沉淀技术课件

沉澱技術生物分離過程的一般流程原料液細胞分離(離心，過濾)細胞－胞內產物路線一路線二細胞破碎碎片分離路線一A路線一B清液－胞外產物粗分離(沉澱/超過濾/萃取)純化(層析、離子交換、吸附)脫鹽(凝膠過濾、超濾)濃縮(超濾)精製(結晶、乾燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)複性沉澱：利用沉析劑使生化物質在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體沉澱的過程。沉澱法的目的：通過沉澱達到濃縮的目的；沉澱方法可有選擇地沉澱雜質或有選擇地沉澱所需成分，初步純化；將已純化的產品由液態變成固態，加以保存或進一步處理。沉澱法是最古老的分離和純化生物物質的方法，但目前仍廣泛應用在工業上和實驗室中。4.1概述沉澱法的原理：生物分子在水中形成穩定的溶液是有條件的，這些就是溶液的各種理化參數。任何能夠影響這些條件的因素都會破壞溶液的穩定性。沉澱法基本原理就是採用適當的措施改變溶液的理化參數，控制溶液的各種成分的溶解度，根據不同物質在溶劑中的溶解度不同而達到分離的目的，溶劑組分的改變或加入某些沉澱劑以及改變溶液的pH值、離子強度和極性都會使溶質的溶解度產生明顯的改變。

概述沉澱操作常在發酵液經過過濾和離心（除去不溶性雜質及細胞碎片）以後進行，得到的沉析物可直接乾燥制得成品或經進一步提純，如透析、超濾、層析或結晶制得高純度生化產品。操作方式可分連續法或間歇法兩種，規模較小時，常採用間歇法。不管哪一種方式操作步驟通常按三步進行：

概述沉澱法操作步驟：①首先加入沉澱劑，②沉澱劑的陳化，促進粒子生長；③離心或過濾，收集沉澱物。加沉澱劑的方式和陳化條件對產物的純度、收率和沉澱物的形狀都有很大影響。

概述為了簡化沉澱過程動力學，可把沉澱過程分成下述６個步驟：(1)初始混合(2)新相生成(3)布朗運動凝集(4)機械碰撞凝集(5)聚集體陳化(6)聚集體沉澱沉澱生成動力學沉澱法不僅用於實驗室中，因其不需專門設備，且易於放大，也廣泛用於生產的製備過程，是分離純化生物大分子，特別是製備蛋白質和酶時最常用的方法。優點：操作簡單、經濟、濃縮倍數高缺點：針對複雜體系而言，分離度不高、選擇性不強概述沉澱法的分類根據所加入的沉澱劑的不同，沉澱法可以分為：（1）鹽析法；（2）等電點沉澱法；（3）有機溶劑沉澱法；（4）非離子型聚合物沉澱法；（5）聚電解質沉澱法；（6）複合鹽沉澱法等（7）親和沉澱法（8）選擇性沉澱法。

蛋白質的溶解特性蛋白質是兩性高分子電解質，主要由疏水性各不相同的20種氨基酸組成。在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內部折疊的趨勢，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區。疏水性氨基酸含量高的蛋白質的疏水區大，疏水性強。親水性氨基酸殘基基本分佈在蛋白質立體結構的外表面。因此，蛋白質表面由不均勻分佈的荷電基團形成荷電區、親水區和疏水區構成。蛋白質分子表面的憎水區域和荷電區域蛋白質的溶解特性蛋白質的溶解行為由其組成、構象以及分子周圍溶液性質所決定。蛋白質在自然環境中通常是可溶的，所以其大部分是親水的，但其內部大部分是疏水的。一般而言，小分子蛋白質比起在化學上類似的大分子蛋白質更易溶解。防止蛋白質凝聚沉澱的屏障⑴蛋白質周圍的水化層，保護了蛋白質粒子，避免了相互碰撞，使蛋白質形成穩定的膠體溶液。⑵蛋白質兩性電解質，分子間靜電排斥作用。（存在雙電層）蛋白質粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主要是吸附溶液中的離子或自身基團的電離。蛋白質表面的電荷與溶液中反離子的電荷構成雙電層。4.２鹽析

