荧光探针在活性氧检测中的应用研究综述

荧光探针在活性氧检测中的应用研究综述一、活性氧的生物学特性与检测需求活性氧（ReactiveOxygenSpecies,ROS）是生物体内有氧代谢过程中产生的一系列含氧化合物的总称，主要包括超氧阴离子（O₂·⁻）、羟自由基（·OH）、过氧化氢（H₂O₂）、单线态氧（¹O₂）、次氯酸（HClO）等。正常生理条件下，细胞内活性氧的产生与清除处于动态平衡状态，低浓度的活性氧可作为信号分子参与细胞增殖、分化、免疫防御等多种生理过程，是维持细胞稳态不可或缺的调控因子。当机体受到外界刺激（如辐射、化学毒物、病原微生物入侵）或自身抗氧化系统功能受损时，活性氧的生成速率超过清除速率，就会引发氧化应激反应，导致蛋白质、脂质、核酸等生物大分子发生氧化损伤，进而诱发炎症、心血管疾病、神经退行性疾病、恶性肿瘤等多种病理过程。不同种类的活性氧具有不同的化学性质、生物学半衰期和作用位点。例如羟自由基的氧化活性极强，半衰期仅为纳秒级，极易与周围生物分子发生非特异性反应；过氧化氢相对稳定，可在细胞内扩散并穿透细胞膜，实现跨细胞信号传递；次氯酸主要由活化的中性粒细胞产生，是机体免疫防御系统杀伤病原微生物的重要效应分子。这种高度的异质性决定了活性氧检测不仅需要实现定量分析，还需要具备物种特异性和时空分辨能力，才能准确揭示不同活性氧在生理病理过程中的具体作用机制。传统的活性氧检测方法主要包括电子自旋共振法、化学发光法、比色法等，但这些方法普遍存在侵入性强、无法实现活细胞实时动态检测、空间分辨率不足等局限性，难以满足复杂生物体系中活性氧精准检测的需求。荧光探针技术凭借其灵敏度高、选择性好、操作简便、可实现原位无损检测等优势，逐渐成为活性氧检测领域的主流技术手段，为解析活性氧的生物学功能提供了强大的工具支撑。二、荧光探针的设计原理与响应机制活性氧荧光探针通常由识别基团、荧光团和连接臂三部分组成。识别基团是决定探针特异性的核心结构，能够与目标活性氧发生专一性化学反应，从而引发探针的荧光信号变化；荧光团负责将识别过程的化学信号转换为可检测的光学信号，其光学性质直接影响探针的检测灵敏度和成像效果；连接臂则用于共价连接识别基团和荧光团，合理的连接臂设计可以调控识别基团与荧光团之间的电子传递或能量传递效率，优化探针的响应性能。根据响应后荧光信号变化模式的不同，活性氧荧光探针可分为“关-开”型、“开-关”型和比率型三类。“关-开”型探针在未与活性氧反应时，分子内存在光诱导电子转移（PET）、分子内电荷转移（ICT）、荧光共振能量转移（FRET）等效应导致荧光处于淬灭状态，当识别基团与目标活性氧发生反应后，淬灭效应被解除，荧光强度显著升高，这类探针具有背景信号低、信噪比高的优势，是目前应用最广泛的探针类型。“开-关”型探针则相反，反应后荧光基团的共轭结构被破坏，导致荧光强度下降，这类探针易受生物体系背景荧光波动干扰，定量准确性相对较低，应用场景较为受限。比率型探针通过同时记录两个不同波长处的荧光强度变化，利用二者的比值作为定量信号，能够有效消除探针浓度不均、光漂白、环境因素干扰等系统误差，显著提高检测的准确性和可靠性，是近年来荧光探针设计的重要发展方向。针对不同活性氧的化学特性，研究人员开发了多种特异性识别机制。对于过氧化氢，常用的识别基团包括硼酸及其酯类、苯硼酸频哪醇酯等，这类基团可与过氧化氢发生特异性氧化反应，生成酚羟基并引发分子内电子重排，从而释放出荧光团；对于次氯酸，常见的识别位点包括硫醚、硒醚、肟、肼、氨基苯甲酰基等，这些基团可被次氯酸快速氧化，改变探针的电子云分布；对于羟自由基，通常利用其对芳香环的羟基化作用或对烯烃双键的加成反应实现特异性识别；对于单线态氧，则多采用蒽环、吡啶酮等作为识别基团，通过[4+2]环加成反应生成内过氧化物，引发荧光信号变化。