生物制药工艺学期末试卷及答案-关键知识点与应用

生物制药工艺学期末试卷及答案:关键知识点与应用一、名词解释（每题3分，共15分）1.次级代谢产物答案：次级代谢产物是指微生物在生长后期或静止期合成的、对微生物自身生长和繁殖无明显功能的代谢产物，如抗生素、色素、生物碱等，常具有特定的生物活性。2.种子扩大培养答案：将保存的菌种经活化后，通过一系列逐级放大培养，获得足够数量、活力旺盛且生长状态同步的纯种培养物，供大规模发酵接种使用。3.亲和层析答案：利用生物分子（如蛋白质）与其配体之间特异性、可逆的亲和力进行分离纯化的层析技术。将配体固定在载体上，样品通过时目标分子被选择性吸附，再通过改变离子强度或pH等条件将其洗脱。4.比活力答案：每毫克蛋白质中所含生物活性物质的活力单位数，即活力单位数除以蛋白质毫克数，用于评价样品中目标物质的纯化程度。5.生物制品答案：以微生物、细胞或动物体液、组织等为原料，采用生物学工艺或基因工程技术制备的，用于预防、治疗和诊断的制品，如疫苗、抗毒素、重组蛋白药物等。二、单项选择题（每题2分，共20分）1.大肠杆菌系统中表达外源重组蛋白时，最常用的强启动子是（）A.CMV启动子B.T7启动子C.SV40启动子D.PGK启动子答案：B解析：T7启动子由T7RNA聚合酶驱动，转录效率高，是大肠杆菌表达系统中最常用的强启动子；CMV、SV40常用于哺乳动物细胞，PGK常用于酵母表达系统。2.动物细胞贴壁培养时，消化分散细胞常用的酶是（）A.溶菌酶B.胃蛋白酶C.胰蛋白酶D.纤维素酶答案：C解析：胰蛋白酶能水解细胞外基质的黏附蛋白，使贴壁细胞从培养表面脱离，常用于细胞传代。3.纯化带His标签的重组蛋白时，最合适的层析方法是（）A.凝胶过滤层析B.离子交换层析C.金属螯合亲和层析D.疏水作用层析答案：C解析：His标签可特异性结合镍离子或钴离子，金属螯合亲和层析（IMAC）是纯化His标签蛋白的首选方法。4.发酵过程中，常用来调节培养液pH的碱性物质是（）A.盐酸B.柠檬酸C.氨水D.硫酸答案：C解析：发酵代谢过程常产酸，氨水既可中和酸调节pH，又能补充氮源，应用广泛；盐酸、硫酸等一般用于下调pH。5.重组蛋白在大肠杆菌中形成包涵体时，下列处理方式错误的是（）A.用高浓度尿素或盐酸胍溶解B.直接进行离子交换层析C.通过逐步去除变性剂进行复性D.可采用稀释法复性答案：B解析：包涵体必须先溶解变性，再在适宜条件下复性，不能直接进行离子交换层析；其他三种方法均属正确操作。6.病毒灭活疫苗常用的灭活剂是（）A.甲醛B.乙醇C.青霉素D.十二烷基硫酸钠答案：A解析：甲醛可破坏病毒的核酸或蛋白质外壳，是经典的病毒灭活剂；SDS虽然使蛋白变性，但一般不用于疫苗灭活。7.单克隆抗体分子中，主要介导抗体效应功能（如补体激活、Fc受体结合）的区域是（）A.可变区（CDR）B.铰链区C.Fc段D.Fab段答案：C解析：Fc段可与FcγR、C1q等结合，启动ADCC、CDC等效应；Fab段决定抗体对抗原的特异性结合。8.超滤膜截留分子量（MWCO）的单位通常表示为（）A.kDa或DaB.μmC.mmol/LD.U/mL答案：A解析：超滤膜孔径以截留分子量表示，常用单位是道尔顿（Da）或千道尔顿（kDa）。9.下列不属于生物制药“三废”的是（）A.废水B.废气C.废热D.废渣答案：C解析：生物制药“三废”指废水、废气、废渣（固体废物），废热不属于常规“三废”范畴。10.