫苗在猪病毒病防治应用方面的研究进行综述,以期为猪病毒病的防控工作提供新的思路。关键词:病毒样颗粒；疫苗；猪病毒病；防治RR金工程:山东&现代农业产业技术体系生猪产业创新团队工程(SDAIT-08-17)作者简介：于新发(1983—),男.山东荷泽人，执业善医师，硕士，主要从事猪病诊断技术研完病毒样颗粒(Viruslikeparticles,VLPs)是由病毒的一种或多种结构蛋白在异源系统内重组表达,并在该系统内或系统外自动装配成的一种不含病毒核酸的高度结构化空心颗粒叫VLPs大小介于15-400nm之间⑵,形态上类似于真正的病毒粒子,不含病毒核酸,无法复制和扩增,因此,不具有感染性,平安性好叫VLPs保存了天然病毒粒f的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位,免疫原性强,可模拟病毒感染途径,被呈递给免疫细胞,激发机体细胞免疫、体液免疫及黏膜免疫等免疫应答。VLPs具有病原体相关模式分子的活性,也可激活固有免疫应答。VLPs疫苗作为一种新型的亚单位疫苗,具有稳定性高、免疫原性好、平安性高"适宜大规模生产等优点。与传统疫苗相比,VLPs具有相当的免疫原性和更好的平安性而成为一种理想的疫苗形式,自从出现后就受到了人们的普遍重视,VLPs在结构上允许外源基因或墓因片段的插入而形成嵌合型VLPs并将外源性抗原展示在其外表。此外,女数病毒VLPs还具有包裹核酸或其他小分子的能力,可作为基因或药物的运载工具&气是研制平安高效的预防病毒性疾病的潜在候选疫苗。迄今为止,国内外针对VLPs进行了大量的研究,本文就VLPs在猪病毒病防治应用方面的研究进行综述,以期为猪病扉病的防控匚作提供新的思路。1VLPs的免疫机制与其他亚单位疫苗和电组蛋白疫苗相比,VLPs的免疫原性更强,可诱导机体产生体液免疫应答反响,主要是VLPs的抗原表位与天然病毒类似,井高度模仿了天然病毒的空间构象,表而有可被B淋巴细胞外表受体识别的成分,活化B淋巴细胞,上调组织相容性复合体MHCII类分子水平,刺激机体产生特异性中和抗体,从而诱发免疫反步研究。目前HPS的临床发病率远远高于别离率,原因在于HPS体外培养营养要求较高叫培养基中需要参加NAD(氧化型辅酶1)w和牛血清,且HPS抵抗力不强,在体外很容易死亡,别离时,病料必须是新鲜的组织,不能冻存,采集的病料在冷藏条件下不能超过1周地细菌别离鉴定时应当采集处于病急性期的猪并且没有使用抗生素的病料叫否那么别离率大大降低。目前防治副猪嗜血杆菌病的主要方法是抗生素的应用及灭活疫苗的使用。但随着抗生素的长期使用,HPS的耐药性越来越强,药物治疗对副猪嗜血杆菌病的防治巳愈发困难,HPS发病严重的猪场,使用疫苗来预防是可选方案陶。参考文献111兰晓雁.安康关键词:影子病【JI.安康生活,20XX(1):11-12.12]叶&贺云霞,徐慧,等.副猪嗜血杆倘病研究进展U1.动物医学研究进展,20XX,32(2)101-1()4.(3JMACLNNESJI,GOTTSCHALKM,LONEAG,etal.PrevalenceofActinobacilluspleuropneumoniae,Actinobacillus,Haemophilusparasuis,Pasteurellamultocida,andStreptococcussuisinrepresentativeOntarioswineherds[J].CanJVetRes,20XX,72(3):242-248.[41李曦婷,王超,薛彦杰,等.一例副猪噂血杆菌的别离鉴定及16SrRNA生物信息学分析[JI.沈阳农业大学学报,20XX,47(4):438-444.|5|KIELSTEINAP,WUTHEBIIH,ANGENCO.PhenotypicandgencticcharacterizationofNADdependentPasteurellaceaefromtherespiratorytractofpigsandtheirpossiblepathogeneticimportance|J|.VetMicrobiol,2001,81:243-255.[6|王建,邵卫星,吕占军,等.20XX年我国局部省市规模化猪场副猪嗜血杆俯分离鉴定及菌株血清分型IJL动物医学进展,20XX,35(3):4852.17]魏凤,张文通,李峰,等.