三、不同类型活性氧荧光探针的研究进展（一）小分子有机荧光探针小分子有机荧光探针是发展最早、研究最成熟的一类活性氧探针，常见的荧光团母核包括香豆素、罗丹明、荧光素、花菁、BODIPY等。香豆素类荧光团具有斯托克斯位移大、光稳定性好、细胞毒性低等优点，非常适合用于活细胞成像。2021年，研究人员以7-羟基香豆素为荧光团，通过硼酸酯作为识别基团，构建了一种靶向线粒体的过氧化氢荧光探针，该探针能够特异性响应细胞内线粒体产生的过氧化氢，检测限低至23nM，成功应用于细胞氧化应激过程中线粒体过氧化氢动态变化的实时成像。罗丹明类荧光团具有量子产率高、荧光发射波长位于可见光区、抗光漂白能力强等特点，是构建“关-开”型探针的常用母核。针对次氯酸检测需求，有团队将硫原子引入罗丹明的呫吨环结构中，利用次氯酸对硫醚的特异性氧化作用，开发了一种快速响应的次氯酸荧光探针，该探针响应时间小于5秒，对次氯酸的选择性远高于其他活性氧，实现了小鼠急性炎症模型中内源性次氯酸的活体成像。花菁类荧光团的发射波长可延伸至近红外区（650-900nm），能够有效降低生物组织的光散射和背景荧光干扰，具有更深的组织穿透深度，适合用于活体层面的活性氧检测。2023年，研究人员设计合成了一种发射波长位于820nm的近红外超氧阴离子荧光探针，通过将三苯基膦作为线粒体靶向基团修饰在花菁母核上，实现了肿瘤组织缺氧过程中线粒体超氧阴离子产生过程的实时动态监测，成像深度可达500μm，为肿瘤微环境中氧化应激相关机制研究提供了新的工具。（二）纳米荧光探针纳米荧光探针结合了纳米材料的独特物理化学性质与荧光检测的高灵敏度优势，近年来在活性氧检测领域受到广泛关注。目前应用较多的纳米荧光探针主要包括量子点、碳点、金属纳米簇、上转换纳米颗粒等。量子点具有量子产率高、发射波长可调、光稳定性优异等特点，但传统的镉基量子点生物毒性较高，限制了其在生物体系中的应用。针对这一问题，研究人员开发了低毒性的铜铟硫量子点，通过表面修饰硼酸酯基团，构建了过氧化氢响应纳米探针，该探针细胞毒性低，可实现细胞内过氧化氢的长时间成像监测。碳点作为一种新型碳基纳米材料，具有合成简便、生物相容性好、易于功能化等优点，是活性氧检测领域的研究热点。有团队以柠檬酸和乙二胺为原料合成了蓝色荧光碳点，利用羟自由基能够氧化碳点表面缺陷导致荧光淬灭的特性，构建了羟自由基检测纳米探针，检测限可达0.12μM，成功应用于药物诱导细胞氧化损伤过程中羟自由基释放的定量检测。上转换纳米颗粒能够将低能量的近红外光转换为高能量的可见光发射，具有激发波长位于生物组织光学窗口、无背景荧光干扰、组织穿透深度深等独特优势。研究人员将次氯酸响应的有机荧光染料负载到上转换纳米颗粒表面，利用荧光共振能量转移原理构建了次氯酸比率型纳米探针，在980nm激光激发下，通过检测540nm和650nm处的荧光强度比值实现次氯酸的定量检测，成功应用于小鼠关节炎模型中内源性次氯酸的活体成像，检测深度可达1.2cm，显著优于传统可见光激发的荧光探针。（三）基因编码荧光探针基因编码荧光探针是将荧光蛋白与活性氧响应的敏感蛋白融合表达而成的一类探针，可通过基因转染技术实现细胞内的稳定表达，具有天然的生物相容性、可靶向特定细胞器、能够实现长时间动态监测等优势，是解析活性氧生理功能的理想工具。其中，HyPer系列是最具代表性的过氧化氢基因编码探针，由环形重排的黄色荧光蛋白与大肠杆菌的过氧化氢调节蛋白OxyR的调节结构域融合而成，能够特异性响应纳摩尔级的过氧化氢，且响应可逆，可实时追踪细胞内过氧化氢的动态变化。在此基础上，研究人员通过定点突变对HyPer进行改造，开发了具有不同灵敏度和动态范围的变体，以及靶向线粒体、内质网、细胞核等不同亚细胞器的探针，为研究不同细胞器中过氧化氢的信号转导功能提供了有力工具。针对次氯酸检测，研究人员基于黄色荧光蛋白的β-折叠结构中特定甲硫氨酸残基可被次氯酸特异性氧化的特性，开发了次氯酸基因编码探针HypoClome，该探针对次氯酸具有高度选择性，对其他活性氧无明显响应，成功应用于免疫细胞吞噬过程中次氯酸产生的动态成像。