鹽析概念：在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質（酶）等生物大分子物質在水溶液中的溶解度降低，產生沉澱的過程。鹽析是可逆的，而變性是不可逆的早在1859年，中性鹽鹽析法就被用於從血液中分離蛋白質，隨後又在尿蛋白、血漿蛋白等的分離和分級中使用，得到了比較滿意的結果。

鹽析法機理（1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子有很強的水化力，於是蛋白質分子周圍的水化膜層減弱乃至消失，使蛋白質分子因熱運動碰撞聚集。（2）破壞水化膜，暴露出憎水區域，由於憎水區域間作用使蛋白質聚集而沉澱，憎水區域越多，越易沉澱。（3）中和電荷，減少靜電斥力，中性鹽加入蛋白質溶液後，蛋白質表面電荷大量被中和，靜電斥力降低，導致蛋白溶解度降低，使蛋白質分子之間聚集而沉澱。鹽析過程

當中性鹽加入蛋白質分散體系時可能出現以下兩種情況：（1）“鹽溶”現象(salt-in)—低鹽濃度下，增加蛋白質分子間靜電斥力，蛋白質溶解度增大。（2）“鹽析”現象(salt-out)—高鹽濃度下，中和電荷、破壞水化膜，蛋白質溶解度隨之下降。鹽析作用要強鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽必須是惰性的來源豐富、經濟1）鹽析用鹽的選擇鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉硫酸銨是最常用的蛋白質鹽析沉澱劑（1）價廉；（2）溶解度大，溫度係數小，許多蛋白質可以鹽析出來；（3）硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，（4）不易引起蛋白質變性。

鹽析用鹽的選擇缺點：（1）水解變酸；（2）高pH釋氨，腐蝕；（3）殘留產品有影響。一般說來，離子強度越大，蛋白質的溶解度越低。在進行分離的時候，一般從低離子強度到高離子強度順次進行。每一組分被鹽析出來後，經過過濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質組分鹽析出來。組成相近的蛋白質，分子量越大，沉澱所需鹽的量越少；蛋白質分子不對稱性越大，也越易沉澱。2）鹽濃度對鹽析效果的影響㏒S=β-ＫsＩS—蛋白質的溶解度，g/L;I－離子強度，

I=1/2∑mizi2

mi—離子i的摩爾濃度；Zi—所帶電荷β—常數，圖中截距Ks—鹽析常數，圖中直線斜率Cohn經驗式

蛋白質溶解度與鹽濃度的關係β和Ks的物理意義β—β代表截距，即當離子強度為零，也就是純水中的假想溶解度的對數。與蛋白質種類、溫度、pH值有關，與鹽無關；Ks—鹽析常數，代表圖中直線的斜率；從一些實驗結果表明，Ks與溫度和pH無關，但和蛋白質與鹽的種類有關。但這種變化不是很大，例如以硫酸銨作為沉澱劑時，Ks值對不同的蛋白質來說，其變化不會超過1倍。用鹽析法分離蛋白質的二種方法鹽析法分為兩類，第一類叫Ks分段鹽析法，在一定pH和溫度下通過改變離子強度實現，（固定pH,溫度，改變鹽濃度），由於蛋白質對離子強度的變化非常敏感，易產生共沉澱現象，用於早期的粗提液；第二種叫β分段鹽析法，在一定離子強度下通過改變PH和溫度來實現，（固定離子強度，改變pH及溫度），由於溶質溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此解析度更高，用於後期進一步分離純化和結晶。鹽析用鹽量的確定-飽和度：飽和度（Saturation）的概念：以硫酸銨為例：250C時，硫酸銨的飽和溶解度是767g/L定義為100%飽和度目標蛋白質的鹽析沉澱操作之前，所需的硫酸銨濃度或飽和濃度可通過實驗確定。對多數蛋白質，當達到85%飽和度時，溶解度都小於0.lmg/L，通常為兼顧收率與純度，飽和度的操作範圍在40%-60%之間。原蛋白溶液體積為V，欲使其硫銨飽和度達到S，需加入飽和硫酸銨溶液的體積數？X=V×S/(1-S)

