比色分析和分光光度法课件

生物工業分析比色分析和分光光度法第一節概述比色分析和分光光度法具有以下優點：①靈敏度高；②準確度較高；③操作簡便、分析速度快；④應用廣泛。比色分析和分光光度法第二節比色分析與分光光度法一、基本原理1．朗伯—比爾定律比色分析與分光光度分析定量物質的基礎是朗伯-比爾定律（Lambert-Beer）：當一束平行單色光通過均勻、非散射的稀溶液時，溶液對光的吸收程度（即為吸光度A）與溶液的濃度和液層的厚度的乘積成正比。

A=KCL式中：A——吸光度；K——吸光係數；L——液層厚度；C——被測物質的濃度。氣相色譜分析通常用光吸收曲線來描述待測溶液對各種波長光的吸收情況，將光源中不同波長的光依次通過固定濃度的待測溶液，分別測出溶液在不同波長下的吸光度，以波長λ為橫坐標，以吸光度A為縱坐標繪製的曲線稱為光吸收曲線或吸收光譜曲線。在光吸收光譜曲線上，光吸收程度最大處對應的波長為該物質的最大吸收波長，用λmax表示，最大吸收波長對應的顏色就是物質吸收光的顏色。在一定條件下物質的吸收強度與其濃度成正比關係，這是物質進行定量分析的依據。在各種物質的分子吸收光譜中吸收峰的波長位置、吸收峰的相對強度以及吸收峰的形狀（峰寬）是對物質進行定性與結構分析的依據。

氣相色譜分析2．儀器及使用方法

（1）581-G型光電比色計581-G型光電比色計光學系統如圖5-1所示。

圖5-1581-G型光電比色計光學系統1—光源2—反射鏡3—吸熱玻璃4—聚光鏡5—濾光片6—比色皿7—硒光電池8—檢流計

氣相色譜分析其中光源燈泡是6.3V的鎢絲燈泡；濾光片的作用是從白光中把最能為被測溶液吸收的某波段的單色光分出來，除去不被溶液吸收且干擾測定的其他波段的光，比色分析選用的濾光片的顏色應該是溶液的互補色，每塊濾光片上都標有該濾光片允許通過的光波的波長數值，單位為nm。581-G型光電比色計配有3塊濾光片，即紅（650nm）、綠（530nm）、藍（420nm）色濾光片。括弧內波長表示該濾光片最強透過光的波長。選擇濾光片的原則是，濾光片透過的光應是溶液吸收最強的光，這可根據顏色的互補關係來選擇，見表5-1。

氣相色譜分析溶液顏色濾光片的顏色濾光片能通過的波長（nm）黃色青紫400～435黃藍435～480桔紅綠藍480～490紅藍綠490～500紫綠500～560青紫黃綠560～580藍黃580～595綠藍桔紅590～610藍綠紅610～750表5-1溶液顏色與濾光片互補關係

氣相色譜分析（2）721型分光光度計它的工作波長範圍為420～720nm,主要是專供一般化驗室在可見光區作常規定量比色分析。721型分光光度計原理示意圖如圖5-2所示。

圖5-2721型分光光度計原理示意圖1—光源2—聚光透鏡3—反射鏡4—彎曲狹縫5—保護玻璃6—准直鏡7—棱鏡8—光亮調節器9—聚光鏡10—吸收池11—光門12—保護玻璃13—光電管14—直流放大器15—微安表

氣相色譜分析721型分光光度計的使用方法如下:

①在儀器接通電源以前,先將各種控制旋鈕開關置於關的位置上,並打開比色皿盒上的翻蓋。②預熱20分鐘，同時啟動檢流計的電源開關，調節檢流計的零點粗、細調節器，使透光度為100。待儀器穩定後再使用。③選擇測定波長。④將盛有溶液的比色皿放在比色皿架上，空白溶液放在第一格內，顯色溶液放在其他格內，把暗箱蓋好。氣相色譜分析⑤用空白溶液調透光度為100。然後將比色皿定位拉杆依次輕輕拉出，使待測溶液依次進入光路，讀出吸光度或透光度。必要時可將空白溶液推入光路核對吸光度零位，再讀數一次。⑥使用完畢，應將比色皿盒上的翻蓋打開，切斷檢流器電源，最後切斷儀器電源，將儀器用蓋好。同時用蒸餾水將比色皿洗滌乾淨，存放於比色皿專用盒內。使用時應注意以下事項:①儀器連續使用2小時後，最好休息半小時，再繼續使用；②操作時，應儘量避免試液滴入比色皿暗盒內或儀器的面板上，若有滴出應及時揩幹，以免腐蝕儀器。氣相色譜分析二、定量分析方法（1）標樣計算法此法使用於個別樣品的分析。首先測出標準溶液（濃度為Cs是已知的）的吸光度As，然後在相同的條件下測出樣品溶液的吸光度Ax（由於實驗條件相同，故K、L為定值，符合比爾定律）。依公式CxAs=CsAx可計算出待測樣品的濃度。（2）標準曲線法此法適合於成批試樣的分析。首先配製一系列不同濃度的標準溶液，分別測定其吸光度，以濃度為橫坐標，相應的吸光度為縱坐標繪製標準工作曲線。樣品也經過同樣的處理，在和標準溶液相同的條件下測吸光度。根據樣品的吸光度在標準工作曲線上查出相應的濃度。

氣相色譜分析三、應用實例1．啤酒色度的測定①基本原理啤酒（或麥汁）的色澤越深，則在一定波長下的吸光度越大，因此，可以直接用吸光度表示啤酒的色度。也可以採用EBC比色計來測定.測定的樣品必須是清亮透明的。本實驗採用GB4927－2001規定的方法，即使用EBC比色計，將除氣後的試樣注入EBC比色計中，與標準EBC色盤比較，目視讀數或自動數字顯示出試樣的色度，以EBC色度單位表示。②儀器EBC色度計（或使用同等分析效果的儀器）：具有2EBC～27EBC單位的目視色度盤或自動數據處理與顯示裝置。

