CN119403574A 双半抗原和三半抗原缀合物、组合物、制备方法及其治疗方法 （普渡研究基金会）

2024.12.19PCT/US2023/0659242023.04.19WO2023/205669EN2023.10.26一种具有式TL_L_Hn的缀合物，其中TL是病2nTL是病毒、病毒感染细胞、癌症细胞、免疫细胞或成纤维9.根据权利要求1所述的缀合物，其中至少一个H是选自血34TL是病毒、病毒感染细胞、癌症细胞、免疫细胞或成纤维TL是病毒、病毒感染细胞、癌症细胞、免疫细胞或成纤维b547.根据权利要求38或39所述的缀合物，其中至少一个半抗原是选自血凝素和神经氨48.根据权利要求38或39所述的缀合物，其中至少一个半抗原是选自L_HBsAg、S_51.根据权利要求38_41中任一项所述的缀合物52.根据权利要求38_41中任一项所述的缀53.根据权利要求38_41中任一项所述的缀合54.根据权利要求38_41中任一项所述的缀合物，其中所述靶蛋白是冠状病毒刺突蛋55.根据权利要求38_41中任一项所述的缀56.根据权利要求38_41中任一项所述的缀合58.根据权利要求38_41中任一项所述的缀合物，其中所述靶蛋白是叶酸受体α或叶酸59.根据权利要求38_41中任一项所述的61.根据权利要求38_41中任一项所述的缀合物，其663.根据权利要求38_41中任一项所述的缀合物，其64.根据权利要求38_41中任一项所述的缀合物，其65.根据权利要求38_41中任一项所述的缀合物，其中66.根据权利要求38_41中任一项所述的缀合物，其67.根据权利要求38_41中任一项所述的缀合物，其中68.根据权利要求38_41中任一项所述的缀合物，其中所述靶向配体是奥司他韦片段、70.根据权利要求38_41中任一项所述的71.根据权利要求38_41中任一项所述的缀合物，其中所述靶向配体是5_甲基四氢叶76.根据权利要求39或40所述的缀合物，其中La、Lb和78.根据权利要求38或40所述的缀合物，其中La、Lb和Lc各自独立地包含C2_C18烷基基781.根据权利要求79或80所述的缀合物，其中一个或更多个所述一OH基团独立地被巯1C6烷基基团。并且R2是C1C6烷基基团。其中R3是C1C6烷基基团。889.根据权利要求88所述的缀合物，其中L1、L2和L3中的一个或更多个包含(_CH2CH2_93.一种药物组合物，包含权利要求1_91中任一项所述的缀合物和药学上可接受的赋94.一种治疗受试者病毒感染的方法，包含向所述受试者施用有效量的权利要求1_9195.根据权利要求94所述的方法，还包含向所述受试者施用自体抗体或同种异体免疫97.根据权利要求94_96中任一项所述的方法，其中99.根据权利要求94所述的方法，其中所述缀合物或所述药物组合物每天施用一次以107.根据权利要求94_104中任一项所述的方法，还包含向所述受试者施用第二疗法，9110.根据权利要求108所述的方法，其中所述免疫反应在所述受试者靶向区域中被激111.根据权利要求108_110中任一项所述的方法，还包含向所述受试者施用自体抗体112.根据权利要求110所述的方法，其中施用有效量的所述缀合物或所述药物组合物在所述靶向区域中诱导M2型巨噬细胞重新编程为[0002]本发明包括包含两个或更多个半抗原的缀合物，以及包含此类缀合物的组合物[0004]众所周知的Fc介导(片段可结晶结构域介导)抗体效应功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。此力和选择性与免疫复合物(IC)参与的免疫效应细胞的细胞毒性功能缬氨酸(V)或苯丙氨酸(F)，其中在位置158位有V的同种型对IgG1的Fc结构域具有高亲和结合产生了比FcγRIIIa_F158体外细胞毒性效力更强的体外细胞毒性效力。与天然Fc相抗体对FcγRIIa的亲和力增强，使得ADCP活性增强所证实。主要是，Fc变体对FcγRIIa_以及由携带FcγR的效应细胞介导的ADCC和/或ADCP清除。[0007]几乎所有经FDA批准的治疗性抗体都是全尺寸IgG1抗体，大小约为150kDa。aH1和H2是半抗原。nC5烷基1d1的整数。在所述缀合物的某些实施方案中，La、Lb和Lc中的至少一种各自独立地包含：(_b和Lc可以各自独立地包含C2_C18烷基基团。