X：應加入的飽和硫銨溶液的體積

V：原蛋白質的溶液的體積

S：應達到的硫銨飽和度加固體硫銨的方法考慮到在鹽析時，如加飽和硫銨溶液會使溶液體積增大或使蛋白質濃度降低，因此加入固體硫銨比較適合，可用公式計算。在20℃時使1LM1摩爾濃度時（NH4）2SO4溶液增至M2摩爾濃度，所需加入（NH4）2SO4的克數C：

C=533（M2-M1）/(4.05-0.3M2)

C：需加硫銨的g數

M1：原溶液的濃度摩爾數

M2：需達到的濃度摩爾數以上數據都可在有關書上查到

在相同離子強度下，鹽的種類對蛋白質溶解度的影響有一定差異，一般的規律為：半徑小的高價離子的鹽析作用較強，半徑大的低價離子作用較弱陰離子鹽析效果：檸檬酸＞PO43-＞SO42-

＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-陽離子鹽析效果：NH4+＞K+＞Na+

＞高價陽離子陰離子的影響大於陽離子鹽析的影響因素：2）離子類型鹽析的影響因素：3）pH值一般來說，蛋白質所帶淨電荷越多溶解度越大，淨電荷越少溶解度越小，在等電點時蛋白質溶解度最小。為提高鹽析效率，多將溶液pH值調到目的蛋白的等電點處。注意在水中或稀鹽液中的蛋白質等電點與高鹽濃度下所測的結果是不同的，需根據實際情況調整溶液pH值，以達到最好的鹽析效果。

鹽析影響因素：4）溫度的影響在低離子強度或純水中，蛋白質溶解度在一定範圍內隨溫度增加而增加。但在高濃度下，蛋白質、酶和多肽類物質的溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下，蛋白質對鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下進行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進行。β隨溫度升高減小，熱促失水膜Ks不隨溫度而變硫酸銨的加入有以下幾種方法：1）加入固體鹽法用於要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；工業上常採用這種方法，加入速度不能太快，應分批加入。攪拌可加速溶解和膠體溶液的破壞，有利於蛋白質的沉澱，但強烈攪拌會產生泡沫。引起蛋白質表面變性或活力下降，並會使沉澱破碎，形成細小顆粒，沉澱不完全，增加過濾的困難。所以攪拌需適中。2）加入飽和溶液法用於要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況；它可防止局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。3）透析平衡法先將鹽析的樣品裝於透析袋中，然後浸入飽和硫酸銨中進行透析，袋內飽和度逐漸提高，達到設定濃度後，目的蛋白析出。該法優點在於硫酸銨濃度變化有連續性，鹽析效果好，但程式煩瑣，故多用於結晶。鹽析影響因素：5）加鹽方式鹽析的影響因素：6）蛋白質濃度

沉澱蛋白質鹽的濃度範圍並不是固定的，而是和起始濃度有關。高濃度蛋白溶液可以節約鹽的用量，若蛋白濃度過高，會發生嚴重共沉澱作用，除雜蛋白的效果會明顯下降。在低濃度蛋白質溶液中鹽析，所用的鹽量較多，共沉澱作用比較少，但回收率會降低。因此需要在兩者之間進行適當選擇。分步分離提純時，寧可選擇稀一些的蛋白質溶液，多加一點中性鹽，使共沉澱作用減至最低限度。一般認為2.5%-3.0%的蛋白質濃度比較適中。相當於25mg/mL～30mg/mL。鹽析法特點：成本低，不需要特別昂貴的設備。操作簡單、安全。不會引起蛋白質變性，經透析去鹽後，能得到保持生物活性的純化蛋白質。分離效果不理想，通常只是作為初步的分離純化，還需要結合其他的純化方法。