氣相色譜分析③試劑和溶液哈同（Hartong）基準溶液：稱取重鉻酸鉀（K2Cr2O7）0.100g和亞硝醯鐵氰化鈉（Na2[Fe（CN）3NO]·2H2O）3.500g，用水溶解並定容至1000mL，貯存於棕色瓶中，於暗處放置24h後使用。④操作（a）啤酒的除氣取啤酒一瓶，啟蓋後用手堵住瓶口搖動，並經濾紙過濾，以充分除去酒中的二氧化碳，靜置至泡沫完全消失後即可待用。除氣後的酒樣，清亮透明。但啤酒樣品暴露在空氣和陽光中的時間應盡可能的短，以減少測定誤差。氣相色譜分析（b）儀器的校正將哈同溶液注入40mm比色皿中，用比色計測定，其標準色度應為15EBC單位；若使用25mm比色皿，其標準讀數為9.4EBC。儀器的校正應每月一次。（c）色度測定將清亮試樣注入25mm比色皿中，然後放到比色盒中，與標準色盤進行比較，當兩者色調一致時直接讀數。或使用自動數字顯示色度計，自動顯示、列印其結果。

氣相色譜分析⑤計算（a）如使用其他規格的比色皿，則需要換算成25mm比色皿的數據，報告其結果。試樣的色度按下式進行計算：

試樣的色度（EBC單位）＝×25式中：S——實測色度（EBC）；H——使用比色皿的厚度（mm）；25——換算成標準比色皿的厚度。（b）測定濃色和黑色啤酒時，需要將酒樣稀釋至合適的倍數，然後將測定結果乘以稀釋倍數，所得結果表示至整數。

SH氣相色譜分析2．啤酒中鐵的測定（比色法）①基本原理在微酸性條件下，鄰菲羅啉與Fe2+離子生成桔紅色配合物，用比色法測定啤酒中鐵含量。反應如下：

鄰菲羅啉桔紅色

氣相色譜分析②試劑與儀器試劑（a）鄰菲羅啉溶液稱取0.30g鄰菲羅啉，加100mL水，加熱至70℃，使其溶解即可。（b）抗壞血酸溶液稱取2.5g抗壞血酸，用水溶解並稀釋至100mL，本試劑需當日配製。（c）標準鐵溶液準確稱取1.755g硫酸亞鐵銨[Fe（NH4）2（SO4）2.6H2O]，用水溶解，加0.6mL濃鹽酸，用水定容至250mL。使用時吸取5mL該溶液，用水稀釋定容至1000mL，每毫升含鐵5μg。

儀器可見光範圍的分光光度計，比色管，1cm比色皿。

氣相色譜分析③測定步驟準確吸取標準鐵溶液（5μg/mL）0.0、1.5、2.5、3.5、5.0、10.0mL，分別放入6個50mL的容量瓶中，用水分別定容至刻度搖勻，其濃度分別為0.0、0.15、0.25、0.35、0.50、1.0μg/mL。

於6只比色管中分別準確吸入上述不同濃度的標準鐵稀釋溶液25mL。準確吸取25mL除氣啤酒放入另一只比色管中。向上述7只比色管中，分別加入抗壞血酸溶液1mL，搖勻，再加入鄰菲羅啉溶液2mL，搖勻，在60℃水浴中保持15min，冷卻。然後在505nm處，用1cm比色杯測吸光度。以標準鐵的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪製標準工作曲線，以試樣管的吸光度在標準工作曲線上查出試樣管中鐵的含量。

氣相色譜分析④討論（a）配製試劑及測定中用的水均系以玻璃儀器重蒸的蒸餾水。（b）鄰菲羅啉比色法測定鐵，靈敏度較高，溶液中含鐵0.1mg/L時其顏色也很明顯，且色澤很穩定，易於比色。（c）加抗壞血酸的作用是將三價的鐵離子還原為二價的鐵離子。（d）二價鐵離子與鄰菲羅啉在pH2～9的範圍內都能顯色，但為了減少其他離子對測定的影響，通常在pH5的微酸性溶液中顯色。由於啤酒的PH值與此接近，故不用加緩衝溶液。

氣相色譜分析3．白酒中雜醇油的測定（比色法）①基本原理雜醇油中的異丁醇、異戊醇在脫水劑濃硫酸的存在下，可與芳香醛縮合成有色物質，因此，可以用比色法進行測定。顯色劑為對二甲氨基苯甲醛，標準雜醇油採用異丁醇和異戊醇（1:4）的混合液。②試劑與儀器試劑（a）0.5%對二甲氨基苯甲醛濃硫酸溶液稱取0.5g對二甲氨基苯甲醛，溶於100mL濃硫酸中，此試劑應新鮮配製。（b）標準雜醇油溶液準確吸取0.26mL重蒸異丁醇和1.04mL重蒸異戊醇，置於100mL容量瓶中，加入50mL無雜醇油乙醇，用蒸餾水定容至刻度，此試劑每毫升含雜醇油10mg,使用時應稀釋為0.1mg/mL。氣相色譜分析（c）無雜醇油乙醇取分析純無水乙醇200mL，加0.25g鹽酸間苯二胺，於沸水浴中回流2h，然後改用分餾柱於沸水浴中蒸餾，收集中間餾分約100mL，經檢查不顯色為合格。（檢查方法：吸取0.1mL製備的無雜醇油乙醇置於10mL比色管中，加入0.9mL蒸餾水和2mL0.5%對二甲氨基苯甲醛濃硫酸溶液，搖勻，於沸水浴中加熱20min，取出迅速冷卻，加2mL蒸餾水稀釋，與試劑空白比較不顯色即可）。（d）樣品的製備吸取1mL（V1）酒樣，加蒸餾水定容至10mL。