[0044]所述激活免疫反应的方法还可以包含向所述受试者施用自体抗体或同种异体IgG体(TL)和两个半抗原(每个H)，所述靶向配体对病毒或病毒感染细胞的神经氨酸酶(即受内施用人类IgG(IVIg(GAMUNEX8_C))和48hpi施用缀合物的小鼠(n＝5/组)感染后天数IgG(IVIg(GAMUNEX8_C))和96hpi施用缀合物的小鼠(n＝5/组)感染后天数与存活率[0067]图18是静脉(IV)施用单次剂量1.5μmol/kg(n＝2只小鼠/时间点)的[0069]图20A是与剂量递增研究相关的感染后天数与存活率(％)的关系图，其中小鼠感[0070]图20B是与图20A的剂量递增研究有关的感染后天数与体重％的关系图，图20A中[0075]图25的图显示Balb/c小鼠在感染10LD50A/H1N1/PR8/1934病毒(第0天)并在感染[0078]图28A和图28B分别显示了Balb/c小鼠IV施用化合物24剂量递增研究中感染后天[0079]图29A和图29B分别显示了在比较Balb/c小鼠施用本文中所述缀合物与单半抗原[0080]图30A和图30B分别显示了比较对感染各种流感病毒株的Balb/c小鼠施用所述缀型流感/California/07/2009(H1N1)pdm09+化合物24治疗组；(B)是甲型流感/Wisconsin/是甲型流感/California/07/2009(H1N1)pdm09+PBS对照组；(E)是甲型流感/Wisconsin/[0083]图33显示了从感染甲型流感/H1N1/PR8/1934并用1)PBS、2)通过IV的化合物24或3)通过OG的化合物24治疗的小鼠体内采集[0084]图34显示了用化合物24(口服或静脉)治疗后或未治疗的病毒感染小鼠肺部或肾[0094]图44显示了与CDC测定相关的数据，在叶酸盐双半抗原(化合物150＝FDH)浓度比的关系图中示出，该图显示了化合物150在体外作用于对多种小鼠和人类癌症细胞系231＝化合物150并且MDA_MB_231_comp＝叶酸盐_葡糖胺竞争物，作用于MDA_MB_231细胞；物150并且THP_1_comp＝叶酸盐_葡糖胺竞争物，作用于THP_1细胞(用作急性髓系白血病[0096]图46显示了与化合物150体内小鼠肺癌疗效研究相关的数据，在肿瘤体积与肿瘤[0097]图47显示了与图46化合物150的体内肺癌疗效研究相关的数据，在受试者体重百[0098]图48显示了与化合物150的体内人类肺癌疗效研究相关的数据，在肿瘤体积与肿[0099]图49显示了与图48化合物150的体内人类肺癌疗效研究相关的安全数据，在受试[0100]图50显示了与化合物150的体内小鼠结直肠癌疗效研究相关的数据，在肿瘤体积[0101]图51显示了与图50化合物150的体内结直肠癌疗效研究相关的安全数据，在受试者体重百分比与肿瘤植入后天数的关系图中示出(PBS([0105]图55显示了与图54化合物150的体内人类肺癌疗效研究相关的数据，在受试者体[0108]图58显示了化合物150与抗PD1+化疗治疗的体内小鼠肺癌比较疗效研究的相关数[0109]图59显示了与化合物150的体内小鼠肺癌(冷性)疗效研究相关的数据，在肿瘤体[0110]图60显示了与体内小鼠肾癌(Renca细胞系)疗效研究相关的数据，在肿瘤体积与仅在感染细胞表面上表达)，或在靶细胞上过表达的受体(例如癌症细胞上的叶酸受体统(例如，邻近靶细胞)以募集免疫细胞或b++桥和利弗席兹_范德华(Lifshitz_vanderWaals)键等。[0125]所述缀合物的靶向配体可以特异性识别靶向受体，例如靶细胞表面上的靶蛋4氨基4脱氧N10甲基蝶酰谷氨酸(二氯甲氨喋呤)。bbc和Ld中的每一个都可以具b2CH2_O_)n是指两被取代或未被取代的三唑部分其中如果被取代则取代可以是羰基烷基基团和可以任选地文中的其他缀合物可以根据实施例1和/或19的所述方法以及本领域已知的此类其他方法形成的。前药通常可以使用众所周知的方法制备，例如Burger’sMedicinalChemistryandDrugDiscovery6thed.(DonaldJ.Abrahamed.,2001,Wiley)和DesignandApplicationofProdrugs(H.Bundgaarded.,1985,HarwoodAcademicPublishers的水解。在施用所述前药以对靶向区域中的免疫细胞进行重新编程和/或减缓靶向区域中[0156]所述化合物和任选地一种或更多种其他治疗剂可以以其本身(纯形式)或以药学受的盐可以方便地用于制备其药学上可接受的盐。此类盐包括但不限于由以下酸制备的合物的所有药学上可接受的盐，还包括所述缀合物式或其盐的任何和所有水合物和/或溶是指缀合物或其盐，其还包括化学计量或非化学计量量的以非共价分子间力结合的溶剂。