生物制品氯盐测定指南（试行）

生物制品氯盐测定指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗、抗血清、重组蛋白制品、细胞治疗产品、血液制品、多糖类生物制品等各类生物制品的生产用原材料、中间品、原液、成品的氯盐（以游离Cl⁻计）含量测定，也可用于生物制品生产工艺相关缓冲液、工艺用水的氯盐质控检测。本指南涵盖4种测定方法，其中硝酸银电位滴定法适用氯含量范围0.1mmol/L100mmol/L，硫氰酸汞比色法适用范围0.003mmol/L1mmol/L，离子色谱法适用范围0.0001mmol/L10mmol/L，硝酸汞滴定法适用范围0.05mmol/L50mmol/L，仲裁方法为离子色谱法。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

-《中华人民共和国药典》2025年版三部通则

-GB/T601化学试剂标准滴定溶液的制备

-GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

-GB12268危险货物品名表

-《生物制品生产用原材料质量控制技术规范》（2023版）

3术语和定义

3.1氯盐：本指南中特指生物制品基质中以游离态氯离子形式存在的氯化物总和，结果均以Cl⁻计，不包括有机结合态氯。

3.2空白试验：指不加供试品，其余试剂、操作步骤与供试品测定完全一致的平行试验，用于扣除试剂、器皿引入的氯本底。

3.3滴定终点：指滴定反应中电位突跃拐点（电位滴定法）、指示剂特征变色节点（化学滴定法）或标准曲线匹配的定量节点（仪器法），用于确定反应计量比。

3.4基质效应：指样品中非目标检测成分对氯盐测定结果的干扰作用，可通过前处理、方法优化或基质匹配标准曲线消除。

4方法选择原则

4.1生产过程在线质控、基质成分简单（无高浓度蛋白、色素、干扰离子）的缓冲液、工艺用水、纯化中间品，优先选择硝酸银电位滴定法，检测速度快、准确度高。

4.2低氯含量（≤0.5mmol/L）的成品、微量样品（取样量≤1ml），优先选择硫氰酸汞比色法，灵敏度高、所需样品量小。

4.3基质成分复杂、含高浓度蛋白/多糖/干扰离子（Br⁻、I⁻、SCN⁻、S²⁻等）的生物制品，以及成品放行检验、争议样品仲裁，必须选择离子色谱法，可有效分离干扰物，结果可靠。

4.4无电位滴定仪、需快速检测少量低氯样品时，可选择硝酸汞滴定法，但需严格落实危化品管控要求。

5第一法：硝酸银电位滴定法

5.1方法原理

25℃条件下，Ag⁺与Cl⁻发生沉淀反应生成AgCl，溶度积常数Ksp=1.8×10⁻¹⁰，滴定至化学计量点时，溶液中Ag⁺浓度发生突变，带动银指示电极电位产生突跃，根据消耗的硝酸银标准滴定溶液体积，计算供试品中氯盐含量。

5.2试剂与材料

5.2.1试验用水：符合GB/T6682要求的二级水，电导率≤0.1mS/m，氯本底≤0.03mmol/L。

5.2.2硝酸银标准滴定溶液：0.1mol/L储备液按GB/T601要求配制标定：取105℃干燥至恒重的基准氯化钠0.15g（精确至0.00001g），加水50ml溶解，用待标定硝酸银溶液电位滴定至终点，按公式c(AgNO3)=mV×0.05844计算浓度，其中m为基准氯化钠质量（g），V为消耗硝酸银体积（ml），0.05844为与1ml1mol/L硝酸银相当的氯化钠质量（g）；0.01mol/L工作液临用前用储备液二级水稀释，同步标定，浓度相对偏差≤0.5%方可使用。

5.2.3pH调节试剂：1mol/L硝酸溶液、1mol/L氢氧化钠溶液，均用无氯水配制。

5.2.4蛋白沉淀剂：15%三氯乙酸溶液（w/v）、钨酸钠-硫酸沉淀体系（100g/L钨酸钠+0.5mol/L硫酸，体积比1:1混合）。

5.2.5干扰消除试剂：30%过氧化氢溶液（无氯），用于氧化S²⁻、SO₃²⁻等还原性干扰离子。

5.3仪器设备

5.3.1电位滴定仪：配银复合电极（或银指示电极+饱和甘汞参比电极），电位分辨率≤0.1mV。

5.3.2分析天平：感量0.0001g、0.00001g各1台。

5.3.3高速离心机：最高转速≥12000r/min，离心容量≥10ml。

5.3.4磁力搅拌器：带聚四氟乙烯包裹搅拌子，转速可调。

5.4供试品前处理

5.4.1无蛋白基质样品：缓冲液、工艺用水、无蛋白原液直接准确量取1050ml（根据预计氯含量调整，保证Cl⁻总量≥0.01mmol），用硝酸或氢氧化钠溶液调节pH至56，若含还原性干扰离子，加0.5ml过氧化氢，煮沸5min冷却后待测。