可避免接触抑制、适用于大规模生产单抗的动物细胞培养方式是（）A.贴壁培养B.悬浮培养C.微载体培养D.组织培养答案：B解析：悬浮培养中细胞均匀分散，不存在接触抑制，易放大培养规模；微载体培养仍属于贴壁培养类型。三、判断题（每题1分，共10分）1.大肠杆菌表达系统不具备糖基化修饰能力，因此产物一般无糖基化。答案：√解析：大肠杆菌缺乏糖基化修饰系统，因此重组糖蛋白通常采用真核表达系统生产。2.发酵过程中培养基溶氧浓度越高，对产物合成越有利。答案：×解析：过高的溶氧会产生活性氧自由基，抑制细胞生长和产物合成，溶氧需控制在适宜范围。3.亲和层析是一种基于分子大小差异进行分离的技术。答案：×解析：亲和层析基于生物分子的特异性亲和结合，基于分子大小分离的是凝胶过滤层析。4.包涵体蛋白一定不具有生物活性。答案：×解析：包涵体多为无活性的错误折叠聚集体，但部分包涵体中可能含有少量天然构象，不能绝对化判定。5.CHO细胞常用于表达需要复杂糖基化的重组蛋白。答案：√6.低pH孵育、溶剂/去污剂处理等方法可有效灭活脂包膜病毒。答案：√7.下游加工的第一步通常是对发酵液进行固液分离，如离心和微滤。答案：√8.层析柱的理论塔板数越高，说明柱效越低。答案：×解析：理论塔板数越高，柱效越高，分离能力越强。9.超滤可以用于去除制品中的热原。答案：√解析：内毒素（热原）分子量较大，选择合适截留分子量的超滤膜可将其去除。10.生物制品“冷链”要求仅适用于疫苗储运，不适用于单抗类药物。答案：×解析：绝大多数生物制品包括单抗类药物对温度敏感，均需冷链储运以保持活性。四、填空题（每空1分，共15分）1.生物制药工艺学中，上游通常指__，中游指，下游指__。答案：工程菌/工程细胞的构建；发酵或细胞培养；分离纯化与制剂制备2.重组蛋白药物常用的表达系统有__、、__。答案：大肠杆菌表达系统；酵母表达系统；哺乳动物细胞表达系统（如CHO细胞）3.发酵过程中需要控制的主要工艺参数有温度、pH、__、、__等。答案：溶解氧浓度；搅拌转速；补料速率（或接种量/罐压）4.蛋白质分离纯化常用的层析方法包括__、、、__。答案：离子交换层析；凝胶过滤层析；亲和层析；疏水作用层析5.生物制品的质量控制要求包括安全性、__、__。答案：有效性；纯度五、简答题（每题5分，共20分）1.简述重组蛋白药物的一般生产工艺流程。答案：（1）上游构建：目的基因克隆，构建表达载体，转入宿主细胞，筛选高表达工程菌或工程细胞株；（2）中游培养：进行发酵或细胞培养，控制温度、pH、溶氧等参数，诱导目标蛋白表达；（3）下游分离纯化：根据表达形式进行细胞破碎（胞内表达时）、固液分离，经盐析、超滤、层析等步骤获得高纯度目的蛋白；（4）制剂制备：加入稳定剂和赋形剂，除菌过滤，无菌灌装，冻干或制成液体制剂，并进行质量检验。2.简述动物细胞培养与微生物发酵相比的主要特点。答案：（1）动物细胞体积大、生长慢，对剪切力敏感，需采用温和搅拌和低剪切力培养环境；（2）营养要求复杂，需添加血清或血清替代物、氨基酸、维生素等成分；（3）培养周期长，培养基营养丰富，更易污染，对无菌操作要求高；（4）产物多为分泌型重组蛋白，糖基化等翻译后修饰正确，但表达量一般低于微生物系统；（5）细胞代谢产生乳酸和氨等副产物，需严格控制葡萄糖和谷氨酰胺浓度。3.简述亲和层析的基本原理及其在生物制药中的应用实例。答案：原理：将特异性配体（如抗体、金属离子、酶抑制剂等）固定在不溶性载体上，目标分子与配体可逆结合，杂质不被结合，通过改变洗脱条件获得高纯度目标物质。