儀器可見光範圍的分光光度計，比色管，1cm比色皿。氣相色譜分析③測定步驟在10mL的比色管中按下表加入各溶液：以上各比色管搖勻放冰水浴中，沿稍傾斜的比色管壁緩慢加入0.5%對二甲氨基苯甲醛濃硫酸溶液2mL，使硫酸溶液至管底，搖勻，放入沸水浴中加熱15min後取出迅速冷卻。然後各加入2mL蒸餾水（色深可加5mL），混勻。10min後，在波長520nm處，測吸光度，繪製標準工作曲線，依樣品管測得的吸光度在標準曲線上查得酒樣稀釋液中雜醇油的含量。

編號標準管樣品管0123456標準雜醇油溶液（0.1mg/mL）mL00.10.20.30.40.5吸取酒樣稀釋液0.3mL（V2）mg0O.O10.020.030.040.05蒸餾水（mL）

10.90.80.70.60.50.7氣相色譜分析④計算樣品管中雜醇油的含量（mg）雜醇油（g/100mL）=×100

式中：V1——所取酒樣的體積（mL）；V2——酒樣稀釋液的體積（mL）。⑤說明對二甲氨基苯甲醛濃硫酸溶液與丙醇、異丙醇及正丁醇無顯色反應。因此，用一種醇作為標準來計算白酒中雜醇油的含量是有誤差的。準確定量白酒中雜醇油的含量應用氣相色譜法。

樣品管中雜醇油的含量V2×V1/10×1000

氣相色譜分析4．味精中鋅的測定①基本原理在pH4.0～5.5的弱酸性介質中，鋅與雙硫腙（又名打薩腙、二苯腙、二苯磺腙、二苯硫代偶氮碳醯肼、二苯硫卡巴腙、二苯基縮二氨基硫脲等）形成紅色配合物，然後用比色法在530nm處進行測定。反應如下：

氣相色譜分析②試劑與儀器試劑（a）標準鋅溶液準確稱取1g鋅粒，溶於8mL1﹕1鹽酸溶液中，轉入1000mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。（b）20%鹽酸羥胺溶液稱取20g鹽酸羥胺，溶於100mL蒸餾水中，置於分液漏斗中，用0.004%雙硫腙四氯化碳溶液分次抽提，直至四氯化碳層為綠色為止。（c）醋酸-醋酸鈉緩衝溶液取2mol/L醋酸溶液和2mol/L醋酸鈉溶液等體積混合，置於分液漏斗中，用0.004%雙硫腙四氯化碳溶液分次抽提，直至四氯化碳層為綠色為止。（d）1%硫化鈉溶液稱取1g硫化鈉，溶於100mL蒸餾水中即可。（e）0.004%雙硫腙四氯化碳溶液稱取0.04g雙硫腙，溶於1000mL四氯化碳中即可。（f）味精試樣溶液準確稱取5g味精試樣，加蒸餾水20mL溶解後，轉入250mL分液漏斗中即可。儀器可見光範圍的分光光度計。

氣相色譜分析③測定步驟（a）標準系列的製備準確吸取0、2、4、6、8、10mL標準鋅溶液（1µg/mL），分別置於250mL分液漏斗中，各加入10mL醋酸-醋酸鈉緩衝溶液，2mL20%鹽酸羥胺溶液，2mL1%硫化鈉溶液，用蒸餾水稀釋至約150mL，混勻。加10mL0.004%雙硫腙四氯化碳溶液，劇烈搖振15min，靜止分層，取四氯化碳層比色。（b）味精液的處理同標準系列液的處理。（c）測定在530nm波長處測定標準系列及味精試樣的吸光度，以標準鋅溶液的濃度為橫坐標，相應的吸光度為縱坐標，繪製標準工作曲線。從標準工作曲線上求得味精試樣吸光度對應的鋅含量（微克數），然後計算處理。

氣相色譜分析④計算式中：W1——

標準曲線上查得的鋅的微克數；W2——

所取的味精重量。⑤討論（a）實驗證明，雙硫腙鋅配合物在pH4.7～5.2範圍內能定量地被四氯化碳萃取，而且色澤至少在2h內穩定。（b）測定過程中加入20%鹽酸羥胺溶液是為了防止雙硫腙的氧化。（c）測定過程中加入硫化鈉溶液是為了防止銅、汞、金、鉍、鉛、鎘、錳等金屬離子對測定的干擾。

氣相色譜分析5．檸檬酸中砷的測定（砷斑比色法，又稱Gutzeit比色法）①基本原理三氧化二砷和亞砷酸在酸性溶液中被氫迅速還原為砷化氫：反應中生成的砷化氫，通過用醋酸鉛濕潤過的棉花以吸去可能夾雜的硫化氫，然後與浸過溴化汞（或二氯化汞）溶液的試紙發生反應，使試紙呈現黃色：氣相色譜分析在測定過程中，為加速砷酸（H3AsO4）的還原,可加入碘化鉀將砷還原為亞砷酸，所生成的碘用酸性氯化亞錫還原，同時，氯化亞錫也可以使五價砷還原為三價砷化合物：溴化汞（或二氯化汞）試紙著色強度與樣品中砷的含量成正比。因此，用已知砷量的標準溶液處理得到的試紙進行比色，可以測定樣品中砷的含量。