[0167]药物组合物可以通过根据本领域已知和下文所述的方法将一种或更多种缀合物[0169]所述缀合物或药物组合物的溶液可以是水性的，任选地[0175]无菌可注射溶液可以通过在所需量的适当溶剂中将所述药物组合物与上述其他赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)清除抗体(Ab)包被的病毒或抗体包(carcinomaoftheendometrium)、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病(Hodgkin’s[0183]所述第二疗法可以包含施用(例如有效量)叶酸盐toll样受体7(FA_TLR7)激动剂缀合物。由于FA_TLR7激动剂可以通过将促肿瘤巨噬细胞转化为抗肿瘤巨噬细胞来重新编实施方案中，用于激活受试者免疫反应的方法包含向所述受试者施用有效量的上述缀合疫反应可以在所述受试者的靶向区域(例如TME或物的水解和/或减缓细胞因子在所述受试者靶向区域[0187]所述激活免疫反应的方法还可以包含向所述受试者施用自体抗体、同种异体IgG[0188]施用有效量的所述缀合物或组合物可以在所述靶向区域诱导M2型巨噬细胞重新靶向叶酸受体(例如FRβ)的靶向部分，例如案利用所述叶酸受体的有限表达将全身施用的缀合物和组合物直接定位到叶酸盐表达细设计有利地防止了免疫系统的全身激活(即减少了在某些实施方案中，本文中所述缀合物或组合物可以与包含施用有效量的FA_TLR7激动剂的第二疗法一起施用，所述激动剂可以通过进一步促进激活的巨噬细胞转化为抗肿瘤(M1样)巨噬细胞与本文中所述缀合物/组合物发挥协同作用。进行防范性(prophylactic)或预防性(preventative剂量以实现最高疗效完全在本领域技术人员[0194]对于临床使用，任何化合物的施用量可以等于或相当于所述受试者每天每千克(kg)体重0.2_2,000毫克(mg)的化合物。所述化合物施用的剂量可以等于或相当于所述受试者每天每kg体重2_2,000mg化合物。所述化合物施用的剂量可以等于或相当于所述受试天每kg体重100_2,000mg化合物。所述化合物施用的剂量可以等于或相当于所述受试者每[0197]所述缀合物施用的剂量范围可以是约0.2毫克/kg/天至大于约100mg/kg/天。例0.5mg/kg/天至5mg/kg/天、0.75mg/kg/天至50mg/kg/天、0.75mg/kg/天至25mg/kg/天、1.0mg/kg/天至25mg/kg/天、1.0mg/kg/天至20mg/kg/天、1.0mg/kg/天至15mg/kg/天、kg/天至50mg/kg/天、2mg/kg/天至25mg/kg/天、2mg/kg/天至20mg/kg/天、2mg/kg/天至[0199]所述缀合物或其前体施用的浓度范围可以是0.01微摩尔至大于或等于500微摩EnzymeAdducts,”In:EnzymesasDrugs,HocenbergandRoberts,eds.,Wiley_Interscience,NewYork,N.Y.,pp.367_383(198propertiesofadductsofstreptokinaseandstreptokinase_plasmincomplexwith常见的惰性成分实例是乙酸纤维素苯三酸酯(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP50、HPMCP55、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、EudragitL30D、淀粉或其他可食用纸。对于丸剂、锭剂、模制片或片剂研制物，可以使用湿法块化技术[0207]所述缀合物可以以粒径约为1mm的颗粒剂或丸粒形式作为细多颗粒包括在配制物中。胶囊剂施用材料的配制物也可以作为粉剂、轻微压缩的药棉(lightlycompressed[0209]可以用惰性材料稀释或增加所述化合物的体积。这些稀释剂可以包括碳水化合作填料，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些市售稀释剂是Fast_Flo、Emdex、STA_Rx料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商业崩解剂Explotab。可以使用羧甲基淀粉钠、[0211]粘合剂可用于将所述化合物固定在一起形成硬片剂，包些表面活性剂可以单独或作为不同比例的混合物存在于所述化合物或其衍生物的配制物[0215]可口服的药物制剂包括由明胶制成的推入配合式胶囊剂，以及由明胶和塑化剂(例如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊剂。所述烷、二氧化碳或其他合适的气体)，可以方便地从加压包或雾化器中以气溶胶喷雾呈现确定以递送计量数量。用于吸入器或吹入器的(例如明物肺部，并穿过肺部上皮层进入血流。其他关于吸入分子的报告包括Adjei&Garren,Pulmonarydeliveryofpeptidedrugs:Effectofparticlesizeonbioavailabilityofleuprolideacetateinhealthymalevolunteers,JPharmaceuticalResearch7:565_569(1990)；Adjeietal.,Bioavailabilityofleuprolidefollowingintratrachealadministrationtobeagledogs,Internationalendothelin_1onbloodpressureandbronchopulmonarysystemoftheguiPulmonarydepositionandclearanceofaerosolizedalpha_1_proteinaseinhibitoradministeredtodogsandtosheep,JClinicalInve1146(1989)(a_1_proteinase)；Osweinetal.,AerosolizationofProteins,ProceedingsofSymposiumonRespiratoryDrugDeliveryII,Keystone,Colorado,March,1990(recombinanthepatocytegrowthhormone)；Debsetal.,Lung_specificdeliveryofcytokinesinducessustainedpulmonaryandsystemicimmunomodulationinrats,JImmunology140:3482_3488(1988)(interferon_gammaandtumornecrosisfactoralpha)andU.S.PatentNo.5,284,656(granulocyte于肺部递送药物以达到全身效果的方法和组合物(通[0228]所述缀合物和任选地一种或更多种其他治疗剂可以以其本身(纯形式)或以药学受的盐可以方便地用于制备其药学上可接受的盐。此类盐包括但不限于由以下酸制备的[0230]药物组合物含有有效量的如本文所述的化合物和任选地一种或更多种其他治疗指可以全部或部分组成本文所述化合物或其他治疗剂是较大的颗粒)。所述颗粒可以在被包衣(包括但不限于肠溶包衣)包围的核心中含有治疗hydrogelsbasedonphotopolymerizedpoly(ethyleneglycol)_co_poly(.alpha._0.1％至约5还包括指示范围内的单个数值(例如1％、2％、3％和4％)和子范围(例如2_NH_OCH3。显而易见的对实施本发明所述模式的各种修改旨在落入所附权利要求对某些术语进行限定和描述或讨论时，所述限定和所有描述和讨论都旨在归于这些术语。使用此类术语和表达也无意排除所示和所述特征或其部分的任何等效特征n[0255]条款J.根据条款A所述的缀合物，其中至少一个H是选自L_HBsAg、S_HBsAg、M_b[0292]条款UU.根据条款LL或MM所述的缀合物，[0298]条款AAA.根据条款LL_OO中任一项所述[0299]条款BBB.根据条款LL_OO中任一项所述的缀合物，[0300]条款CCC.根据条款LL_OO中任一项所述的缀[0301]条款DDD.根据条款LL_OO中任一项所述的[0304]条款GGG.根据条款LL_OO中任一项[0306]条款III.根据条款LL_OO[0308]条款KKK.根据条款LL_OO中任一项所[0309]条款LLL.根据条款LL_OO中任一项所[0310]条款MMM.根据条款LL_OO中任一项所述[0311]条款NNN.根据条款LL_OO中任一项[0312]条款OOO.根据条款LL_OO中任一酶抑制剂。[0313]条款PPP.根据条款LL_OO中任一项所述的缀合物，[0314]条款QQQ.根据条款LL_OO中任一项所述的缀合[0315]条款RRR.根据条款LL_OO中任一[0316]条款SSS.根据条款LL_OO任一项所述的缀合[0328]条款FFFF.根据条款AAAA或BBBB所述的缀合物，其中一个或更多个所述_OH基团[0329]条款GGGG.根据条款AAAA或BBBB所述的缀合物，其中所述氨基(_NH2)基团被_OC22是烷基基团。[0330]条款HHHH.根据条款AAAA或BBBB所述的缀合物，其中所述氨基(_NH2)基团被_OC22是C1_C6烷基基团。