副猪嗜血杆菌病实骋室诊断方法禁述IJI.猪业科学,20XX.34(5):54-55.⑻易新健,王小波,高清清,等.苏皖地区副猪嗜血杆菌的别离鉴定与三价灭活疫苗的初步研制[J].中国兽医学报,20XX.37(5):823-827.(收稿日期：20XX—08—30)应。外源的VLPs也能通过穿插提呈的方式,通过MHCI类途径进行提呈,从而活化CD8T细胞,实现CD8细胞介导的保护性免疫反响,这对于去除细胞内的病原体如病毒等令关重要。因在递呈给树突状细胞加上、被MHCII类分F展示以及直接引起树突状细胞成熟和迁移的过程中,VLPs的大小适合被树突状细胞(DCs)通过吞噬、渗透及Toll样受体(TLR受体)介导等方式高效摄取,所以具有-定的免疫佐剂分T*效应,单独免疫动物就能诱导机体产生较强的免疫应答反响。VLPs能模拟大然病卷的体内感染过程,从而激活抗原递呈细胞,尤共是进入树突状细胞(DCs)后,能上调DCs的数最井促进其成熟,使其细胞外表分"如CD40、CD80、CD86及MHCI和II类分F表达水平明显上调,同时促进DCs分泌IL-6,IL10、MIP1a及TNEa等细胞因*,从而诱导机体产生细胞免疫应答。2猪病毒病病毒样颗粒疫苗研究进展2.1猪圆环病毒病猪圆环病毒2型(PCV2)是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征的主要病原,此外,PCV2还与猪呼吸道综合征、猪皮炎与肾炎综合征和繁殖障碍以及肠炎等疾病有关,是一种免疫抑制性疾病,给世界养猪业造成严重的经济损失赵晓云等叫根据大肠杆菌密码P使用频率表优化合成PCV2NJ株ORF2基因,将其插入原核表达载体PQZ1,鉴定阳性后转入表达宿主菌BL21,对重组菌进行诱导表达。SDSPAGE结果说明PCV2NJ株优化的ORF2基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达产物以完全可溶性形式存在Fl菊体超声波破碎后的上清液中,Westernblotting分析结果显示,表达的取组Cap蛋白能够与PCV2阳性血清发生反响,电镜观察,可见大最反径17nm左右的PCV2VLPs存在F超声破碎后的上清液中,500Mg/头重组VLPs疫苗免疫猪产生较高的抗体水平,单次免疫后21d抗体100%到达合格,对PCV2强毒的攻击提供完全保护。chi等⑼采用同源重:组技术构建r含PCV2的Cap基因的重组PRV病毒株gE()/PCV2cap(+)PRVo通过间接免疫荧光试验(IFA)和Westernblotting方法证实S组病毒复制过程中可表达Cap蛋白。电引显微镜结果显示,所友达的Cap蛋白能组装成VLPs。用纯化的VLPs免疫小鼠和豚鼠可产生针对PCV2Cap的特异性免疫应答。2.2猪口蹄疫口蹄疫(FMD)是由II蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物常发的一种烈性传染病,猪II蹄疫临床表现七要:为蹄冠、趾间、蹄踵皮肤发生水泡和烂斑,局部猪口腔黏膜和鼻盘也有同样病变。潘群兴等I"将。型FMDVVP1中编码T细胞表位肽(aa21aa40)If列连接于PPVVP2的5'端,并插入到杆状病毒供体质粒pFastBacHTA中,构建成重组转座载体pFastBacFMDVVP1PPVVP2,转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌感受态DH1OBac中,经蓝白菌落筛选获得重组杆状病毒表达质粒rBacFMDV-VP1-PPV-VP2,转染昆虫单地夜蛾细胞(S⑼,井在Sf9中进行了表达。电镜观察显示,表达的重组蛋白能自我组装成病毒样颗粒,用IFA.Western-blotting分析说明,表达产物具有与PPVVP2天然蛋向相似的免疫原性。小鼠免疫实验证实,在低浓度FMDV抗原下能够产生特异性T淋巳细胞增殖反响,而H.该病柩样颗粒能诱导机体产生抗FMDV特异性细胞免疫反响。黄艳美等"根据猪源FMDVVP1上第141160位氨基酸序列设计引物,利用敢叠延伸PCR技术将该序列插入在大肠杆曲噬菌体MS2外壳蛋白基因的特定位点。