常用蛋白还原剂和变性剂

常用蛋白还原剂

1.DTT

中文名称为二硫苏糖醇（Dithiothreitol,简称为DTT）,是苏糖醇的

C-1与C-4位羟基置换成航基的化合物。在生化反应中用做还原剂，爱护

蛋白质或酶中的琉基不致氧化而失活。也常用于还原蛋白质分子中的二硫

键等。

DTT是一种小分子有机还原剂，化学式为C4H10O2S2o其还原状

态下为线性分子，被氧化后变为包含二硫键的六元环状结构。二硫苏糖醇

的名字衍生自苏糖（一种四碳单糖）。DTT的异构体为二硫赤糖醇（DTE）,

即DTT的C3-差向异构体。

DTT也经常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻挡蛋白质中的半

胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。但DTT往往无法还

原包埋于蛋白质结构内部（溶剂不行与）的二硫键，这类二硫键的还原经

常须要先将蛋臼质变性（高温加热或加入变性剂，如6M盐酸服、8M尿

素或1%SDS）。反之，依据DTT存在状况下，二硫键还原速度的不同，

可以推断其包埋程度的深浅。

2.加硫基乙醇

英文名称：P-Mercaptoethanol,化学式：HOCH2CH2SH,分子

量：78.13,是一种具有特别臭味的无色透亮液体，易燃、易溶于水和醇、

醒等多种有机溶剂。

筑基乙障（又称为2-筑基乙障、1-硫代乙二醇、2-羟基乙硫醉、p-

硫醇代乙醇)是一种有机化合物，其化学式为HOCH2CH2SH,英文通

用缩写为ME或0-ME。它兼具乙二醇(HOCH2cH2OH)和乙二硫醇

(HSCH2CH2SH)的官能团，为挥发性液体，具有较剧烈的刺激性气味。

B-ME通常用于二硫键的还原，可以作为生物学试验中的抗氧化剂。它被

广泛运用的缘由是它的羟基使它能够溶解于水中，并且降低它的挥发性。

由于具有较低的蒸汽压，它的难闻的状况比起恶臭的硫醉要好得多。

2-琉基乙醇可以打开蛋白质中存在的二硫键：

cysS-Scys+2HOCH2CH2SH-2cysSH+

HOCH2CH2S-SCH2CH2OH,二硫键被打开后可以使蛋白质的四级或

三级结构被破坏。山于2-琉基乙醇能够打开蛋白质的结构，它经常被用于

蛋白质分析。而2-疏基乙醇也经常被用于爱护蛋白质中自由的半胱氨酸疏

基之间不会错误形成二硫键。作为还原剂，2-统基乙醇经常可以与二硫苏

糖醇(DTT)或三(2-甲酰乙基)瞬盐酸盐(TCEP)互换运用。

2-硫基乙醇是少数几种被发觉可以延长小鼠寿命的化合物。在微克量

级水平上，2-琉基乙醉被视察到对试验鼠的生命具有多种可能的正面效

应。

3.TCEP

化学名称：三(2-竣乙基)瞬；英文名称：

Tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP);分子量：250.19。无色透

亮液体，不溶于脂肪烧，微溶于水，溶于醉、酮、酯、酷、苯、甲苯、二

甲苯等，能与氯仿与四氯化碳混溶，与醋酸纤维索、硝酸纤维索、醋酸丁

酸纤维素、乙基纤维素、聚氯乙烯、酚醛树脂、聚丙烯酸酯等高聚物相容

性好。

TCEP是一种特别有效的硫醇类还原剂，广泛用作蛋白质化学与蛋白

质组学探讨中二硫键的定量还原剂。该试剂在水溶液中的稳定性和溶解性

都很好。在酸性、碱性溶液中的稳定性也不错。与其他类别的硫醇类还原

剂如DTT相比，TCEP不仅是一种高效的二硫键还原剂，而且在某些疏

基的交联反应中不须要除掉。因而在蛋白质化学与蛋白质组学探讨经常优

先选择TCEPo

TCEP在很宽的PH值范围内都可以选择性定量地还原哪怕水溶性很

差的烷基类二硫化合物。通常室温下反应不到5分钟就可以完成。TCEP

没有难闻的气味，而且在空气中不怕氧化。

补充：DTT,beta-筑基乙醇，TCEP等是疏基类还原剂。还原剂可

以爱护蛋白质上自由的金基不被氧化，从而避开蛋白质的聚集或变性。在

结晶试验中，一般运用的还原剂工作浓度是1yomM。

beta-疏基乙醇是上述三种还原剂中还原实力最差的一个，因为它本

身只有一个琉基。它的效果一般只能维持2—3天°因此，在试验中要每

隔2-3天补加一次beta-琉基乙醇来维持它的作用。山于beta-琉基乙醇

是挥发性的，因此，可以在池液中加入beta-疏基乙醇，利用它的挥发扩

散到液滴中去。

二硫苏糖醇DTT有两个琉基基团，其作用能维持3—7天。DTT的