33是烷基基团。33是C1_C6烷基基团。[0335]条款MMMM.根据条款JJJJ或KKKK所述[0338]条款OOOO.一种药物组合物，包含条款[0339]条款PPPP.一种治疗受试者病毒感染款A_MMMM中任一项所述的缀合物或条款OOOO所述的药[0340]条款QQQQ.根据条款PPPP所述的方法，[0343]条款TTTT.根据条款PPPP所述的方法[0344]条款UUUU.根据条款PPPP所述的方法[0345]条款VVVV.根据条款PPPP所述的方法[0346]条款WWWW.一种治疗受试者癌症的方MMMM中任一项所述的缀合物或条款OOOO所述的药物组[0347]条款XXXX.根据条款WWWW所述的方法[0350]条款AAAAA.根据条款PPPP_ZZZZ中[0351]条款BBBBB.根据条款PPPP_ZZZZ中任[0352]条款CCCCC.根据条款PPPP_ZZZZ中任一项所述款A_MMMM中任一项所述的缀合物或条款OOOO所述的药[0355]条款FFFFF.根据条款DDDDD所述的[0356]条款GGGGG.根据条款DDDDD_FFFF[0357]条款HHHHH.根据条款FFFFF所述物组合物在所述靶向区域内诱导M2型巨噬细胞重新编程为二Boc1H吡唑1甲脒、四氢呋喃(THF)和三乙胺zanDNP鼠李糖(化合物24)的合成方案：[0363]化合物2的合成：根据Chandleretal.,Synthesisofthepotentinfluenzaneuraminidaseinhibitor4_guanidinoNeu5Ac2en.X_Raymolecularstructureof5_acetamido_4_amino_2,6_anhydro_3,4,5_trideoxy_Derythro_L_gluco_nononicacid,JChemSociety,PerkinTransactions1:1173_1180(1995)；Shidmoossaveeetal.,ChemicalinsightintotheemergenceofinfluenzavirusstrainsthatareresistanttoRelenza,JAmChemSoc135:13254_13257(2013)；andYing&Gervay_Hague,One_Bead–One_Inhibitor–One_SubstrateScreeningofNeuraminidase生物1。向扎那米韦中间体(1)(5g，11mmol)的THF(40mL)溶液中加入三苯基膦(3.67g，胶柱，0_100％EtOAc/己烷)上通过快速柱色谱法纯化，得到黄色粉末2。分离出产物2，[0365]化合物5的合成：将NaOMe(2.9mL，0.5M，1.414mmol)加入到搅拌的化合物3[0366]向化合物4的无水丙酮(70mL)溶液中加入2,2_二甲氧基丙烷(7.7mL，6.54g，[0369]反应完成后，将所述反应混合物减压浓缩。粗产物在TeledyneCombiFlashRf+Lumen(硅胶柱，0_10％MeOH/DCM)上通过快速柱色谱法纯化，得到粘性固体化合物7的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，真空浓缩。所得粗产物通过硅胶柱色谱法(0_[0379]化合物22的合成：在氩气下向溶解在DCM中的DBCO_NHS(化合物21，0.012g，[0380]OAc基团(化合物23)的水解：将化合物2[0381]zan_PEG6_DNP_鼠李糖行制备型高效液相色谱法(HPLC)纯化粗产物化合物24与zan_Fc_WT和zan24小时(hpi)，对小鼠(仅施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)组除供试品治疗小鼠。Zan_DNP_鼠李糖以1.5μmol/kg的单次鼻内剂量施用。zan_Fc_Synthesisofthepotentinfluenzaneuraminidaseinhibitor4_guanidinoNeu5Ac2enX_raymolecularstructureof5_acetamido_4_amino_2,6_anhydro_3,4,5_trieoxy_D_erythro_L_gluco_nononicacid,JChemicalSociety,PerkinTransactionsinfluenzavirusstrainsthatareresistanttoRelenza,JAmericanChemistrySociety135(36):13254_13257(2013)；Ying,L.