5.4.2高蛋白样品（血液制品、疫苗原液、重组蛋白制品、细胞治疗产品）：准确量取供试品15ml，加入等体积15%三氯乙酸溶液，涡旋混合2min，室温静置15min，12000r/min离心15min，全部转移上清液，用1mol/L氢氧化钠调节pH至56，待测；若基质含高浓度血清，可将三氯乙酸浓度提升至20%，加样回收试验验证回收率在90%~110%范围内方可采用该前处理方法。

5.4.3多糖类样品：准确称取0.5~1g样品（精确至0.0001g），加20ml水溶解，加入40ml无水乙醇，涡旋混合1min，4℃静置30min沉淀多糖，8000r/min离心10min，取全部上清液，水浴蒸除乙醇，残渣用10ml水溶解后待测。

5.4.4冻干制剂：精确称取处方量复溶后的样品，按对应基质类型处理。

5.5测定步骤

5.5.1电极校准：使用前用抛光粉将银电极表面的AgCl残留抛光干净，用pH4.0、pH7.0标准缓冲液校准电极斜率，斜率≥95%方可使用。

5.5.2滴定：将待测液置于滴定杯中，放入搅拌子，开启磁力搅拌，转速控制在无气泡产生的最大速率，插入电极，用对应浓度的硝酸银标准滴定溶液滴定，预滴定模式下仪器自动判定终点；手动滴定时，接近终点前每加入0.05ml滴定液记录1次电位，直至电位变化≤2mV/0.05ml，用二级微商法计算终点体积。

5.5.3空白试验：同步做2份平行空白，取平均值参与计算，两份空白体积偏差≤0.01ml。

5.6结果计算

液体样品氯盐含量（mg/L）：

X=(V1-V0)×c×35.45×1000V

其中：V1为供试品消耗硝酸银体积（ml），V0为空白消耗硝酸银体积（ml），c为硝酸银标准滴定溶液浓度（mol/L），35.45为Cl⁻摩尔质量（g/mol），V为供试品取样体积（ml）。

固体样品氯盐含量（%）：

X=(V1-V0)×c×35.45×10-3m×100%

其中m为供试品称样量（g）。

5.7方法学要求

检出限0.03mmol/L，定量限0.1mmol/L，平行样相对标准偏差（RSD）≤3.0%，加样回收率95%~105%，Br⁻、I⁻、SCN⁻含量超过Cl⁻含量1%时会产生正干扰，需换用离子色谱法测定。

5.8注意事项

滴定过程避免强光直射，防止AgCl沉淀分解导致终点偏移；参比电极盐桥需保持充满饱和氯化钾溶液，无气泡堵塞；电极使用后浸泡在饱和硝酸钾溶液中保存。

6第二法：硫氰酸汞比色法

6.1方法原理

Cl⁻与硫氰酸汞发生置换反应，生成解离度极低的氯化汞，释放出的SCN⁻与Fe³⁺结合生成橙红色硫氰酸铁络合物，在460nm波长处的吸光度与Cl⁻浓度呈线性相关，外标法定量。反应式如下：

2Cl-+Hg(SCN)2=HgCl2+2SCN-

SCN-+Fe3+=Fe(SCN)2+

6.2试剂与材料

6.2.1试验用水：无氯二级水，氯本底≤0.01mg/L。

6.2.2硫氰酸汞乙醇溶液：4g/L，称取0.4g硫氰酸汞，加无水乙醇定容至100ml，避光静置24h，取上清液避光保存，有效期30d。

6.2.3硝酸铁溶液：50g/L，称取5g九水合硝酸铁，用1mol/L无氯硝酸溶解定容至100ml，过滤去除不溶物，室温保存有效期6个月。

6.2.4氯离子标准储备液：1000mg/L，准确称取1.6485g105℃干燥至恒重的基准氯化钠，加水溶解定容至1000ml，4℃避光保存有效期12个月；标准工作液10mg/L，临用前稀释。

