CN119491011A 一种通过氧气响应代谢开关调控还原tca途径基因表达提高木糖代谢能力的方法 （北京化工大学）

号一种通过氧气响应代谢开关调控还原TCA途本发明公开了一种通过氧气响应代谢开关调控还原TCA途径基因表达提高木糖代谢能力的无氧条件下高表达的氧气响应代谢开关调控构建的工程菌可在以木糖为单独底物或以葡萄提高木糖代谢能力的方法为构建在厌氧发酵生产条件下高效代谢玉米秸秆水解液等含木糖基21.一种通过氧气响应代谢开关调控还原TCA途径基因表达提高木糖代谢能力的方法，所述基因表达调控元件包括应用于调控大肠杆菌基因表达的表达调控元件PglpA和表达所述表达调控元件PglpA序列如SEQIDNO.30中1_230b所述表达调控元件PfrdA序列如SEQIDNO.54中1_300b所述表达调控元件PADH1序列如SEQIDNO.61中9_263b2.根据权利要求1所述的一种通过氧气响应代谢开关调控还原TCA途径基因表达提高所述重组大肠杆菌BX_08的构建方法如下：以大肠杆菌BW25113为酰酶基因pta和过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧所述重组大肠杆菌BX_09的构建方法如下：以大肠杆菌BW25113为酰酶基因pta和过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧所述重组酿酒酵母SC_04的构建方法如下：以酿酒酵母S288C为出发3.根据权利要求2所述的一种通过氧气响应代谢开关调控还原TCA途径基因表达提高所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pck序列如SEQIDNO.2带有所述表达调控元件PglpA的苹果酸脱氢酶基因mdh如SEQID带有所述表达调控元件PglpA的富马酸酶B基因fumB如SEQID带有所述表达调控元件PglpA的富马酸还原酶基因簇frdABCD如SEQID带有所述表达调控元件PfrdA的富马酸还原酶基因簇frdABCD如SEQID含有木糖还原酶基因XYL1、木糖醇脱氢酶基因XYL2、木酮糖激酶基达调控元件PADH1调控的富马酸酶B基因fumB的片段如SEQIDNO.7.权利要求4所述的重组大肠杆菌BX_08、权利要求5所述要求6所述的重组酿酒酵母SC_04在高效代谢木权利要求5所述的重组大肠杆菌BX_09或权利要求6所述的重组酿酒酵母SC_04进行厌氧发34代谢开关调控还原TCA途径基因表达提高高效共利用对于木质纤维素生物质的规模化工业利用代谢木糖的基因工程改造技术对于改造大肠杆菌和酿酒酵母等重要工业微生物高效代谢[0004]因此，提供一种通过氧气响应代谢开关调控还原TCA途径基因表达提高木糖代谢提高了大肠杆菌和酿酒酵母单独利用木糖或共利用葡萄糖、木糖时的木糖代谢效率，为构5建高效代谢木糖生产化学品的基因工程菌提供了一种通过氧气响应代谢开关调控还原TCA途径基因表达提高木糖代谢能力的方所述基因表达调控元件包括应用于调控大肠杆菌基因表达的厌氧甘油_3_磷酸脱用于调控酿酒酵母基因表达的乙醇脱氢酶1基因(ADH1)的表达调控所述表达调控元件PfrdA序列如SEQIDNO.54中1_300b所述表达调控元件PADH1序列如SEQIDNO.61中9_263b[0008]进一步，所述的一种通过氧气响应代谢开关调控还原TCA途径基因表达提高木糖[0011]苹果酸脱氢酶基因mdh、富马酸酶B基因fumB和富马酸还原酶基因簇frdABCD为pta和过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基酸脱氢酶基因mdh和富马酸酶B基因fum解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）的木酮糖激酶基因XKS1，过表达由表达调控元件的基因XYL1和编码木糖醇脱氢酶的基因XYL2、异源表达来源于解脂耶氏酵母（Yarrowia[0016]通过氧气响应代谢开关PADH1表达大肠杆菌富马酸酶B基因fumB可以增强酿酒酵母6带有表达调控元件PglpA的苹果酸脱氢酶基因mdh如SEQID带有表达调控元件PglpA的富马酸酶B基因fumB如SEQID带有表达调控元件PglpA的富马酸还原酶基因簇frdABCD如SEQID带有表达调控元件PfrdA的富马酸还原酶基因簇frdABCD如SEQID达调控元件PADH1调控的富马酸酶B基因fumB的片段如SEQIDNO.应代谢开关调控还原TCA途径基因表达提高木糖代谢能力的方法，具体提供一种更高效的一种通过氧气响应代谢开关调控还原TCA途径基因表达提高木糖代谢能力的方7O[0037]PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳和产物回收后得到上游同源臂基因片段F和下游同[0041]以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，ΔptsG_gRNA_F和gRNA_R为引物扩增获得[0045]将ΔptsG_gRNA基因片段和pEcgRNA质粒分别用内切酶XhoI和SpeI在37℃条件下分别酶切2小时，酶切产物经过回收后分别得到ΔptsG_gRNA酶切片段和酶切的pEcgRNA片[0048]将ΔptsG_gRNA酶切片段和酶切的pEcgRNA片段在T4DNA连接酶作用下22℃连接8℃复苏，涂于含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板，37℃培养至长出单菌落。将上述携带℃培养至长出单菌落。