&Gervay_Hague,One_bead_one_inhibitor_one_substratescreeningofneuraminidaseactivity,ChemBioChem6加入水(10mL)，并将所述溶液在室温下再搅拌24小时。然后浓缩反应溶液，粗产物在TeledyneCombiFlashRf+Lumen(硅胶柱，0_100％EtOAc/己烷)上通过快速柱色谱法纯吡唑_1_甲脒(2.57g，8.28mmol，1.30当量)溶解在THF(20mL)中的溶液中加入三乙胺6)(4.225g，6.281mmol[0390]向化合物7″的无水丙酮(70mL)溶液中加入2,2_二甲氧基丙烷(7.7mL，6.54g，己烷)上通过快速柱色谱法纯化，得到白色固体状激活的扎那米韦(化合物9″)(1.62g，洗脱WT_Fc，并立即用1ml的1MTris(pH8.0)中和。使用截留分子量为10kDa的Amicon[0399]Zan_PEG6_Fc_WT的最终半胱氨酸缀合：向pH7.2的纯[0401]分别通过SDS_PAGE和MALDI分析确认了zan_PEG6_Fc_WT缀合物的纯度和分子量。[0402]第二基于半胱氨酸缀合物zan_Fc_DLE的合成遵循上述方案，并通过SDS_PAGE和组)感染后天数与存活率(％)的关系图。图6组)感染后天数与存活率(％)的关系图。图8100LD50甲型流感H1N1/PR8、去除抗流感抗体、24hpi腹腔内施用人类IgG(IVIg(GAMUNEX8_C))和48hpi施用缀合物的小鼠(n＝5/组)感染后天数与存活率(％)的关系[0413]感染小鼠的治疗从96hpi开始。Zan_DNP_鼠24hpi腹腔内施用人类IgG(IVIgGAMUNEX8_C))和96hpi施用缀合物的小鼠(n＝5/组)感(MiltenyiBiotec,BergischGladbach,Germany)匀浆物。通过实时逆转录聚合酶链式反应(RT_PCR)测量肺部匀浆中的病毒滴度。使用Quick_RNATMMicrorep试剂盒(Zymo计算病毒滴度的标准曲线，将已知病毒滴度的甲型流感病毒/PuertoRico/8/1934(H1N1)合物24＝ZDR并且zan_DNP＝ZD)和市售药物(Xofusa＝XO并且Tamiflu＝TAMI)48hpi的病毒滴度(倍数变化)。图13B显示了所述缀合物(化合物24＝ZD(Xofusa＝XO并且Tamiflu＝TAMI)96hpi的病毒滴度(倍数变化)。图14A显示了所述缀合物(化合物24＝ZDR并且zan_DNP＝ZD)和市售药物(Xofusa＝XO并且Tamiflu＝TAMI)48hpi的病毒滴度(倍数变化)。图14B显示了所述缀合物(化合物24[0418]6_8周龄的雌性Balb/c小鼠(5只小鼠/组)感染了100×LD50的甲型流感/H试品扎那米韦_DNP_鼠李糖(化合物24)在感染后48小时通过静脉(IV)和口服途径以单次剂[0420]将6_8周龄的雌性Balb/c小鼠(2只小鼠/组)经鼻内(IN)接种100×MLD50的甲型流或PBS的单次IN/IV/OG/SC剂量治疗。小鼠在感染后3天安乐死，收获肺部并立即使用gentleMACSOctoDissociator(MiltenyiBiotec,BergischGladbach,Germany)进行匀浆。通过实时RT_PCR测量肺部匀浆物的病毒滴度。使用Quick_RNATMMicrorep试剂盒(Zymo造商的方案，使用OneStepPrimeScriptTMRT_PCR试剂盒(TakaraBio,Inc.,Kusatsu,守区域。为了构建计算病毒滴度的标准曲线，将已知病毒滴度的甲型流感病毒/PuertoRico/8/1934(H1N1)原液的10倍稀释液与肺部匀[0421]小鼠口服施用化合物24并没有像鼻内或IV施用相同剂量或3倍高剂量时那样快速冲盐水)与病毒滴度(每ngRNA的PFU/ml)的条形图[0423]6_8周龄的雌性Balb/c小鼠抗半抗原抗体的来源施用。[0424]图18是IV施用单次剂量1.5μmol/kg的时间(h＝小时)与浓度(ng/mL)的关系图(n=3只小鼠/时间点)。图19是口服施用单次剂量13.5μmol/kg的时间(h＝小时)与浓度(ng/[0425]6_8周龄的雌性Balb/c小鼠(5只小鼠/组)感染了100×LD50的甲型流感/H述供试品化合物24在48hpi施用，单次剂量为1.5μmol/kg的zan_DNP_鼠李糖(IV)[0427]将6_8周龄的雌性Balb/c小鼠(2只小鼠/组)IN接种100×MLD50的甲型流感/H1N1/采集其肺部并立即在RNA裂解缓冲液中快速冷冻。