CN119462955A 融合蛋白以及索马鲁肽中间体多肽的制备方法 （弈柯莱生物科技(集团)股份有限公司）

司融合蛋白以及索马鲁肽中间体多肽的制备本发明公开了融合蛋白以及索马鲁肽中间以及与该前导肽序列相连的索马鲁肽中间体多高效表达出在该重组菌株的发酵液中可溶性好2前导肽序列和索马鲁肽中间体多肽序列，其中所述前导肽序列和索其中，所述前导肽序列为如SEQIDNO:6所示的PfKRED氨基酸序列或与所述PfKRED氨所述索马鲁肽中间体多肽序列为如SEQIDNO:2所示的Arg34GLP_1(9_37)氨基酸序列。进一步地，所述重组微生物细胞的出发菌株包括但不限于大肠杆菌JM109(D杆菌HMS174(DE3)、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Rostta2(DE3)、大肠杆菌Rosttagami7.一种如权利要求4所述的分离的核酸分子、利要求6所述的重组微生物细胞在表达如权利要求1至39.一种索马鲁肽中间体多肽Arg34GLP_1(9_37)的制备方法，其特征在于，包括如下步3对权利要求1至3任意一项所述的融合蛋白进行酶切，获得索马鲁肽中间体多肽述纯化包括：将含有所述融合蛋白的溶液在100℃至120℃的条件下加热以分离出杂蛋白，在所述融合蛋白含有组氨酸标签序列的条件下，所述纯化4法用于修饰GLP_1以便提供体内更长的作用持续时间，如替换GLP_1活性片段(7_37)中8位[0003]索马鲁肽(Semaglu[0004]目前现有技术中索马鲁肽的制备方法包括化学合成法，其进一步包括固相合成高。另外，专利CN114292338B公开了一种制备索马鲁肽中间体多肽Arg34GLP_1(9_37)或5[0010]其中，所述前导肽序列为如SEQIDNO:6所示的PfKRED氨基酸序列或与所述[0011]所述索马鲁肽中间体多肽序列为如SEQIDNO:2所示的Arg34GLP_1(9_37)氨基酸[0013]在另一优选例中，所述接头序列选自GGGG、GGGGG、GGGGS、GGGSG、EAAAK、AEAAAKALEA和PAPAP中的任意[0016]在另一优选例中，所述融合蛋白还包括位于所述前导肽序列的N端的亲和吸附标6[0028]进一步地，所述重组表达载体还包括用于整合入所述分离的核酸分子的pET系列[0031]进一步地，所述重组微生物细胞的出发菌株包括但不限于大肠杆菌JM109(DE3)、[0040]所述重组微生物细胞表达含有PfKRED或其等价序列将所述上清液加热至100℃至120℃,离心后获得次级上清液，从所述次级上清液中提取到[0041]所述重组微生物细胞表达带有组氨酸标签序列并且含有grpE或其等价序列的和[0044]对本发明第一方面提供的融合蛋白或者根据本发明第五方面所述的制备方法得7所述融合蛋白的蛋白酶酶切位点序列为IEGR或者IDGR，采用FactorXa蛋白酶进行所述酶[0047]在所述融合蛋白含有如SEQIDNO:6所示的PfKRED氨基酸序列的条件化包括：将含有所述融合蛋白的溶液在10的重组微生物细胞在制备索马鲁肽中间体多肽Arg34GLP_1(9_37)中的应[0051]图1PfKRED_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)表达菌株全菌液和[0052]图2PfKRED_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)蛋白酶切电泳图GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)融合蛋白与酶切8h后的纯化后的PfKRED_GGGSG_DDDDK_[0053]图3带有6xHis标签的grpE_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)表达菌株全菌液和上28.0kDa)的湿菌体的全菌液和上清液进行SDS_PAGE检测：泳道1，带有6xHis标签的grpE_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)全菌液；泳道2，带有6xHis标签的grpE_GGGSG_DDDDK_[0055]图5Arg34GLP_1(9_37)HPLC检测图谱；其中，Arg34GLP_1(9_37)保留时间：8及索马鲁肽中间体多肽Arg34GLP_1(9_37)的制备方法。本发明的融合蛋白采用了特定的前本发明实施例首先设计了能够表达上述融合蛋白的核苷酸序列，并且利用遗传背景清晰、用本发明实施例的索马鲁肽中间体多肽的制备方法生产索马鲁肽中间体多肽的收率很高，[0067]SUMO来源于酵母菌SaccharomycescerevisiaeS288C，其NCBI序列号为NP_[0069]本发明中，前导肽序列旨在包括如SEQIDNO:6所示的PfKRED氨基酸序列或与所9基酸序列，然后将另一条氨基酸序列与作为比较基准的氨基酸序列进行序列一致性对比。同一性＝两段氨基酸序列进行序列比对之后完全相同的氨基酸数目/作为比较基准的氨基鲁肽中间体多肽序列为如SEQIDNO:2所示的Arg34GLP_1(9_37)氨基酸序6xHis标签，是由六个连续的组氨酸(His)形成的氨基酸序列。组氨酸标签序列能够与Ni_液接种至TB培养基中，于35～40℃培养有PfKRED或其等价序列的融合蛋白时，所述纯化可包括：将所述上清液加热至100℃以上所述融合蛋白的所述亲和吸附标签序列具有特异性结合力的亲和树脂与所述上清液接触，[0115]实施例1表达PfKRED_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)融合[0116]本实施例构建了能够表达PfKRED_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)融合蛋白的重苷酸序列如SEQIDNO:4所示，氨基酸序列为DDDDK。D表示天冬氨酸(Asp)，K表示赖氨酸合蛋白的核苷酸序列的重组质粒。融合蛋白中的Arg3PfKRED_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)融合蛋白[0120]取10g表达PfKRED_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)融合蛋白的湿pH8.0的50mMTris_HCl溶液中(湿菌体的质量与Tris_HCl溶液的体积之比为1g:5mL)进行均淀。