然后连接到原核表达载体pET28a上,构建F直组表达质粒28aCPVP1,转化BL21,ITPG诱导表达得到融合表达的CPVP1蛋白,透射电产显微镜卜观察融合蛋白CPVP1成类VLPs状。间接ELISA试验证实该蛋白能够特异地结合豚鼠抗。型FMDV的阳性血清,30pg的CPVP1的VLPs蛋白免疫小鼠后,可以诱导其产生高效价的特异抗体。窦小龙等"为制备Asia1型FMDV双层结构病毒样颗粒,选择牛病毒性腹泻病fU(BVDV)流行株核心蛋白P14的第169270位氨基酸FMDVAsial/JS/CHA/05结构蛋白VP1的第1211位氛基酸,两假设之间设计柔性肽连接,人上合成P14柔性肽VP1融合蛋白编码序列,全基因长990bp。合成基因与枯草芽胞杆菌表达载体P7257P43连接,构建成表达质粒P7257P43P14-VP1。转化枯草芽胞杆菌WB800,经筛选、鉴定,获得表达P14VP1融合蛋白的枯草芽胞杆菌。该重组表达菌在含有40口g/mL氯霉素的LB中培养后,菌体超声破碎可检测到「I的蛋白。Western-blotting结果显示,该蛋白能特异性识别Asia1型FMDV抗体,具有良好的反响原性。电镜观察显示,融合蛋白组装为直径约50nm大小的VLPs。盛蓉等I国以兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60为载体,分别在RHDV衣壳蛋白的C端、N端、306和307位氨基酸之间插入FMDVB细胞表位(VP1200213aa),得到嵌合VP60基因。利用杆状病扉表达系统表达嵌合蛋白,分别命名为VP602F、VP60306F和VP60578F。通过电镜观察嵌合蛋白自聚为病扉样颗粒的能力,动物免疫试验结果显示,将病毒样颗粒免疫小鼠后均叮产生针对VP60和B细胞表位特异的免疫应答。2.3猪细小病毒病猪细小病毒病是由猪细小病逐(PPV)引起的母猪繁殖障碍性疾病,k要临床表现为流产、产死胎、产畸形胎、胎儿木乃伊化和不孕等,初产母猪受到的危害最为严®,H,oVP2是PPV的主要衣壳蛋白,具有良好的免疫原性,当用体外表达系统表达时能自我装配形成VLPso另外,VP2蛋白可以作为一种抗原的转运载体,携带外源表位,组装成联合表位VLPs,嵌合表位VLPs免疫动物具有双重的免疫效果。Antonis等"用杆状病荏产生猪细小病就样粒*,用低于1口g的该VLPs以油包水的形式分别免疫豚鼠和猪,均产生了很高的血清抗体滴度,仅用0.7fg猪细小病毒样粒P免疫母猪,一次免疫就可以保护胎儿不受致死剂量的PPV的攻击。陈杨1,61扩增rPPVSC1株VP2基因,将共插入真核兴旺我体PPI2.EGFP中.构建转移载体pPI2.EGFP.VP2。采用脂质体介导法将猪伪狂犬病病卷(PRV)SA215株DNA与pPI2.EGFP.VP2DNA共转染Vero细胞获得再组病毒PRVSA215/VP2株。以免抗VP2的多克隆抗体建立的免疫荧光技术可检测到Vero细胞发出的特异性荧光,说明PPVVP2成功插入到PRVSA215基因组中,并获得表达。进•步电镜观察说明,感染PRVSA215/VP2的Vero细胞中可同时观察到PRV与PPV两种VLPso徐志文等⑰构建了含PCV2ORE2基因和PPVVP2基因的重组质粒pEGEPVP2.ORF2,由脂质体介导转染Vero细胞,对转染细胞进行电镜检测,结果观察到VLPs存在。将纯化后的VLPs免疫仔猪,检测其血中T淋巴细胞的动态变化以及血清抗体水平・。结果免疫仔猪的CD3.CI)4T淋巴细胞在外周血淋巴细胞中的比率均有一定程度的升高,CD8T淋巴细胞在免疫后7〜14d有所下降,之后再升高。抗体检测结果说明,免疫动物血清11」有较高水平的PPV、PCV2特异性抗体。2.4猪乙型脑炎日本脑炎(JE)是由乙型脑炎病毒(JEV)引起的感染性疾病,JEV可引起母猪繁殖障碍,给养猪业带来I［大损失。JEV基因组为单股正链RNA,全长约llkb,含有三个结构蛋白,衣壳蛋白(C),膜前体蛋白(prM)和包膜糖蛋白(E)。其中prM蛋白成熟后被剪切成M蛋白,与病毒感染能力相关,是病毒诱发保护性免疫的重要:协同成分,可产生微弱的中和抗体。E蛋为糖蛋白,是诱导产生中和性抗体的E要抗原成份,可介导膜融合,引起血凝反响。