4.3有機溶劑沉澱法

概念：在含有溶質的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉澱析出。有機溶劑對於許多蛋白質（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質都能發生沉澱作用，是較早使用的沉澱方法之一。優點在於：1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質等只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉澱；2）沉澱不用脫鹽，過濾較為容易；缺點是:1）對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，2）操作要求在低溫下進行。3）成本高總體來說，蛋白質和酶的有機溶劑沉澱法不如鹽析法普遍。有機溶劑沉澱法有機溶劑沉澱法機理

A降低溶劑介電常數（介電常數D有機<D水）

，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質分子間的相互作用力，增加了酶、蛋白質、核酸等帶電粒子之間的作用力，因相互吸引而聚合沉澱。B破壞水化膜：由於使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解於水的同時從蛋白質分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞水化層，降低蛋白質分子的溶劑化能力，破壞蛋白質的水化層，使蛋白質沉澱。C相反力：疏水基團暴露並與有機溶劑疏水基團結合形成疏水層。有機溶劑沉澱法機理降低介電常數破壞水化膜

後來又提出了另外一種說法，認為有機溶劑沉澱法的機理是有機溶劑可能破壞蛋白質的某種鍵比如氫鍵，使其空間結構發生某種程度的變化，致使一些原來包在內部的疏水基團暴露於表面，並與有機溶劑的疏水基團結合形成疏水作用，從而使蛋白質沉澱。當蛋白質的空間結構發生變形超過一定程度時，便會導致完全的變性。常用的有機溶劑沉析劑選擇依據：水溶性要好，沉澱用溶劑一般需能與水無限混溶，一些與水部分混溶或微溶的溶劑如氯仿、乙醚等也有使用，但使用對象和方法不盡相同。沉澱作用要強，介電常數要小致變性作用要小毒性要小、揮發性適中。沸點過低雖有利於除去和回收，但揮發損失較大，且不安全。給勞動保護及安全生產帶來麻煩。容易獲取

沉澱蛋白質和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉澱核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉澱劑。乙醇：沉析作用強，揮發性適中，無毒，常用於蛋白質、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用大於乙醇，用量小。如代替乙醇可減少用量1/4-1/3，但沸點低、揮發大、著火點低、對肝臟有一定毒性。應用範圍不廣；甲醇：沉析作用與乙醇相當，對蛋白質的變性作用比乙醇和丙酮都小，但由於口服有強毒，限制了它的使用。溶劑濃度的計算

V=V0(S2-S1)/(100-S2)

V--需加入的有機溶劑的體積；

Vo--原溶液體積；

S1--原溶液中有機溶劑的濃度；

S2--需達到的有機溶劑的濃度；該公式與鹽析公式一樣未考慮混合後體積的變化，實際上等體積的乙醇和水相混後體積會縮小5％，如此的體積變化對大多數工作影響不大，在有精確要求的場合可按摩爾比計算，這樣可將體積變化因素抵消。（1）溫度低溫有利於防止溶質變性；有機溶劑與水混合時要產生相當數量的熱量，從而使體系的溫度升高，增加有機溶劑對蛋白質的變性作用。因此，在使用有機溶劑沉澱生物高分子時務必要控制在低溫下進行。另外低溫有利於提高收率（溫度越低，溶解度越小）。由於大多數蛋白質在乙醇-水混合溶液中的溶解度隨溫度下降而減少，低溫對提高收率也是有利的。有機溶劑沉澱法的影響因素用有機溶劑沉澱蛋白質時必須嚴格控制溫度。蛋白質在有機溶劑存在時，溶解度多隨溫度升高而增加，如果形成沉澱後溫度升高，沉澱可能重新溶解，如果溫度下降可能使沉澱增多(雜蛋白)。一般都要低溫操作。在有的情況下，把沉澱後清液的溫度降低可沉澱出另一種產品，這就是所謂溫差分級沉澱。A、預冷：為了達此目的，常將待分離的溶液和有機溶劑分別進行預冷。後者最好預冷至-10～-20℃，在具體操作時還應不斷攪拌。攪拌的作用一方面是為了散熱，一方面為了防止溶劑局部過濃引起的變性作用和解析度下降現象發生。為了以上目的，溶劑的加入速度也須控制，不宜太快。B、短時間的老化處理：為減少溶劑對蛋白的變性作用，通常使沉澱在低溫下作短時間的老化處理（0.5-2h）後即進行離心分離，接著真空抽去剩餘的溶劑，或將沉澱溶入大量的緩衝液中以稀釋溶劑，減少有機溶劑與目的產物的接觸。