使用gentleMACSOctoDissociator匀浆物的病毒滴度。使用Quick_RNATMMicroprep试剂盒(ZymoResearchCorporation,Irvine,California)从所述匀浆物中提取RNA。根据制造商的方案，使用OneStepPrimeScriptTMRT_PCR试剂盒(TakaraBio,Inc.,Kusatsu,Japan)将等量的RNA用于qrt_度的标准曲线，将已知病毒滴度的甲型流感病毒/PuertoRico/8/1934(H1N1)原液的10倍[0428]口服施用使病毒滴度降低的速度比IV施用慢，但能够在感染后第8天完全消除病化合物24与标准治疗(SOC)的疗效比较([0429]6_8周龄的雌性Balb/c小鼠(5只小鼠/组)感染了10×LD50的甲型流感/H1N1/PR8/[0430]将人类IVIg用作抗半抗原抗体的来源，并在每个队列药物施用前24小时以6g/kg每天两次口服施用5mg/kg的磷酸奥司他韦(Tamifu8)(图22和图23中的Tamiflu(D))或PBS[0431]单次剂量IV(A)和口服施用化合物24(B)均能使病毒感染小鼠100％存活，而所测[0435]6_8周龄的雌性Balb/c小鼠(5只小鼠/组)感染了10×LD50的甲型流感/H1N1/PR8/韦_鼠李糖(单半抗原缀合物；图29A和图29B中的(C))；(d)扎那米韦(图29A和图29B中的体内进行测试时，扎那米韦_双半抗原缀合物(化合物24)在早期和晚期感染中均表现出比[0437]将6_8周龄的雌性Balb/c小鼠(5只小鼠/组)感染10×LD50的甲型流感/H1N1/PR8/[0440]为了在体外测试化合物24作用机制的概念证明，进行了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)测定。ADCC测定使用ADCC试剂盒(Promega，目录号G7010；PromegaCorporation,Madison,WI)进行，所述试剂盒含有流感病毒神经氨酸酶(N1)转染(NA_HEK)的和野生型(WT)人类胚胎肾脏(HEK293)细胞。为此，将细胞一式三份后在存在或不存在100倍过量扎那米韦的情况下用化合物24的系列稀释液处理。在37℃下[0441]然后使用Bio_GloTM萤光素酶测定试剂(包括在试剂盒中)对由ADCC效应细胞产生的萤火虫荧光素酶量进行量化。使用SynergyNeo2HTS多模式微孔板阅读器(BioTek[0442]通过补体依赖性细胞毒性(CDC)测定进行补体系统对病毒感染细胞杀伤作用的分析。收获N1转染(NA_HEK)的和野生型(WT)HEK293细胞，在96孔黑壁板(CorningLife[0443]化合物24通过与所述效应细胞上表达的Fc受体和抗体存在下的补体蛋白相互作合物24的浓度(单位为nM)与ADCC百分比和CDC百分[0444]6_8周龄的雌性Balb/c小鼠(5只小鼠/组)感染了10×LD50的甲型流感/H1N1/PR8/剂量注射。每个测试组的小鼠在96hpi施用以下单次IV剂量：(a)0.17μmkg的化合物24(图28A和图28B中的(C))；(d)4.5μmol/kg的化合物24(图28A和图28B中的[0445]单次IV剂量的1.5μmol/kg化合物24(C)和单次IV剂量的4.5μmol/kg化合物24(D)[0446]在第0天，6_8周龄的雌性Balb/c小鼠(5只小鼠/组)感染了10×LD50的甲型流感/California/07/2009(H1N1)pdm09、甲型流感/Wisconsin/67/2005或乙型流感/Florida/流感/Wisconsin/67/2005的小鼠在96hpi施用单次IV剂量1.5μmol/kg的化合物24图30B中的(B))或PBS(图30A和图30B中的(E))。感染乙型流感/Florida/04/2006的小鼠在96hpi施用单次IV剂量1.5μmol/kg的化合物24(图30A和图30B中的(C))或PBS(图30A和图[0448]6_8周龄的雌性Balb/c小鼠(5只小鼠/组)感染了10×LD50的甲型流感/H1N1/PR8/1934(第0天)。每个测试组的小鼠在48hpi或96hpi施用单次剂量的以下治疗之一：通过测定在肺组织样品中测量每组的细胞因子和趋化因子，并使用制造商(BioLegend,SanDiego,CA)提供的标准方案确定细胞因子和趋化因[0449]图31显示了在48hpi和96hpi治疗组中每组测量的肺部特异性细胞因子和趋化因实施用化合物24可以预防流感病毒感染引发的肺部[0450]还测量了血清细胞因子和趋化因子水平，以评估所述受试者是否存在全身炎图32显示了在48hpi和96hpi治疗组中每组测量的血清中特异性细胞因子和趋化因子表达[0453]化合物3'的合成：化合物1'和2'按272_276(TheresaKueckmannetal.eds.)