6.3仪器设备

紫外-可见分光光度计，配1cm石英比色皿；恒温水浴锅（控温精度±1℃）；25ml具塞比色管。

6.4前处理

同5.4要求，处理后供试液需无浑浊、无悬浮颗粒，若含氧化性物质需煮沸去除，避免氧化SCN⁻导致结果偏低。

6.5测定步骤

6.5.1标准曲线绘制：分别取0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml氯离子标准工作液至25ml比色管，加水定容至10ml，加2ml硝酸铁溶液摇匀，加1ml硫氰酸汞溶液摇匀，25℃避光水浴显色15min，于460nm波长处测定吸光度，以Cl⁻质量（μg）为横坐标，扣除空白后的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，相关系数r≥0.999。

6.5.2供试品测定：取适量供试液（Cl⁻含量2~40μg），加水至10ml，同标准曲线操作，测定吸光度，查曲线得Cl⁻质量。

6.6结果计算

液体样品氯盐含量（mg/L）：X=m×1000V，其中m为查曲线得到的Cl⁻质量（μg），V为取样体积（ml）。

6.7方法学要求

检出限0.1mg/L，定量限0.3mg/L，平行样RSD≤5.0%，加样回收率90%~110%。

6.8注意事项

硫氰酸汞属于有毒危化品，操作全程佩戴防护装备，废液单独收集按危废处置；所有玻璃器皿需用10%硝酸浸泡12h以上，无氯水冲洗干净，避免氯污染；显色温度波动需控制在±1℃以内，温度每升高1℃吸光度下降0.2%，会导致结果偏差。

7第三法：离子色谱法（仲裁法）

7.1方法原理

供试品经前处理去除大分子杂质后进入离子色谱系统，通过阴离子交换色谱柱将Cl⁻与其他阴离子（Br⁻、I⁻、NO₃⁻、SO₄²⁻等）分离，经抑制器扣除淋洗液背景电导，电导检测器检测，保留时间定性，峰面积外标法定量。

7.2试剂与材料

7.2.1试验用水：GB/T6682一级水，电阻率≥18.2MΩ·cm，氯本底≤0.001mg/L。

7.2.2淋洗液：氢氧化物体系（20mmol/LKOH溶液，淋洗梯度可根据基质调整）或碳酸盐体系（3.2mmol/LNa₂CO₃+1.0mmol/LNaHCO₃），经0.22μm滤膜过滤，超声脱气15min。

7.2.3前处理小柱：OnGuardIIRP柱（去除有机物）、OnGuardH柱（去除阳离子），使用前按说明书活化。

7.3仪器设备

离子色谱仪，配电导检测器、阴离子抑制器；阴离子交换色谱柱（如DionexIonPacAS194×250mm或等效柱）；0.22μm水系微孔滤膜。

7.4前处理

含蛋白/多糖样品：取1ml供试品，加3ml一级水稀释，依次过活化后的RP柱（弃去前3ml流出液）、H柱（弃去前2ml流出液），收集后续流出液过0.22μm滤膜待测；无蛋白样品直接稀释过膜待测。

7.5测定步骤

7.5.1色谱条件：柱温30℃，淋洗液流速1.0ml/min，抑制器电流40mA，进样体积25μL，Cl⁻保留时间约7.2min（AS19柱，20mmol/LKOH等度洗脱）。

7.5.2标准曲线：配制0.005、0.05、0.5、1.0、5.0、10.0mg/L的Cl⁻标准系列溶液，进样测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，相关系数r≥0.9995。

7.5.3供试品测定：进样25μL，记录色谱图，根据保留时间定性，峰面积计算浓度。

7.6结果计算

氯盐含量（mg/L）=c×D，其中c为查曲线得到的Cl⁻浓度（mg/L），D为稀释倍数。

7.7方法学要求

检出限0.005mg/L，定量限0.015mg/L，平行样RSD≤2.0%，加样回收率98%~102%，可有效分离99%以上的常规干扰离子，适用于所有基质的生物制品氯盐测定。

8第四法：硝酸汞滴定法

8.1方法原理

pH2.5~3.0条件下，Hg²+与Cl⁻反应生成解离度极低的HgCl₂，滴定至终点后，过量的Hg²+与二苯卡巴腙指示剂生成蓝紫色络合物，根据消耗的硝酸汞体积计算氯含量。

8.2试剂与材料

8.2.10.01mol/L硝酸汞标准滴定溶液：按GB/T601配制标定，1molHg(NO₃)₂与2molCl⁻反应，标定后浓度有效期1个月。

8.2.2二苯卡巴腙指示剂：5g/L乙醇溶液，临用前配制，避光保存。

8.2.3pH调节试剂：0.1mol/L硝酸溶液，调节pH至2.8±0.1。

8.3测定步骤

取供试液（Cl⁻总量0.05~1mg），加水至