挥发性不像beta-琉基乙酹那么强，所以运用时应当干脆加入到悬滴中去。

DTT还可以通过微透析的方法加入。

TCEP的还原实力比beta-琉基乙醇和DTT都强，它的作用可以维持

2—3周。TCEP能使结晶用的缓冲液酸化。与DTT类似，TCEP须要干

脆加入到悬滴中，因此可以考虑微透析法。

beta-琉基乙醇，DTT,和TECP的作用机制可能不同。像其他添加

剂一样，假如你发觉一类物质对样品的稳定性和结晶有利，则可以去筛选

这一类物质中最适合你的样品的一种。我们建议是，最好这三种还原剂都

尝试一下，去发觉最适合的。

还原剂可以与金属离子结合，金属离子其被还原，而还原剂的作用被

抑制。这就使得用重金属原子作同品置换法遇到了麻烦。可以运用EDTA

来避开还原剂被金属离子抑制。但是，假如金属离子是你的样品蛋白维持

活性所必需的，就要当心运用EDTA了。

碱性条件下，beta-硫基乙醇和TECP更稳定，效果要好于DTT。酸

性条件下，TCEP的稳定性也要好过DTT。

DTT可以使Ni被还原，因此在用Ni柱纯化His标签的蛋白时要避

开运用DTT,而应当考虑beta-硫基乙醇和TECPo

半胱气酸也是一种还原剂。在结晶试验中，半胱氨酸局限性很明显，

那是由于它简单形成六角形的晶体。但是，半胱氨酸是一种有效的添加剂,

能带来明显的效果，不过须要牢记它的局限性。

假如预期到蛋白会被氧化，从制备样品起先就要加入还原剂，并且在

整个流程中要不断补加保证其效果。在悬滴法中，可以在池液里加入还原

剂，利用还原剂的挥发扩散，保证悬滴中还原性的环境。

在确定还原剂和样品比例时，须要考虑样品上自由筑基的数目和样品

浓度。自由筑基数目越多，样品浓度越高，还原剂的用量就越大。

含碑化合物与还原剂不能共用。二甲肿和二甲肿酸钠是结晶中常运

用的含碑化合物，它们不能与还原剂共同运用。其他不能与还原剂一起运

用的物质还包括：硝酸镀，过氧化氢，高氯酸钾，硝酸钠。在运用某种物

质之前，应当先查阅MaterialSafetyDataSheet(MSDS)。

4.SDS

SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以与其它物质分

子之间的非共价键。在强还原剂如疏基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白

质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS

充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大

超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消退了不同蛋白质分子之间原有的

电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形态像一个长椭圆棒。

SDS不仅可以分别鉴定蛋白质，而且可以依据迁移率大小测定蛋

白质亚基的分子量。

DTT和筑基乙彝相比，作用相像，但DTT的刺激性气味要小许多，

毒性也比琉基乙酹低许多。而且DTT比琉基乙醇的浓度低7倍时，两者

效果相近。但DTT价格略高一些。DTT有两个航基集团，筑基乙醇只有

一个筑基集团。

常用蛋白变性剂

盐酸服和尿素

尿素和盐酸胭在高浓度(4~8mol/L)水溶液时能断裂氢键，从而使蛋

白质发生不同程度的变性。同事，还可以通过增大疏水基酸性残基在水相

中的溶解度，降低疏水相互作用。在室温下4~6mol/L尿素和3~4mol/L

盐酸服，可使球状蛋白质从自然状态转变至变性状态的中点，通常增加变

性剂浓度可提高变性程度，通常8mol/L尿素的变性实力强。一些球状蛋

白质，甚至在8mol/L尿索溶液中也不能完全变性，然而在8moi/L盐

酸胭溶液中，他们一般以无规则卷曲（完全变性）构象状态存在。

尿素和盐酸胭引起的变性包括两种机制：1、变性蛋白质能与尿素和

盐酸胭优先结合，形成变性蛋白质-变性剂复合物，当复合物被除去，从而

引起N-D反应平衡向右移动。随着变性剂浓度的着呢国家，自然状态的

蛋白质不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性。然而，由于变性剂

与变性蛋白的结合是特别弱的。因此，只有高浓度的变性剂才能引起蛋白

质完全变性；2、尿素与盐酸胭对谁说氨基酸残基的增溶作用。因为尿素

和盐酸J弧都具有形成氢键的实力，当