9[0076]Δpta_gRNA_F：5’_GGACTAGTAGAAAGTGACGGATTTAACGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGO[0089]以上游同源臂基因片段F、待整合基因pck片段M和下游同pck_1和pck_6为引物PCR扩增获得含过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因整合片段pck_备敲除质粒ΔptsG_gRNA。制备整合质粒pck_gRNA所用pck_gRNA_F引物序列如下：5’_ptsG基因中敲除质粒ΔptsG_gRNA和敲除片段ΔptsG_1000替换为整合基因所用的整合质以工程菌株BX_05为基础，通过PglpA调控元件过表达内源性大肠杆菌苹果酸脱氢DNA为模板制备整合质粒所用上游引物为mdh_gRNA_F。过表达内源性大肠杆菌苹果酸脱氢酶mdh基因后的菌株命名为工程菌株BX_[0101]mdh_5：5’_gttcgttaataagtaagtgttaagaagcccatcagtctgataagg_3’；SEQID控元件PglpA）以及fumB_5和fumB_6（以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板制备整合质粒1_230bp为厌氧表达调控元件PglpA）以及frdABC组DNA为模板制备整合质粒所用上游引物为frdABCD_gRNA_F。过表达内源性大肠杆菌富马酸还原酶frdABCD基因簇后的菌株命名为工程菌株B[0114]frdABCD_2：5’_ctcactgaatcagggatagcaggaaggtttctgtcaacaatc_3NO.48。[0120]实施例3以工程菌株BX_07为基础，通过PfrdA调控元件过表达内源性大肠杆菌富[0121]以工程菌株BX_07为基础，通过PfrdA调控元件过表达内源性大肠杆菌富马酸还原酶frdABCD基因簇，制备基因整合片段所用引物为frdABCD_1和frdABCD_f2（以大肠杆菌1_300bp为厌氧表达调控元件PfrdA）以及frdABCD_组DNA为模板制备整合质粒所用上游引物为frdABCD_gRNA_F。过表达内源性大肠杆菌富frdABCD_f2：gagtagacttcgtgcccggatagcaggaaggtttctgtcaacaatc；SEQID一种通过氧气响应代谢开关调控还原TCA途径基因表达提高木糖代谢能力的方以酿酒酵母S288C为出发菌株，异源表达含来源于树干毕赤酵母的编码木糖还原酶的基因XYL1、木糖醇脱氢酶的基因XYL2和异源表达来源于解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）木酮糖激酶的基因XKS1的质粒pMO_xyl1_xyl2_xks1，获得的工程菌命名SC_[0125]以酿酒酵母S288C为出发菌株，异源表达含来源于树干毕赤酵母的编码木糖还原酶的基因XYL1、木糖醇脱氢酶的基因XYL2、异源表达来源于解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）木酮糖激酶的基因XKS1和通过CloningandAssemblyKit基础版同源重组无缝克隆试剂盒及其说明书所述方法将xyl1_乙醇脱氢酶1基因表达调控元件PADH1调控表达的富马酸酶B基因fumB的片段xyl1_xyl2_xks1_fumB（序列如SEQIDNO.61所示）为全基因合成。pMO_2载体片段（序列如SEQIDNO.62所示）为全基因合成。pMO_xyl1_xyl2_xks1_fumB质粒是通过利用pEASY®_BasicSeamlessCloningandAssemblyKit基础版同源重组无缝克隆试剂盒及其说明书所述方法将xyl1_xyl2_xks1_fumB基因片段和pMO_2载片段连接获得。具体操作同上，获得质粒pMO_xyl1_xyl2_xks1_fumB。基因工程菌株SC_03和SC_04的构建都涉及了质粒转化。出发菌株于YPD液体培养将其置于30℃摇床复苏2h。最后用无菌水水洗一遍，吸取100μL混合液涂于含400mg/L2O42OBX_08和实施例5菌株BX_09分别比对比例1菌株BX_05木糖的消耗提高了90.4%和[0143]实施例6重组大肠杆菌BX_08和BX_09分别以玉米秸秆水解液为底物培养代谢木糖秸秆粉末，将玉米秸秆粉末加入到1%的NaOH溶液中，使溶液中玉米秸秆粉的固体量达到[0145]重组大肠杆菌BX_08和BX_09的方培养方法除用玉米秸秆水解液培养基I替代实施[0149]表2结果显示，在厌氧瓶中实施例6菌株BX_08消耗了7g/L的木糖，实施例6菌株BX_09厌氧消耗了7g/L的木糖，而对比例2菌株BX_05仅消耗3.6g/L的木糖。实施例6BX_08和实施例6菌株BX_09都比对比例2菌株BX_05木糖的消耗提高[0150]实施例7重组大肠杆菌BX_08和BX_09分别以玉米秸秆水解液为底物发酵罐培养玉米秸秆水解液培养基II：玉米秸秆水解液（含42g/L葡萄糖和21g/L木糖株BX_08和BX_09分别用于发酵菌体葡萄糖和木糖测定计算葡萄糖和木糖消耗，色谱柱采用Bio_RadAminexHPX_87H有机酸色株BX_08和实施例7菌株BX_09分别比对比例3菌株BX_05木糖的消耗提高了93.5%和96.Glutamicacid2.0g/L，Glycine2.0g/L，Histidine2.0g/L，Inositol2.0g/L，Isoleucine2.0g/L，Leucine4.0g/L，Lysine2.0g/L，Methionine2.0g/L，para_4