生物制品锑盐测定指南（试行）

生物制品锑盐测定指南（试行）1范围本指南规定了生物制品中锑盐残留限度检查的方法学验证、样品前处理、测定操作、结果判断及注意事项，适用于重组蛋白、单克隆抗体、疫苗、血液制品等各类生物制品生产过程中使用含锑催化剂、澄清剂后成品的锑盐残留控制，也可用于中间产物的过程监控。本指南采用古蔡氏砷斑法比色法与电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）两种测定模式，古蔡氏法适用于生产工艺常规过程监控及限度快速筛查，ICP-MS法适用于成品法定仲裁及低浓度锑盐残留的准确定量。本指南依据《中华人民共和国药典》（2025年版）四部通则、ICHQ3D元素杂质指导原则制定，锑的限度控制遵循ICHQ3D要求，生物制品中每日给药锑的允许暴露量（PDE）为90μg，按每日最大给药量计算成品中锑的限度一般不超过0.9μg/mg（以每日最大给药量100g计），特定品种可根据给药途径、给药剂量调整限度。2规范性依据本指南编制引用以下标准文件：《中华人民共和国药典》2025年版四部通则0801砷盐检查法、通则0406电感耦合等离子体质谱法、通则2321铅、镉、砷、汞、铜测定法ICHQ3D(R1)元素杂质指导原则世界卫生组织生物制品质量控制指南（2023版）3术语与定义3.1锑盐：本指南指生物制品生产过程中引入的三价锑、五价锑无机化合物，常见为五氧化二锑、酒石酸锑钾等催化剂残留物。3.2限度检查：在规定的试验条件下，判定样品中锑盐含量是否符合预定限值要求的检查方法。3.3基体匹配：采用与待测样品基体组成相似的空白基质配制标准曲线，消除生物基质中有机组分对测定信号干扰的前处理方法。4方法一：古蔡氏锑斑比色限度检查法4.1原理锑盐在酸性条件下被氯化亚锡与锌粒还原生成锑化氢气体，锑化氢与溴化汞试纸反应生成黄色至棕褐色的锑斑，在相同试验条件下，将样品锑斑与标准锑限量溶液的锑斑进行目视比色，判断样品中锑盐含量是否符合限度要求。本方法的检出限为0.5μgSb/反应体系，适用于锑限度≥2μg/g的快速筛查。4.2仪器与试药4.2.1仪器：古蔡氏测砷装置（符合中国药典通则要求），由100mL锥形瓶、玻璃测砷管、测砷管帽组成；分析天平（感量0.1mg）；恒温水浴箱；马弗炉；瓷坩埚（50mL）。4.2.2试药：盐酸（优级纯）；硫酸（优级纯）；碘化钾（分析纯）；40%氯化亚锡溶液（称取40g氯化亚锡，加盐酸溶解并稀释至100mL，临用新配）；无砷锌粒（粒径1mm~2mm）；溴化汞试纸（将新华定量滤纸浸入5%溴化汞乙醇溶液，1小时后取出晾干，避光保存，有效期1个月）；标准锑贮备液（准确称取100℃干燥2小时的酒石酸锑钾基准物质0.2668g，加10mL盐酸溶解后，转移至1000mL容量瓶，加水定容至刻度，摇匀，该溶液浓度为100μgSb/mL，4℃密封保存，有效期6个月）；标准锑工作液（临用前取标准锑贮备液，用1%盐酸逐步稀释至浓度为1μgSb/mL，现配现用）；50%硝酸镁溶液（称取50g硝酸镁，加水溶解稀释至100mL）；氧化镁（分析纯）。