张艳芳等"I将乙型脑炎病荏prME及其信号肽基因片段克隆到穿梭载体AcBacinid中,构建币:组穿梭载体AcBacprMEo其转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒AcprMEoWesternblotting%In］接免疫荧光试验及电镜观察,证实AcprME介导prME在Sf9细胞中高效表达,11.形成r病毒样颗粒。小鼠免疫和攻毒试验说明,该病春样颗粒免疫可以使小鼠获得有效抵抗乙型脑炎病荏强毒株攻击的能力,保护率高达100%。2.5猪繁殖与呼吸综合征猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的母猪繁殖障碍性疾病,临床表现主要为流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎,妊娠母猪的后期流产,流产率可达30%以上,小猪的死亡率在35%〜40%oPRRSV可经口腔、鼻腔、肌肉及生殖道等多种途径感染猪发病。王璐等的为构建商致病性PRRSV(HPPRRSV)VLPs疫苗,以HP—PRRSVCQ株的GP5和M蛋白的全部编码基因为模板,利用杆状病毒-昆虫细胞友达系统能够成功地共兴旺页组质粒pFastBaclGP5M的GP5蛋白和M蛋白,并能自动装配成VLPs,电镜观察到VLPs的直径约为50mn,该VLPs与天然蛋白类似的免疫原性。吕凤林等网公开f一种PRRSVVLPs的研究方法。i亥疫苗是由PRRSVGP5.M、N3种蛋白构成的VLPs,动物试验结果说明,形成的VLPs参加或不参加佐剂制备的注射剂型、滴卵剂型、饮水剂型,免疫不同时期的猪群都能够平安有效地预防PRRSV感染。Nam等⑵I利用杆状病屈表达载体,在Sf9昆虫细胞中同时表达GP5和M蛋白,成功制备出PRRSVVLPs,用蔗糖梯度离心方法对其进行纯化,并用不同量(0.5Mg、1.Opg、2.0Mg、4.0Mg)纯化后的蛋门混合弗氏佐剂免疫小鼠,检测血清抗体效价和细胞因fTL4.1LT0、IFNY水平,结果显示,该疫苗可以有效引起机体的细胞免疫和体液免疫,其中GP5抗体效价显著高于阴性对照,免疫4.0Mg剂此的IFNY水平显＞著高于阳性对照,但阳性对照的IL4.IL10细胞因子水平高「试验组,同时仅在免疫2.Opg和4.0MgVLPs的小鼠体内检测到中和抗体水平2.6猪瘟猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的•种猪急性、热性、高度接触性传染病,在世界范围内广泛流行,其发病率和死亡率均高,对养猪业危害十分严甫。范京惠等豚构建了含CSEV的优势T细胞表位E290和PPVVP2基因的成组PMVP2E290,与BacNBlucDNAJt转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒将传3代的®组杆状病毒接种于形成50%单层的sf9细胞,应用免疫电镜对表达产物进行观察,叮见到许多VLPs,表明目的基因在杆状病扇表达系统中得到「表达,表达的蛋白能自我装配成VLPs,大最表达VLPs后,在无佐剂参与的情况卜,按确定的免疫程序免疫6〜8周龄的BALB/c小鼠,检测小鼠的细胞免疫和体液他疫学指标。结果说明,该VLPs不仅能诱导小鼠机体产生抗CSFV的特异性CTL反应,还能刺激小鼠产生抗PPV的特异性中和抗体。2.7猪传染性胃肠炎猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种以呕吐、水样腹泻、脱水为七要特征高度传染性疾病,各种不同品种和日龄的猪都能感染,2周龄受到的危害最为严重,死亡率可高达100%。冷勇等网构建了含TGEVM和sM结构蛋白基因的币:组杆状病荏rBacM和rBacMsM,将重组杆状病毒rBacM和rBacMsM分别感染sf9昆虫细胞,进行VLPs的体外组装试验。结果说明,M蛋白任sf9细胞内即.独表达,M蛋自和sM在sf9细胞内共同表达,都可形成TGEVVLPs,而且病毒粒F大小不等,直径在61〜101nmo2.8猪流感猪流感(SI)是由猪流感病屈(SIV)引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病。