氣相色譜分析②試劑與儀器試劑（a）砷標準溶液準確稱取0.1g三氧化二砷，加5mL20%氫氧化鈉，然後用1﹕4硫酸溶液中和，再過量10mL1﹕4硫酸溶液，轉入1000mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。使用時，吸取10mL1﹕4硫酸溶液，用蒸餾水稀釋定容至1000mL，稀釋後每毫升含三氧化二砷1μg。（b）20%碘化鉀溶液稱取20g碘化鉀，溶於100mL蒸餾水中即可。（c）溴化汞試紙稱取1g溴化汞，加20mL乙醇溫熱溶解，置入棕色瓶中，避光保存。將乾淨、光潔的濾紙切成小塊，於溴化汞溶液中浸漬1h，取出風乾，置入棕色瓶中避光保存。浸漬與風乾過程最好避光操作。氣相色譜分析（d）酸性氯化亞錫溶液稱取20g錫，加60mL濃鹽酸和20mL蒸餾水，溫熱至氣泡消失，加蒸餾水至100mL，多餘的錫仍留在溶液中。（e）乙酸鉛棉花取脫脂棉，用5%乙酸鉛溶液浸透後除去多餘的溶液，並使疏鬆，在100℃以下溫度乾燥，置於帶塞瓶中，乾燥處保存。（f）無砷鋅粒（g）濃鹽酸儀器

Gutzeit定砷器見圖5-3。

氣相色譜分析圖中，A為100mL三角瓶，B為橡皮塞，C為全長約18cm的上粗下細的玻璃管，粗管部分的內徑約為6.5mm,長約14cm，細管部分的內徑約為1～3mm粗管部分裝入長約5～6cm的乙酸鉛棉花，乙酸鉛棉花距離上端管口至少3cm。細管部分緊密插入橡皮塞B中，深入瓶中大約1cm。D、E均為有機玻璃平板，中間有一與C管較粗部分相匹配的小孔。D、E兩板的兩側均有對應的突出部分用於固定。使用時，將E板蓋在D板上，使兩圓孔相吻合，中間夾一溴化汞試紙，用橡皮圈將兩板固定。

氣相色譜分析③測定步驟（a）標準砷斑的製備吸取2mL標準砷溶液（1μgAs2O3/mL）置於A瓶中，加21mL蒸餾水，5mL濃鹽酸，5mL20%碘化鉀溶液和5滴酸性氯化亞錫溶液，於室溫下放置10min，加1.5g無砷鋅粒，迅速安裝好儀器（注意密封！），保持反應溫度在25～40℃之間（視反應快慢而定，但不應超過40℃），1小時後取出溴化汞試紙，置於乾燥的玻璃管中，即可製成標準砷斑。（b）樣品的測定準確稱取2g檸檬酸樣品，置於A瓶中，加23mL蒸餾水溶解，以下同標準砷斑的製備。如生成的砷斑色澤比淺，則此檸檬酸樣品砷含量合格。

氣相色譜分析④討論（a）Gutzeit定砷法靈敏度高，因此，實驗過程所用的試劑均不應生成砷斑。（b）無砷鋅粒系指細的顆粒，如使用的鋅粒較大，則用量需酌量增加。（c）砷斑在空氣中易褪色，如需保存，可在含5%固體石蠟的石油醚中浸一下，待石油醚揮發後，避光保存於乾燥處。

氣相色譜分析6．白酒中鉛的測定（比色法）①基本原理鉛離子與雙硫腙在pH9.0左右的弱鹼性溶液中生成紅色配合物，該化合物溶於氯仿，其顏色深淺與鉛離子的濃度成正比，因此，可用比色法測定白酒中鉛的含量。反應如下：氣相色譜分析②試劑與儀器試劑（a）標準鉛溶液準確稱取於105℃乾燥2h的分析純硝酸鉛0.1598g,加1%硝酸100mL溶解後,轉入1000mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度.使用時,吸取10mL上述溶液,用蒸餾水稀釋定容至100mL,每毫升稀釋後溶液含鉛10μg。（b）雙硫腙氯仿溶液稱取精緻過的雙硫腙0.1g,加100mL氯仿溶解,作為貯備液.使用時,吸取1mL雙硫腙貯備液,加100mL氯仿稀釋,每毫升稀釋後溶液含雙硫腙10μg。（c）20%檸檬酸銨溶液稱取50g檸檬酸銨,溶於100mL蒸餾水中,加2滴酚紅指示劑,用氨水調成微紅色（pH8.5～9.0）,置入分液漏斗中,用雙硫腙氯仿溶液分次抽提,直至抽提液呈綠色,棄去雙硫腙氯仿層,再用少量氯仿提取殘剩的雙硫腙,直至氯仿層為無色,將檸檬酸銨溶液加水至250mL。氣相色譜分析（d）20%鹽酸羥胺溶液稱取20g鹽酸羥胺,溶於60mL蒸餾水中,加2滴酚紅指示劑,用氨水調成微紅色（pH8.5～9.0）,置入分液漏斗中,用雙硫腙氯仿溶液分次抽提,直至抽提液呈綠色,棄去雙硫腙氯仿層,再用少量氯仿提取殘剩的雙硫腙,直至氯仿層為無色,將鹽酸羥胺溶液用6mol/L鹽酸酸化成酸性（成黃色）加蒸餾水至100mL。（e）酚紅指示劑稱取0.1g酚紅,溶於100mL95%乙醇中,過濾。（f）10%及1%氰化鉀溶液（除鉛的方法同試劑c和d）。（g）1﹕1氨水。（h）6mol/L鹽酸。（i）10%鹽酸。（j）10％的氰化鉀溶液。儀器可見光範圍的分光光度計。

氣相色譜分析③測定步驟（a）標準系列管的製備在50mL比色管中,按下表加入各溶液：每只比色管中各加2滴酚紅指示劑,用濃氨水調成微紅色（pH8.0～9.5）,各加1mL10%氰化鉀溶液,10mL雙硫腙氯仿溶液,劇烈搖振1min,靜置分層。編號012345標準鉛溶液（10μg/mL）毫升0.0O.20.40.60.810微克0.0O.0020.0040.0060.0080.010蒸餾水（毫升）10.09.89.69.49.29.020%檸檬酸銨溶液（mL）22222220%鹽酸羥胺溶液（mL）111111氣相色譜分析（b）試樣管的製備取適量酒樣（含鉛量約5μg左右），置於50mL燒杯中，於沸水浴中蒸幹。加10mL1﹕1鹽酸溶液，於沸水浴中再次蒸幹（若消化液呈黃色，則再用5mL1﹕1鹽酸溶液，於沸水浴中再次蒸幹）。加2mL10%鹽酸溶液溶解殘渣，轉入50mL比色管中，用蒸餾水洗滌燒杯，並用蒸餾水稀釋至約10mL，以下操作同標準系列管的製備。（c）測定目視比色法測定將試樣管氯仿層與標準系列管中氯仿層顏色比較，求得酒樣中鉛的含量：