4.3样品前处理

针对不同类型生物制品选择对应前处理方法：4.3.1水性液体制剂（注射液、冻干粉针针剂复溶后）：直接量取相当于含待测物料1g~2g的溶液，置于50mL瓷坩埚中，加5mL50%硝酸镁溶液、0.5g氧化镁，混匀，水浴蒸干后，用小火炭化至无烟，转移至马弗炉，550℃灰化4小时~6小时，直至灰分呈白色或灰白色，取出放冷。若灰化不完全，加1mL硝酸润湿样品，再次蒸干后转入马弗炉灰化2小时。灰化完成后，加10mL盐酸（1+1）溶解灰分，转移至古蔡氏锥形瓶中，备用。

4.3.2固体蛋白、冻干制品：称取均匀样品1g~2g（精确至0.001g），置于瓷坩埚，后续处理同4.3.1。4.3.3含大量脂质、佐剂的疫苗制品：称取样品后，先加5mL浓硝酸，放置过夜预消解，次日再加硝酸镁与氧化镁，后续灰化步骤同4.3.1。4.4测定操作4.4.1供试品溶液制备：向灰化溶解后的样品溶液中，加水至约40mL，加5mL盐酸、2g碘化钾、5滴40%氯化亚锡溶液，摇匀，放置10分钟，加5g无砷锌粒，立即将装有溴化汞试纸的玻璃测砷管安装好，置于25℃~30℃室温（避免阳光直射）反应45分钟。

4.4.2标准斑点制备：取标准锑工作液，按样品限度要求加入对应体积（如样品限度为1μg/g，称样1g则加入1mL标准工作液，含锑1μg），加水稀释至40mL，其余操作同供试品溶液制备，同时做空白对照试验（不加锑标准溶液，其余操作完全一致）。4.4.3结果比色：取出溴化汞试纸，置于白色背景上，目视比较供试品锑斑与标准锑斑的颜色深度。4.5结果判断若供试品锑斑颜色浅于或等于标准锑斑颜色，判定为供试品锑盐检查符合规定；若供试品锑斑颜色深于标准锑斑，判定为不符合规定；空白对照试验的溴化汞试纸应不得显有色锑斑，否则试验无效，需重新检查。4.6方法学验证要求本方法作为限度检查法，需完成以下验证项目：4.6.1专属性：取空白基质按相同前处理方法制备样品，所得溴化汞试纸不得显色，证明无基质干扰。4.6.2检测限：逐步降低标准锑溶液浓度进行试验，能产生肉眼可区分锑斑的最低锑量为0.5μg，符合方法设计要求。4.6.3耐用性：考察锌粒粒径（0.8mm1.2mm、1.0mm2.0mm）、反应温度（20℃、25℃、30℃）对结果的影响，三个条件下均能正确区分限度上下样品，判定结果一致，证明耐用性符合要求。5方法二：电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）准确定量测定5.1原理样品经微波消解完全破坏有机基质，锑元素转化为可溶性离子溶液，雾化后由载气引入ICP-MS等离子体中电离，通过检测质荷比为121Sb的离子信号强度，采用外标法或标准加入法定量，计算样品中锑的含量。本方法检出限为0.01ng/mL，定量限为0.03ng/mL，适用于0.01μg/g~100μg/g范围内锑盐的准确定量，灵敏度远高于古蔡氏法，可满足低残留锑盐的测定要求。5.2仪器与试药5.2.1仪器：电感耦合等离子体质谱仪（配备耐高盐进样系统，铟、铋内标加入装置）；微波消解仪（带聚四氟乙烯消解罐，耐压≥1600psi）；分析天平（感量0.01mg）；超纯水仪（电阻率≥18.2MΩ·cm）；移液枪（A级，10μL~1000μL）。5.2.2试药：硝酸（优级纯，经亚沸蒸馏纯化）；过氧化氢（优级纯）；内标贮备液（1000μg/mL铟溶液，国家标准物质中心提供）；锑标准贮备液（1000μg/mLSb，国家一级标准物质，不确定度≤0.2%）；氩气（纯度≥99.99%）；空白基质（与待测样品处方一致的无锑辅料混合溶液，用于基质匹配标准曲线配制）。