应用实例：His标签蛋白用镍离子亲和层析纯化；抗体用ProteinA亲和层析纯化；酶可用底物或抑制剂亲和层析纯化。4.简述生物制药药品质量控制的主要阶段。答案：（1）原辅料质量控制：对培养基、水、缓冲液、层析介质及试剂等原料进行检验；（2）过程中间质量控制：对培养液、纯化中间品进行取样检测，包括pH、蛋白浓度、纯度、杂质残留等；（3）成品质量控制：按药典标准进行无菌、热原、内毒素、纯度、效力、安全性和稳定性等检验。六、论述题（每题10分，共20分）1.论述从重组大肠杆菌生产人干扰素α-2b的工艺过程及其关键控制点。答案：（1）上游构建：将人干扰素α-2b基因克隆至表达载体（如pET系列），转化大肠杆菌，筛选高表达工程菌株。（2）发酵培养：采用补料分批发酵，控制温度（生长期约37℃，诱导期降至25~30℃）、pH约7.0、溶氧20%~40%，加入IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导表达，并控制诱导时间和IPTG浓度以优化包涵体产量与质量。（3）菌体收获与破碎：离心收集菌体，经高压匀浆或超声破碎释放包涵体。（4）包涵体洗涤与溶解：用含去污剂（如TritonX-100）的缓冲液洗涤去除膜脂和杂蛋白，再用6mol/L盐酸胍或8mol/L尿素溶解包涵体，必要时加入还原剂（如DTT）打开二硫键。（5）复性：通过稀释法或透析法逐步降低变性剂浓度，使蛋白重新折叠。复性液中可加入氧化还原剂（如GSH/GSSG），促进二硫键正确配对，同时缓慢搅拌防止聚集。（6）纯化：复性液经超滤浓缩、换液后，依次采用离子交换层析、疏水相互作用层析或凝胶过滤层析纯化，获得高纯度干扰素，并进行比活性和纯度检测。（7）制剂：加入人血白蛋白或聚山梨酯等稳定剂，除菌过滤，无菌灌装，冷冻干燥制成粉针剂。关键控制点：IPTG浓度、诱导温度和诱导时间；包涵体溶解的变性剂浓度与时间；复性过程中防止蛋白聚集、提高复性收率；纯化后去除宿主蛋白、内毒素和核酸等杂质。解析：本题要求完整表述从基因到制剂的全流程。评分重点为：上游构建、发酵诱导、包涵体处理、复性、纯化和制剂步骤是否完整，以及是否说明各步骤的关键控制参数。2.论述以CHO细胞表达单克隆抗体药物的工艺流程及质量控制要点。答案：（1）构建工程细胞株：将抗体轻链和重链基因克隆至表达载体，转染CHO细胞，经筛选获得稳定高表达的单克隆细胞株，并进行单克隆化和传代稳定性研究。（2）种子扩增与培养：从主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）复苏细胞，逐步放大培养。采用无血清悬浮培养，在生物反应器中进行流加培养或灌流培养。（3）培养过程控制：维持温度约37℃，pH7.0~7.2，溶氧30%~50%，在线监控细胞密度和活率，控制葡萄糖、谷氨酰胺等营养物浓度，并监测乳酸、氨等代谢副产物。（4）收获与澄清：当抗体浓度达到峰值后降温终止培养，经离心或深层过滤去除细胞，收获细胞培养上清液。（5）纯化工艺：先用ProteinA亲和层析捕获抗体，经低pH病毒灭活（如pH3.5孵育），再依次通过阳离子交换层析和阴离子交换层析精纯，去除宿主蛋白、DNA、脱落ProteinA及聚集体，最后用20nm纳滤膜去除病毒。（6）制剂制备：超滤浓缩换液至目标浓度，加入蔗糖、表面活性剂等稳定剂，除菌过滤，无菌灌装，冻干或制成液体制