鉛（mg/L）=×1000式中：V1——是試樣管與標準管色澤相當的標準管中鉛溶液體積（mL）；

V——所取酒樣的體積（mL）。

V1×0.01V氣相色譜分析分光光度法測定將標準系列管與試樣管中水層分棄，用氯仿層比色，在510nm波長下測吸光度，繪製標準曲線，從標準工作曲線上求得試樣管吸光度對應的鉛的微克數（W），按下式計算：

鉛（mg/L）=

式中：V——所取酒樣的體積（mL）。WV氣相色譜分析④討論

（a）雙硫腙法測定鉛其靈敏度高，因此，對測定過程所用試劑及溶劑都需檢查是否含鉛，必要時需純化處理。

（b）雙硫腙能與許多金屬離子呈色，故雙硫腙並非鉛的專一試劑。但在一定的條件下能消除別的金屬離子的干擾。①pH控制在8.5～9.0；②加入氰化鉀配合劑，使許多金屬離子形成穩定的配合物而被掩蔽；③加入檸檬酸銨，防止在鹼性條件下鹼土金屬的沉澱；④加入還原劑鹽酸羥胺，防止三價鐵離子對雙硫腙的氧化。（c）酚紅指示劑變色pH為6.8～8.0，顏色改變從黃色變為紅色，在酸性條件下酚紅也呈紅色。因試樣管為酸性，加酚紅指示劑後呈紅色，需用氨水調製由紅變黃，再由黃變紅為止。

氣相色譜分析7．單核苷酸類的測定（定磷法）

①基本原理單核苷酸中的磷酸基為有機磷，經硫酸消化後轉變為無機磷，與鉬酸銨作用，在酸性條件下被還原劑如維生素C還原為鉬藍，用比色法測定。②試劑與儀器試劑（a）10mol/L硫酸溶液量取27.8mL濃硫酸，緩慢倒入適量水中，用水稀釋至100mL。（b）6mol/L硫酸溶液量取16.7mL濃硫酸，緩慢倒入適量水中，用水稀釋至100mL。（c）維生素C溶液稱取10g維生素C（抗壞血酸），用水溶解並稀釋至100mL。氣相色譜分析（d）2.5%鉬酸銨溶液稱取2.5g鉬酸銨，用水溶解並稀釋至100ml。（e）定磷試劑取6mol/L硫酸溶液、2.5%鉬酸銨溶液、水和維生素C溶液，依次按體積比1:1:2:1混合，本試劑應新鮮配製。（f）標準磷溶液準確稱取磷酸二氫鉀0.4329g，用水溶解並定容至1000mL。使用時，吸取10mL上述溶液，用水稀釋定容至100mL，每毫升含磷10μg。（g）濃硫酸。（h）過氧化氫。儀器可見光範圍的分光光度計。

氣相色譜分析③測定步驟

（a）標準曲線的繪製在6只試管中按下表要求加入各種試劑：以上6只試管於45℃水浴中顯色25min，在660nm波長下測吸光度，繪製標準工作曲線。

編號012345標準磷溶液（10μg/mL）毫升（mL）0.00.20.40.60.81.0微克（μg）0.0246810水（毫升，mL）32.82.62.42.22.0定磷試劑（毫升，mL）333333氣相色譜分析（b）試樣液的製備準確稱取0.1g試樣，溶於水中（難溶時可加1～2滴濃氨水），並用水稀釋定容至100mL。（c）總磷的測定吸取1mL試樣液，置於50mL凱氏瓶中，加2.5mL濃硫酸，加熱至冒白煙，冷卻。加2滴過氧化氫，繼續加熱至無色透明，冷卻，用水稀釋定容至50mL。吸取3mL稀釋消化液（含磷量10μg以下），以下操作同標準曲線的繪製，測其吸光度，從標準曲線中求得磷量（W1，µg）。（d）無機磷的測定吸取1mL試樣液，用水稀釋定容至50mL，吸取3mL稀釋液，以下操作同標準曲線的繪製，測其吸光度，從標準曲線中求得磷量（W2，µg）。

氣相色譜分析④計算按下式計算單核苷酸的含量式中：M1——單核苷酸相對分子品質M2——磷的相對原子品質W——稱取試樣重量（g）⑤討論本法中磷含量在0～10µg內符合比爾定律。

氣相色譜分析8．液化型澱粉酶活力的測定①基本原理液化型澱粉酶能使澱粉水解為分子量大小不一的糊精和少量的麥芽糖和葡萄糖，使澱粉與碘呈藍紫色反應逐漸消失，顏色的消失速度可以衡量酶活力的高低。