5.3标准溶液配制

5.3.1标准中间液：准确吸取1mL锑标准贮备液至100mL容量瓶，用2%硝酸定容至刻度，摇匀，得到浓度为10μg/mLSb的标准中间液，4℃保存，有效期3个月。

5.3.2标准工作液：准确吸取标准中间液，用2%硝酸逐步稀释，得到浓度为0ng/mL、0.05ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的标准系列溶液；若采用基质匹配标准曲线法，使用空白基质溶液稀释标准液，保持与供试品相同的基体浓度。

5.3.3内标工作液：吸取铟内标贮备液，用2%硝酸稀释至浓度为50ng/mL，在线加入内标，内标加入流速与样品流速比为1:1。

5.4样品前处理

生物制品基体复杂，有机组分含量高，推荐采用微波消解法，也可采用干法灰化，具体操作如下：5.4.1微波消解法（首选方法）：称取均匀样品0.2g0.5g（精确至0.0001g）置于微波消解罐中，若为液体制剂则取相当于固体量0.2g0.5g的样品，加入5mL浓硝酸，加盖放置预消解30分钟，加入2mL过氧化氢，拧紧消解罐盖子，放入微波消解仪，按表1程序升温消解：表1微波消解程序阶段升温时间（分钟）目标温度（℃）保持时间（分钟）11012052101501031018015消解完成后，待消解罐温度降至室温，打开罐盖，将消解液转移至50mL塑料容量瓶中，用少量超纯水洗涤消解罐3次，合并洗涤液，加入内标溶液（若采用内标法离线加入，则加入对应体积内标，使最终浓度为50ng/mL），用超纯水定容至刻度，摇匀，即为供试品溶液。同法制备试剂空白溶液。5.4.2干法灰化法：对于大剂量样品（如口服类生物制品，称样量可达2g），参照本指南4.3进行灰化，灰化完成后用5mL浓硝酸溶解灰分，转移至容量瓶定容，同法制备试剂空白。5.5ICP-MS仪器条件5.5.1推荐参数：射频功率1550W；采样深度8mm；载气流速1.05L/min；辅助气流速0.8L/min；冷却气流速15L/min；雾化器温度2℃；碰撞池模式（He碰撞，流速4.5mL/min），用于消除多原子离子干扰（如40Ar81Br+对121Sb的干扰）；监测质荷比：121Sb、115In（内标）。5.5.2仪器调谐：测定前用1ng/mL的调谐液（含Li、Co、In、U、Ba）调谐仪器，要求氧化物产率（CeO+/Ce+）<2%，双电荷产率（Ce2+/Ce+）<3%，灵敏度满足U元素计数>100000cps，仪器性能符合要求后方可测定。

5.6测定操作

5.6.1依次测定试剂空白、标准系列溶液，以标准溶液浓度为横坐标，以121Sb信号强度与内标115In信号强度的比值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，要求相关系数r≥0.999，否则重新绘制曲线。5.6.2测定供试品溶液，得到供试品中锑的信号强度比，代入回归方程计算供试品溶液中锑的浓度，再按公式计算样品中锑的含量：

式中：w——样品中锑的含量，单位为μg/g；C——供试品溶液中锑的浓度，单位为ng/mL；C0——试剂空白溶液中锑的浓度，单位为ng/mL；V——供试品溶液定容体积，单位为mL；m——称取样品的质量，单位为g。5.7干扰及消除ICP-MS测定锑的主要干扰为多原子离子干扰和基体效应，可通过以下方法消除：5.7.1多原子干扰：采用氦气碰撞池模式可有效消除40Ar81Br、35Cl86Kr等多原子离子对121Sb的干扰，若样品中溴盐含量较高，可选择监测123Sb同位素，以123Sb的信号定量，校正公式为：123Sb的天然丰度为57.36%，121Sb为42.64%，测定123Sb后转换为总锑浓度。