近年来，随着红色荧光蛋白和近红外荧光蛋白的发展，基因编码荧光探针的发射波长逐渐向长波长方向拓展，进一步降低了光毒性和背景荧光干扰，为活体层面的活性氧检测提供了可能。四、荧光探针在活性氧相关疾病研究中的应用（一）炎症相关疾病炎症反应过程中，活化的免疫细胞会大量产生活性氧以杀伤入侵的病原微生物，但过量的活性氧释放也会导致周围正常组织损伤，加重炎症反应。利用荧光探针技术，研究人员能够实时动态监测炎症部位活性氧的产生和分布，为炎症的发病机制研究和治疗效果评估提供重要依据。有团队使用自己开发的次氯酸特异性荧光探针，成功观测到小鼠急性腹膜炎模型中炎症部位次氯酸的动态积累过程，发现炎症部位的荧光强度与炎症因子水平呈显著正相关，证明该探针可用于炎症的早期诊断和治疗效果的无创评估。在类风湿性关节炎研究中，近红外活性氧荧光探针能够清晰显示关节部位的氧化应激水平，为评估关节炎的进展程度和抗炎症药物的疗效提供了可视化手段。（二）肿瘤研究肿瘤细胞的代谢重编程导致其处于持续的氧化应激状态，细胞内活性氧水平显著高于正常细胞，这种升高的活性氧水平在促进肿瘤细胞增殖、侵袭、转移以及耐药性产生等过程中发挥重要作用。荧光探针技术为研究肿瘤微环境中活性氧的动态变化提供了高效工具。研究人员利用线粒体靶向的超氧阴离子荧光探针，发现肿瘤细胞在缺氧条件下线粒体电子传递链产生的超氧阴离子显著增加，而抑制超氧阴离子的产生能够显著降低肿瘤细胞的侵袭能力，揭示了活性氧在肿瘤转移中的调控机制。此外，活性氧响应型荧光探针还可用于肿瘤的早期诊断，由于肿瘤组织的活性氧水平明显高于周围正常组织，探针在肿瘤部位能够被特异性激活产生荧光信号，实现肿瘤的高对比度成像，微小肿瘤病灶的检出直径可低至1mm。（三）神经退行性疾病氧化应激是阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的重要病理特征，大量研究表明，神经元中活性氧的过度积累会导致α-突触核蛋白聚集、Tau蛋白过度磷酸化以及神经元凋亡，加速疾病的进展。由于血脑屏障的存在，传统检测方法难以实现脑内活性氧的原位检测。近年来，研究人员开发了一系列能够穿透血脑屏障的近红外活性氧荧光探针，成功实现了阿尔茨海默病小鼠模型脑内过氧化氢的无创成像，发现脑内过氧化氢水平与β-淀粉样斑块的沉积量呈正相关，为神经退行性疾病的早期诊断和病情监测提供了新的方法。此外，利用活性氧荧光探针，研究人员还能够评估抗氧化药物对神经元的保护效果，为神经退行性疾病治疗药物的筛选提供了高通量检测手段。五、活性氧荧光探针面临的挑战与发展方向尽管活性氧荧光探针的研究已经取得了显著进展，但在实际应用中仍然面临诸多挑战。首先，复杂生物体系中存在多种活性氧、还原性物质以及生物大分子，如何进一步提高探针的特异性，避免非目标物质的干扰，仍然是探针设计需要解决的核心问题。其次，大多数现有探针的响应是不可逆的，只能反映活性氧的积累量，无法实现活性氧水平的实时动态定量监测，难以捕捉活性氧的瞬时变化信号。此外，现有探针的组织穿透深度有限，难以实现深层组织和活体器官中活性氧的准确检测，近红外二区（1000-1700nm）荧光探针的开发有望解决这一问题，但目前相关研究仍处于起步阶段。未来，活性氧荧光探针的发展主要集中在以下几个方向：一是开发多组分同时检测的荧光探针，通过不同发射波长的信号区分多种活性氧，实现复杂生物体系中不同活性氧的同步定量分析，更全面地揭示氧化应激网络的调控机制；二是进一步优化探针的靶向性能，实现对特定细胞器、特定细胞甚至特定生物分子附近活性氧的精准检测，深入解析活性氧的亚细胞定位功能；三是发展高时空分辨率的荧光探针与成像技术结合的检测体系，结合超分辨荧光显微镜技术，实现活细胞内活性氧的纳米级空间分