②試劑與儀器

（a）稀碘液稱取11g碘，22g碘化鉀，置於研缽中，加少量蒸餾水研磨至碘完全溶解，用蒸餾水稀釋至500mL，貯存於棕色瓶中。吸取上述碘溶液2mL，加碘化鉀20g，用蒸餾水稀釋至500mL，貯存於棕色瓶中。（b）標準比色液甲液：精確稱取40.2439g氯化鈷（CoCl2•6H2O）和0.4878g重鉻酸鉀（K2Cr2O7），用蒸餾水溶解並定容至500mL。乙液：精確稱取40mg鉻黑T，用蒸餾水溶解並定容至100mL。使用時，取41mL甲液和4.5mL乙液混合，於冰箱中保存，使用7天後需重新配製。氣相色譜分析（c）pH6.0磷酸氫二鈉—檸檬酸緩衝溶液稱取45.23g磷酸氫二鈉（Na2HPO4•12H2O），8.07g檸檬酸，用蒸餾水溶解並稀釋至1000mL。（d）2%可溶性澱粉溶液準確稱取可溶性澱粉2g（預先於100～105℃烘乾），加少量水調勻，傾入80mL沸水中，繼續煮沸至透明，冷卻後用水定容至100mL。（e）酶液準確稱取酶粉2g，用pH6.0磷酸氫二鈉—檸檬酸緩衝溶液稀釋定容至一定體積（使其測定時酶解反應控制在2～3min內）,於40℃水浴浸取半小時，紗布過濾，濾液為實驗用酶液。

氣相色譜分析③測定步驟（a）取2mL標準比色液於白瓷板空穴內，作為比較顏色的標準。（b）取20mL2%可溶性澱粉和5mLpH6.0磷酸氫二鈉—檸檬酸緩衝溶液，注入三角瓶中，在60℃恒溫水浴中預熱10min，然後加入預先稀釋好的酶液0.5mL，立即記錄時間，充分搖勻，定時用滴管取出反應液約0.5mL。滴入預先充滿比色稀碘液（約1.5mL）的白瓷板空穴內，當穴內顏色反應由紫色逐漸變為紅棕色，與標準比色液相同時，即為反應終點，並記錄時間T（分鐘,min.）。

氣相色譜分析④計算以1g酶粉或1mL酶液於60℃pH6.0的條件下，1小時液化可溶性澱粉的克數來表示。用下式計算：式中：n——酶液稀釋倍數；20——可溶性澱粉吸取體積（mL）；0.5——測定時用酶液體積（mL）；2%——澱粉液濃度；T——測定記錄時間（min.）；W——酶粉取樣量（g）。

氣相色譜分析⑤討論

（a）酶反應全部時間應控制在2～2.5min之內，商品液化型澱粉酶粉劑活力為1500～2500單位，酶粉稀釋100～200倍為宜。（b）可溶性澱粉的品質對液化型澱粉酶活力有一定的影響，為統一起見，可溶性澱粉使用浙江菱湖澱粉廠生產的化學純試劑配製。

氣相色譜分析9．蛋白酶活力的測定①基本原理蛋白酶水解酪蛋白，其產物酪氨酸能在鹼性條件下使福林—酚試劑還原，生成鉬藍與鎢藍，以比色法測定。②試劑與儀器

試劑（a）福林—酚試劑稱取鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）和鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O），置於1000mL圓底燒瓶中，加350mL蒸餾水，25mL85%磷酸，50mL濃鹽酸，文火微沸10h，取下回流冷凝器，加50mL硫酸鋰（Li2SO4）和25mL蒸餾水，混勻後，加溴水脫色，直至溶液呈金黃色，再微沸15min，驅除殘餘的溴，冷卻，用4號耐酸玻璃篩檢程式抽濾，濾液用蒸餾水稀釋至500mL。氣相色譜分析（b）標準酪氨酸溶液準確稱取DL—酪氨酸0.1g，加入少量0.2mol/L鹽酸溶液（取1.7mL濃鹽酸，用蒸餾水稀釋至100mL），加熱溶解，用蒸餾水定容至1000mL，每毫升含酪氨酸100μg。（c）pH7.2磷酸緩衝溶液取28mL磷酸二氫鈉溶液[配製稱取31.2g磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）用蒸餾水溶解並稀釋至1000mL]和72mL磷酸氫二鈉溶液[配製稱取71.6g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）用蒸餾水溶解並稀釋至1000mL]，混合後用蒸餾水稀釋至1000mL。（d）2%酪蛋白溶液稱取2.00g酪蛋白（又名乾酪素），加約40mL蒸餾水和2～3滴濃氨水，於沸水浴中加熱溶解，冷卻後，用pH7.2磷酸緩衝溶液稀釋定容至100mL，貯存於冰箱中。氣相色譜分析（e）0.4mol/L三氯乙酸溶液稱取三氯乙酸65.5g，用蒸餾水溶解並定容至1000mL。（f）0.4mol/L碳酸鈉溶液稱取無水碳酸鈉42.4g，用蒸餾水溶解並定容至1000mL。（g）酶液準確稱取酶粉2g，用pH7.2磷酸緩衝溶液定容至200mL，置於40℃水浴浸取半小時，用紗布過濾。根據酶活力的高低，再用pH7.2磷酸緩衝溶液稀釋一定倍數（使其測定吸光度在0.2～0.4範圍內為宜）。儀器可見光範圍的分光光度計。氣相色譜分析③測定步驟

（a）標準曲線的繪製取九支試管按下表將標準酪氨酸溶液進行稀釋：從上述各試管中各取1mL，分別加入5mL0.4mol/L碳酸鈉溶液，1mL福林—酚試劑，於40℃水浴中顯色20min，在680nm波長下測定吸光度，繪製標準工作曲線，在標準曲線上求得吸光度為1時相當的酪氨酸微克數（即為K值）。

編號012345678標準酪氨酸溶液（毫升,mL）012345678蒸餾水（毫升,mL）1098765432稀釋酪氨酸溶液濃度（微克/毫升）01020304050607080氣相色譜分析（b）蛋白酶活力測定取4支10mL離心管，分別加入1mL稀釋酶液，其中一支為空白管，三支為平行試驗管。置於40℃水浴中預熱3～5min，在三支平行試驗管中分別加入1mL2%酪蛋白溶液，準確計時保溫10min。立即加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，15min後離心分離或用濾紙過濾。分別吸取1mL清液，加5mL0.4mol/L碳酸鈉溶液，最後加入1mL福林—酚試劑，搖勻，置於40℃水浴中顯色20min。空白管中先加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，再加入1mL2%酪蛋白溶液，15min後離心分離或用濾紙過濾。以下操作與平行試驗管相同。以空白管為對照，在680nm波長下測定吸光度，取其平均值。