各种(1龄和品种的猪均易感,临床上主要表现为发病急、呼吸困推、咳嗽、流汨、鼻液增多、衰竭、低死亡率等121|0在我|国猪群中流行的Ifil清烈I：要是II1N1、H1N2和H3N2OQuan等心用杆状病茬表达系统表达fIHN1流感病毒血凝素和基质蛋自,共同感染昆虫细胞后形成VLPs。用该VLPsI1/L注免疫小鼠•仅免疫•次,即可诱导小鼠产生以IgG2a为主的抗体反应,并IL产生很高的血凝抑制滴度和记忆性IgG和IgA反响,更重要的是低剂知的VLPs就叮产生抵抗致死剂量病爸感染的保护作用。3小结与展望VLPs作为•种新型亚单位疫苗,且有多种优点,不含有病毒核酸,不具有感染性,能模拟天然的病花粒易被免疫系统识别,不需要佐被,低剂!|1:免疫后就能刺激机体产生R好的免疫应答发应,因此,在某此程度上,有替代传统的疫苗的潜力,在动物疾病的防治方面有广阔的应用前景。但在VLPs的研制过程中也存在・些问题,首先,VLPs疫苗的设计、表达、组装及纯化等对技术条件要:求比拟高,而且不是所有病毒都能组装成VLPs。其次,当组装多种蛋白形成的病荏样粒fill,各个基因表达ft的比例难以控制,兴旺不同蛋白的载体进入同•细胞的几率小,产生VLPs的儿率相对降低,建立多基因共表达载体的难度大。另外,某些蛋白可能对细胞具有荏性,使其表达量较低,甚至引起其他蛋门的表达1:降低,从而导致VLPs装配效率的下降。再次,如何有效放大工艺水平,提高VLPs的组装效率,降低本钱等方面也存在者诸多挑战。最后,VLPs采用不同的免疫途径,其免疫效果不同,需要对不同的VLPs的免疫途径进行研究,找出最正确的免疫途径。开展多样的VLPs疫苗将是一个趋势。VLPs作为一项新兴的技术,在新型猪病疫苗的研制中代表了•种非常有前途的研究方向.相信通过各国专家学#的共同努力,不久的将来VLPs疫IVI必将为猪病琵病的防控提供新的技术手段。参考文献111张刷,「•在江,周剑芳,等.流感病毒样颗粒疫苗研究进展IJ].病隹学报,20XX,27(4):402408.121怦带,毕胜利.病毒样颗粒疫苗的研究进展IJ1.病蔑学报,20XX,27(4):37X382.|3|李少伟,夏宁邵.大肠杆菌表达的病标样颗粒疫苗IJ].生命的化学,20XX,34(1):13-22.|4|E亚君,牛育平.病荏样颗粒疫苗的研究进展IJI.黑龙江畜牧兽医,20XX(8):2526.[5|张抱,刘春燕,宋淑霞.病旄样颗粒疫苗的研究进展[J|.细胞与分F免疫学杂志,20XX,24(11):1126-1128.|6|杨靖佳,井巾荣,曾后桁・病版样颗粒在疫苗研究中的进展IJL云南大学学报(n然科学版),20XX,3KS1):495498.|7|「•新友,乍大芝.环介导等温扩增技术及我在猪病病原检测中的应用研究进展UI.猪业科学.20XX,33(7):3843.|8|赵晓云,乔绪密,陈瑾,等.利用E.coli兴旺猪圆环病毒2型Cap蛋白生产病荏样颗粒疫苗[Jl.中国农业科学20XX,4X⑸:9769X6|9|CHIJN(客),谢冰(摘洋).猪圆环病击2型病卷样颗粒的制备及其在疫苗研制中的应川|J|.中国畜牧件医,20XX,41⑹:22.11()1潘群兴,上永山,何孔旺,等.砌友达LI蹄疫病茬T细胞表位猪细小病强病养样颗粒的制备|J|.中国预防兽医学报,20XX,32(11):844-84X.【111荒电类,张国广.汪卫,等・MS2介导的口蹄疫类病治颗粒疫苗的研究U1.原门大学学报(自然科学版),20XX(2):237243.1121窦小龙,任晓冰,魏婕,等・II蹄疫病M：VP1蛋门病焜样颗粒表达系统的构建[JI.动物医学进展,20XX,35(3):1114.[13]盛蓉.宋艳华,胡波.等.携带【I蹄疫病版B细胞表位的兔出血位的嵌样颗粒的表达及其免疫原性研究UI.牛北农学报,20XX,30(1):142149.[14|乍天芝,F新友,谢金文,等•猪细小病推分『生物学诊断技术及基因「•程疫苗的研究进展[J].养猪,20XX(3):125128.|15|ANTONISAF,BRUSCIIKECJ,RUEDAP,ctal.Anovelrccoinbinantviruslikeparticlevaccineforpreventionofporcineparvovirusinduccdreproductiv