5.7.2基体效应：对于含盐量较高的生物制品（如氯化钠注射液、含铝佐剂疫苗），采用内标法校正漂移，推荐选择115In作为内标，内标回收率应控制在80%~120%范围内，否则需检查基体干扰；若基体效应仍较明显，采用标准加入法定量，可进一步消除基体干扰，提高测定准确度。

5.8方法学验证要求

ICP-MS法定量测定需完成以下验证项目：5.8.1线性：标准曲线在0.05ng/mL~100ng/mL范围内线性相关系数r≥0.999，符合要求。5.8.2检出限与定量限：连续测定11份试剂空白溶液，计算121Sb信号强度的标准偏差SD，检出限LOD=3×SD/b，定量限LOQ=10×SD/b（b为标准曲线斜率），本方法LOD应≤0.01ng/mL，LOQ应≤0.03ng/mL，满足低残留测定要求。5.8.3精密度：取限度浓度100%的供试品溶液，连续进样测定6次，计算含量的相对标准偏差RSD≤5%；取同一批样品，分别制备6份供试溶液测定，RSD≤10%，符合精密度要求。

5.8.4准确度：采用加样回收试验，分别在空白基质中加入低（80%限度浓度）、中（100%限度浓度）、高（120%限度浓度）三个浓度水平的锑标准溶液，每个浓度水平制备3份样品，测定回收率，平均回收率应在85%~115%范围内，RSD≤10%，符合准确度要求。

5.8.5专属性：空白基质溶液中锑的测定值应低于定量限，不干扰样品测定，证明专属性良好。6结果判定与限度要求6.1限度依据：根据ICHQ3D元素杂质指导原则，锑的每日允许暴露量（PDE）为90μg，生物制品中锑的限度按以下公式计算：

式中：L——样品中锑的限度，单位为μg/g；PDE——每日允许暴露量，90μg；D——每日最大给药剂量，单位为g/日。常规注射用生物制品每日最大给药剂量一般不超过100g，因此常规限度为0.9μg/g；口服生物制品每日最大给药剂量不超过10g，限度为9μg/g，特殊品种可根据临床给药方案调整限度，并在质量标准中明确规定。6.2结果判定：采用古蔡氏法测定时，供试品锑斑颜色不深于标准锑斑为符合规定；采用ICP-MS法测定时，样品中锑含量不超过规定限度为符合规定。若古蔡氏法筛查结果为阳性，需采用ICP-MS法进行复检，以ICP-MS法测定结果为仲裁结果。7注意事项7.1试剂与器皿污染控制：锑为环境常见元素，试验过程中所有玻璃器皿、塑料器皿均需用20%硝酸浸泡24小时以上，取出用超纯水冲洗3次以上，晾干备用，实验用水需为超纯水，试剂优先选择优级纯，每次试验必须做试剂空白，扣除空白污染，若空白锑含量超过定量限，需更换试剂重新试验。

7.2前处理注意事项：干法灰化过程中，必须加入硝酸镁作为助灰剂，防止锑的挥发损失，五价锑在高温下的挥发损失小于10%，三价锑挥发损失可达30%以上，因此加入氧化镁可以固定锑，将三价锑氧化为五价锑，减少挥发损失，灰化温度不得超过600℃，温度过高会导致锑损失；微波消解法消解过程中，必须保证消解完全，消解液应澄清透明，若消解液仍有浑浊，需增加消解时间或补加硝酸重新消解，未消解完全的有机物会堵塞雾化器，且会导致基体干扰增大，影响测定结果准确度。

7.3古蔡氏法注意事项：锌粒粒径对反应速率影响较大，粒径过小会导致反应过快，温度升高，锑化氢不能完全被溴化汞吸收，粒径过大会导致反应过慢，锑斑颜色偏浅，因此必须控制锌粒粒径为1mm2mm；反应温度需控制在25℃30℃，温度低于20℃时反应不完全，会导致结果假阴性；溴化汞试纸需保存在棕色瓶中避光保存