氣相色譜分析④計算蛋白酶活力單位定義：1克酶粉，在40℃，pH7.2條件下，每分鐘水解酪蛋白為酪氨酸的微克數。用下式計算：

式中：A——平行試驗管的平均吸光度；4——離心管中反應液的總體積（毫升,mL）；10——反應10分鐘；N——稀釋倍數；W——酶粉稱取量（克,g）。

氣相色譜分析⑤討論（a）對於同一臺分光光度計與同一批福林－酚試劑，其工作曲線K值可以沿用，當另配時，工作曲線應重做。（b）當用不同產品的酪蛋白對同一蛋白酶測定時，其結果會有差異，故蛋白酶活力表示時應注名所用酪蛋白的生產廠。（c）本方法為中性蛋白酶活力的測定方法。酸性蛋白酶活力的測定可將緩衝溶液改為乳酸—乳酸鈉緩衝溶液（取35mL乳酸，2mL乳酸鈉，用蒸餾水稀釋定容至1000mL，pH為2.3），鹼性蛋白酶活力的測定可將緩衝溶液改為硼砂—氫氧化鈉緩衝溶液（稱取12.367g硼酸（H3BO3），加100mL1mol/L氫氧化鈉溶液，用水稀釋至1000mL,即為0.1mol/L硼砂溶液。取49.9mL0.1mol/L氫氧化鈉溶液,用0.1mol/L硼砂溶液稀釋至100mL，pH為11，即為硼砂—氫氧化鈉緩衝溶液）。

氣相色譜分析第三節紫外分光光度法

一、紫外分光光度計

1．紫外分光光度計的光學系統及工作原理751-G型紫外分光光度計的光學系統採用自准式光路，其示意圖如圖5-4所示。751-G型紫外分光光度計在測定波長為320～1000nm內用鎢絲燈做光源，波長為200～320nm內用氫燈做光源。以石英棱鏡為單色器,以真空光電管作為光電轉換元件。

氣相色譜分析圖5-4751-G型紫外分光光度計的光學系統示意圖1—氫弧燈2—凹面反射鏡3—鎢絲燈4—平面鏡5—入射狹縫及石英窗6—球面准直鏡7—石英棱鏡8—出射狹縫9—石英透鏡10—濾光片拉杆11—比色皿12—比色皿架拉杆13—暗電流控制閘門拉杆14—紫敏光電管15—紅敏光電管16—光電管調動架拉杆

氣相色譜分析工作原理:由光源1或3發出的連續輻射光線，射到凹面反光鏡2上聚光，再被反射到平面鏡4上，然後反射至入射狹縫5上，由此入射到單色器內。而狹縫5正好位於球面准直鏡6的焦面上因此，入射光線到達准直鏡上反射後，就以一束平行光射向棱鏡7（該棱鏡背面是鍍鋁的）。光線經棱鏡後，在其中色散，光線入射角處在最小的偏向角，入射光在鋁面上反射後並不是依原路反射回來，而是從棱鏡色散出來的光線經准直鏡反射後，會聚在出射狹縫8射出。為了消除雜散光對於測量結果的影響，在出射狹縫後裝有濾光片，光線通過濾光片後進入樣品室，根據波段需要，可以選用玻璃或石英比色皿。為了減少光線的反射程度，使光線能儘量集中照射到光電管上，在出射狹縫後裝有石英透鏡9，光線經透鏡聚光後，照射到試樣比色皿上，透過光到光電管的陰極上產生相應的光電流，經放大後，測得相應的吸光度。

氣相色譜分析2．紫外分光光度計的構造紫外分光光度計主要有光源、單色器和檢測器構成。

3．紫外分光光度計的操作方法下麵以751-G型紫外分光光度計的操作方法為例加以介紹。（1）接通電源，預熱10分鐘。（2）工作前，先將暗電流控制閘門拉杆置於關閉位置，以進行儀器的校正和保護光電管。（3）將選擇開關旋至“校正”位置。（4）轉動波長旋鈕將波長刻度調至需波長的位置上。（5）選定所需波長的光電管。同時根據相應的波長來選擇光源燈。

氣相色譜分析（6）根據波長選擇比色皿。350nm以上可選用玻璃比色皿，350nm以下一定要選用石英比色皿。將裝好溶液的比色皿放入比色皿架內，然後將蓋板蓋好。（7）調節暗電流旋鈕，使電錶指針到零，為了得到較高的準確度，每測量一次，暗電流應隨時校正一次。（8）調節靈敏度旋鈕，一般從左面停止位置按順時針方向轉動約三圈，此時度數盤轉動1％透光率，電錶指針可偏轉3小格。（9）拉動比色皿架拉杆，將空白溶液移入光路。（10）調節讀數電位器旋鈕，使透光度讀數指示在透光度100％處。（11）將選擇開關撥至“×1”檔。（12）拉開暗電流閘門，使單色光射入光電管。氣相色譜分析（13）調節狹縫旋鈕，大致使電錶的指針指零，然後再用靈敏度旋鈕作精細調節，使電錶的指針準確地指在零位。

（14）移動比色皿架拉杆，使待測溶液移入光路。這時電錶的指針偏離零位。（15）旋轉讀數電位器旋鈕，重新使電錶的指針指在零位，此時從吸光度讀數盤上即能讀取吸光度。依次拉出一格試樣，旋動讀數電位器旋鈕，使電錶重新指零，可從吸光度讀數盤上讀得相應得吸光度。注意：從讀數窗讀取待測溶液得透光度或吸光度值，當選擇開關置於“×1”檔時，透光度範圍時0～100％，相應得吸光度範圍是∞～0。可以直接讀數，不需換算。當試液濃度過大，其透光度小於10％，吸光度大於1時，可把選擇開關置於“×0.1”檔，以獲得較準確得讀數，此時所讀出得透光度值應以10除之，或把讀出得吸光度值加上1.0。