(2012)中规定的程序制备。此后，将TEA=650.67(参见图37)。[0456]2,3,4_四_O_乙酰基_α_L_鼠李糖(化合物7')的合成：按照DeCoenetal.,Syntheticrhamnoseglycopolymercell_surfacereceptorforendogenousantibody35)和LC_MS监测反应进程，表明在惰性气氛下反应20小时后α_L_鼠李糖一水合物完全消在DCM(7.5mL)中。将反应烧瓶置于冰浴中，在4℃下30分钟内逐滴加入三氟化硼乙醚CombiFlashRf+Lumen(0_10％MeOH/二氯甲烷)上通过硅胶(4g)柱色谱法纯化，分离产物[0459]脱保护_Fmoc基团以合成化合物11'：在室温、氩气下向化合物10'(0.01g，证实)后，在减压下通过旋转蒸发器蒸发溶剂，并通过硅胶(4g)柱色谱法在Teledyne[0464]化合物150的合成：在氩气下向化合物18'(10mg，0.013mmol)和化合物14'物通过制备型HPLC在C18色谱柱(5_95％B，60分钟内，流速7mL/min；B:乙腈；a:20mMNH4OAc[0465]将表达叶酸受体的小鼠肺癌细胞(细胞系M109)以500细胞/孔的密度接种在96细用100倍过量的叶酸盐_葡糖胺(图44中标记为M109_comp)作为竞争物，以确认所观察到的免疫原性效应确实是由于靶细胞上的叶酸受体和双半抗原缀合物上叶酸合物150通过在癌症细胞表面上募集抗半抗原抗体，然后激活所述效应细胞上表达的Fc_γ_RIII受体诱导ADCC。[0468]6_8周龄的雌性Balb/c小鼠在右侧皮下接种M109小鼠肺癌细胞系(表达叶酸受体抗PD1+化疗(肿瘤接种后第18天腹腔内注射卡铂50mg/kg+肿瘤接种后第18_22天静脉注射瘤体积(mm3)与肿瘤植入后天数的关系，以及所述受试者体重百分比与肿瘤植入后天数的瘤体积(mm3)与肿瘤植入后天数的关系，以及所述受试者体重百分比与肿瘤植入后天数的一次5_FU50mg/kg+在肿瘤接种后第8天和第10天施用奥沙利铂6mg/kg)；或(c)10nmol/小天和第21天也腹腔内注射抗DNP和抗鼠李糖抗体，以在整个研究期间实现抗半抗原抗体的瘤体积(mm3)与肿瘤植入后天数的关系，以及所述受试者体重百分比与肿瘤植入后天数的[0475]6_8周龄的雌性Balb/c小鼠(n＝5/队列)皮下植入2_5×106个M109小鼠肺癌细胞[0476]图52显示了肿瘤体积(mm3)与肿瘤植入后天数的关系。化疗治疗队列中的五只动疗法化合物150+抗PD1队列中的五只动物中有三只失去了肿瘤(其余动物中有一只未活到3只未活到植入后第22天)。数据证实化合物150与抗PD_1或化疗的联合显著提高了治疗疗[0477]使用上述相同方案通过以下供试品进行了第二研究：(i)按100μl/小鼠仅施用FA_TLR7队列中五只动物中有一只失去了肿瘤(该队列中的所有动物直到研究结束还都存[0479]6_8周龄的雌性Balb/c小鼠(n＝5/队列)皮下植入CT_26小鼠结直肠癌细胞系(第0施用PBS；(b)甲酰四氢叶酸+5FU+奥沙利铂(OXH17天和第21天也腹腔内注射抗DNP和抗鼠李糖抗体，以在整个研究期间实现抗半抗原抗体[0481]6_8周龄的雌性Balb/c小鼠(n＝5/队列)皮下植入2_5×106个CT_26小鼠结直肠癌[0483]使用上述相同方案通过以下供试品进行了第二研究：(i)按100μl/小鼠仅施用10nmol/小鼠的化合物150(+Abs)；和(v)10nmol/小鼠的化合物150+叶酸盐_TLR7缀合物。[0484]图57显示了肿瘤体积(mm3)与肿瘤植入后天数的关系。联合疗法治疗队列化合物150+舒尼替尼队列中五只动物中有一只失去了肿瘤。联合疗法化合物150+FA_TLR7队列中化合物150在小鼠肺癌模型Y856(冷肿瘤模型[0486]6_8周龄的雌性C57BL/6小鼠(n＝5/队列)皮下植入2×106个Y856小鼠肺癌细胞系杉醇(从肿瘤接种后第18_22天开始每天一次，IV，36mg/kg)；或(c)FDR(化合物150)液并对其进行相应的免疫细胞标记物染色，然后通过流式细胞术分析。图61显示了Y856、[0491]在热肿瘤模型(M109)中，化合物150治疗使得抗肿瘤巨噬细胞和自然杀伤(NK)细