对全菌液和上清液分别进行SDS_PAGE检测，检测结果如图1所示。从图1可以看出，PfKRED_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)融合蛋白的条带位置显示其分子量符合预期分子质量与Tris_HCl溶液的体积之比为1g:5mL)进行均质破碎(均质温度0～4℃)，10000rpm离100℃条件下加热20min(加热的目的是使杂蛋白发生热变性而从上清液中析出，而融合蛋白由于不会在加热时发生热变性而仍然溶解在上清液中)。再次于10000rpm离心10min(目采用肠激酶以DDDDK为酶切位点进行酶切，之后才能得到索马鲁肽中间体多肽Arg34GLP_1能够对PfKRED_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)融合蛋白进行特异性[0127]肠激酶通过以下方法获得。设计肠激酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQID温育24h，以使变性后的肠激酶复性并正确折叠后溶于该复性溶液中，以便后继能够特异[0130]肠激酶酶活定义：在25℃、50mMTris_HCl、pH8.0条件下，8h能完全酶切1mgPfKRED_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_3[0131]实施例5肠激酶酶切PfKRE_GGGSG_DDDDDK_Arg34GLP_1(9_37)获得Arg34GLP_1(9_[0132]取50.2mL纯化后的PfKRED_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)融合蛋白溶液蛋白溶液。DDDDDK为肠激酶的酶切位点，因此，融合蛋白在被肠激酶酶切后能够产生的肠激酶能够特异性地作用于酶切位点DDDDDK，并且酶切后产生的Arg34GLP_1(9_37)能够与酶切前的PfKRED_GGGSG_DDDDK_Arg34G粉加10mL超纯水进行复溶。本次冻干的目的是减少实施例5中酶切后得到的Arg34GLP_1(9_(9_37)分子量与理论值(3175.5Da)一致，Arg34GLP_1(9_37)的纯度为96.1收率为总峰面积的比值计算Arg34GLP_1(9C[0143]实施例7Kex2蛋白酶酶切PfKRED_GGGSG_KR_Arg34GLP_1(9_37)融合蛋白获得取10g湿菌体获得52.9mL浓度为11.3mg/mL的PfKRED_GGGSG_KR_Arg34GLP_1(9_37)融合蛋分子量7kDa)进行透析(以除去咪唑)，透析液为pH8.0的50mMTris_HCl溶液；透析后获得全酶切1mgKex2_GGGSG_KR_Arg34GLP_1(9_37)蛋白[0150]取(1)中得到的PfKRED_GGGSG_KR_Arg34GLP_1(9_37)融合蛋白，加入工作浓度为白溶液。对酶切后所得的Arg34GLP_1(9_37)的蛋(9_37)，通过LC_MS检测，获得的Arg34GLP_1(9_37)分子量与理论值(3175.5Da)一致；[0151]实施例8肠激酶酶切带有6xHis标签的grpE_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)融合[0152]8.1带有6xHis标签的grpE_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)融合蛋白的重组工程[0153]构建可表达带有6xHis标签的grpE_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_组工程菌株，诱导表达重组工程菌株，以获得带有6xHis标签的grpE_GGGSG_DDDDK_示，氨基酸序列如SEQIDNO:15所示。对表达了带有6xHis标签的grpE_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)融合蛋白的重组工程菌株的全菌液和上清液进行SDS_PAGE电泳检测,结[0154]8.2带有6xHis标150mMNaCl500mM咪唑并且pH8.0的溶液为洗脱液进行梯度洗脱(可按树脂厂商推荐方法[0156]8.3肠激酶酶切带有6xHis标签的grpE_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)，获得Arg34GLP_1(9_37)及Arg34GLP_1(9_37)的[0158]取12.4mL实施例8.2获得的带有6xHis标签的grpE_GGGSG_DDDDK_Arg34GLP_1(9_37)蛋白，通过LC_MS检测，通过LC_MS检测，获得的Arg34GLP_1(9_37)分子量与理论值[0161]实施例9Kex2蛋白酶酶切带有6xHis标签的grpE_GGGSG_KR_Arg34GLP_1(9_37)获[0162]9.1构建可表达带有6xHis标签的grpE_GGGSG_KR_Arg34GLP_1(9_1(9_37)融合蛋白，具体步骤参考实施例1_2；取10g湿菌体获得的融合蛋白的浓度为[0163]9.2带有6xHis标签的grpE_GGGSG_KR_Arg34GLP_1(9_37)融Arg34GLP_1(9_37)分子量与理论值(3175.5Da)一致；Arg34GLP_1(9_37)的纯度为94.5收[0167]10.1带有6xHis标签的SUMO_Arg34GLP_1(9_37)融合蛋白的达[0168]构建可表达带有6xHis标签的SUMO_Arg34GLP_1(9_37)融合蛋白的重组工程菌株，诱导表达该重组工程菌株，以获得表达了带有6xHis标签的SUMO_Arg34GLP_1(9_37)融合蛋[0169]对表达了带有6xHis标签的SUMO_Arg34GLP_1(9_37)融合蛋有20mMTris_HCl、150mMNaCl并且pH8.0的溶液按照~4℃)，于10000rpm、4℃离心10mi[0174]SUMO蛋白酶的获得及纯化步骤参考实施例7.2[0176]10.4SUMO蛋白酶酶切带有6xHis标签的