氣相色譜分析（16）更換試樣或暫停測試時，必須將暗電流控制閘門拉杆關閉，以保護光電管。（17）測試幾個試樣時，可重複上述操作。但需經常用空白溶液校準透光率100％。（18）使用完畢後，將儀器復原。對於儀器的維修，應注意的是：①

經常更換儀器中的乾燥劑，發現變色應及時取出烘乾後再用；②

儀器停止工作時，必須切斷電源，將選擇開關放在“關”，狹縫轉到0.01刻度，波長旋在625nm，透光率旋鈕放在100％；③

使用半年以上或搬動後，要進行波長精確性的檢查。

氣相色譜分析二、應用實例

1.啤酒中雙乙醯含量的測定（比色法）基本原理鄰苯二胺與雙乙醯反應如下：

反應中生成的產物2，3-二甲基喹喔啉的鹽酸鹽在335nm處有一最大吸收值，可對連二酮進行定量測定。結果以雙乙醯含量表示。

氣相色譜分析②試劑與儀器

試劑（a）4mol/L鹽酸溶液量取50mL濃鹽酸，用重蒸水稀釋至150mL。（b）1%鄰苯二胺溶液準確稱取分析純鄰苯二胺0.2500g溶解於4mol/L鹽酸溶液，並用4mol/L鹽酸溶液定容至25mL，搖勻。貯存於棕色瓶中，本試劑應當日配製。若配製出來的溶液呈紅色，應重新更換新試劑。（c）消泡劑有機矽消泡劑或甘油聚醚。

儀器（a）紫外分光光度計（b）雙乙醯蒸餾裝置如圖5－5所示。

氣相色譜分析1－夾套蒸餾氣2－2000mL水蒸汽發生器3－冷凝器4－25mL量筒或容量瓶5－進樣口6－電爐7－排氣夾子

圖5－5雙乙醯蒸餾裝置

氣相色譜分析③測定步驟

（a）蒸餾按圖5－5把雙乙醯蒸餾裝置安裝好，把排氣夾子7打開，冷凝器下端浸沒在盛有2.5mL蒸餾水的25mL量筒的水中，量筒同時用冰水冷卻。加熱蒸汽發生器至沸，通汽加熱夾套蒸餾器，備用。向另取的100mL量筒中加入2～4滴消泡劑，再注入5℃左右未除氣啤酒100mL。待夾套蒸餾器下端開始冒大汽時，打開進樣口瓶塞，將啤酒迅速注入到蒸餾器內，再用10mL蒸餾水沖洗量筒，洗液同時倒入蒸餾器內，迅速蓋好進樣口塞子，用水封口。待下端再次冒大汽時，將排氣夾子夾住，開始蒸餾，接餾出液，直到餾出液接近25mL時，取下接受量筒，用少量蒸餾水沖洗冷凝管的下端，併入接受量筒，然後用蒸餾水定容至25mL，搖勻。氣相色譜分析（b）顯色混勻餾出液，分別吸取10mL餾出液於兩支比色管中。一管作為樣品管加入0.5mL1%鄰苯二胺溶液，另一管不加1%鄰苯二胺溶液作空白，充分搖勻後，同時置於暗處放置20～30min，然後於樣品管中加2mL4mol/L鹽酸溶液，於空白管中加2.5mL4mol/L鹽酸溶液，混勻。（c）測定在335nm波長處，用2cm比色皿以空白做對照，測定樣品的吸光度。④計算啤酒中雙乙醯的含量按下式計算：雙乙醯（mg/L）=A335×1.2式中：A335——用2cm比色皿測得的樣品的吸光度。1.2——換算係數。多次用純雙乙醯測得的經驗數值。如果實驗中使用的是1cm比色皿，則換算係數應為2.4。

氣相色譜分析⑤討論

（a）蒸餾時，加入試樣要迅速，勿使測定成分損失，而且應儘快蒸餾，最好在5min內完成。（b）蒸餾時，應嚴格控制蒸汽量，勿使泡沫過多而被蒸汽帶出而導致蒸餾失敗。如果蒸餾器過小或消泡劑效果較差時，可分兩次蒸餾，餾出液接受在同一量筒即可。（c）顯色反應應在暗處進行，否則結果將偏高。

氣相色譜分析2．單核苷酸的測定①基本原理由於單核苷酸分子中的堿基——嘌呤堿和嘧啶堿中都具有共軛雙鍵，因此核苷酸對紫外光有強烈的吸收性能，其最大吸收波長在260nm附近，在230nm處有一個低谷。而各種單核苷酸都有特定的紫外吸收的吸光度，因此，可用紫外分光光度分析法測定。測定時可採用標準曲線法，也可採用摩爾吸光係數法直接推算。幾種但核苷酸的摩爾吸光係數列表如下。

以AMP粗製品中AMP的含量測定為例。此法也適用於其他單核苷酸含量的測定。

氣相色譜分析

單核苷酸摩爾吸光係數（ε260）式量pH=2.0pH=7.0氫型鈉型腺嘌呤核苷5’-單磷酸（AMP）14.2×10315.0×103374.22391.22鳥嘌呤核苷5’-單磷酸（GMP）11.8×10311.4×103363.24407.24胞嘧啶核苷5’-單磷酸（CMP）6.2×1037.4×103323.31367.31尿嘧啶核苷5’-單磷酸（UMP）10.0×10310.0×103324.18368.18幾種單核苷酸的摩爾吸光係數列表如下：

氣相色譜分析

②試劑與儀器

試劑0.01mol/L鹽酸溶液取0.84mL濃鹽酸，用蒸餾水稀釋至