控制溫度的具體做法：（2）pHpH對溶劑的沉澱效果影響很大，適宜的pH可使沉澱效果增強，提高產品的收率，同時還可提高解析度。許多蛋白質在等電點附近有較好的沉澱效果，但不是所有的蛋白質都是這樣，甚至有少數蛋白質在等電點附近不太穩定。在控制溶液pH時有一點要特別注意，即：務必使溶液中大多數蛋白質分子帶有相同電荷，而不要讓目的物與主要雜質分子帶相反電荷，以致出現較嚴重的共沉作用。（3）離子強度較低離子強度的存在往往有利於沉澱作用，甚至還有保護蛋白質，防止變性，減少水和溶劑相互溶解及穩定介質pH的作用。用溶劑沉澱蛋白質時離子強度以0.01-0.05mol/L為好，通常不應超過5%的含量。如離子強度過高則溶劑用量大，沉澱物還會夾帶許多的鹽。（4）樣品濃度與鹽析相似，樣品較稀時增加了溶劑投入量和損耗，降低了溶質收率，還易產生稀釋變性，但共沉作用小，分離效果較好。反之，濃的樣品會增強共沉作用，降低解析度，然而減少了溶劑用量，提高了回收率，變性的危險性也小於稀溶液。一般認為蛋白質的初濃度以0.5%～2%為好，粘多糖則以1%～2%較合適。

（5）金屬離子助沉作用在用溶劑沉澱生物高分子時還須注意到一些金屬離子如Zn2+，Ca2+等可與某些呈陰離子狀態的蛋白質形成複合物。這種複合物的溶解度大大降低而不影響生物活性，有利於沉澱形成，並降低溶劑耗量，0.005-0.02mol/L的Zn2+可使溶劑用量減少l/3至1/2，使用時要避免會與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子的存在(如磷酸根)。實際操作時往往先加溶媒沉澱除去雜蛋白，再加Zn2+沉澱目的物。4.4等電點沉澱法

等電點沉澱法在低的離子強度下，調pH至等電點，使蛋白質所帶淨電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水力能使分子間相互吸引，形成沉澱的操作稱為等電點沉澱不同的兩性電解質具有不同的等電點，以此為基礎可進行分離。生產胰島素時，在粗提液中先調pH8.0去除鹼性蛋白質，再調pH3.0去除酸性蛋白質。

pH=pI蛋白質的離子化情況既與蛋白質的詳細結構有關，也與溶液的pH值有關。一般來說，溶液的pH值高，蛋白質帶負電；pH值低，蛋白質帶正電。當溶液的pH值為某一值時，蛋白質幾乎不帶電，即淨電荷為零，或者說它帶相等的正電荷和負電荷，這時的pH值稱為等電點，常用pI表示。兩性電解質在溶液中pH處於等電點pI時，分子表面靜電荷為零，導致賴以穩定的雙電層及水化膜削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低並沉澱析出。①等電點沉澱法操作十分簡便，試劑消耗少，給體系引入的外來物(雜質)也少。是一種常用的分離純化方法，②收率低：但兩性溶質（蛋白質）在等電點附近（處）仍有一定的溶解度，(有時甚至比較大)，所以等電點沉澱往往不完全。即等電點沉澱法往往不能獲得高的回收率。等電點沉澱的特點：③解析度較低：許多分子的等電點比較接近，容易發生共沉澱，所以解析度較低。因此很少單獨使用等電點沉澱法作為主要純化手段，往往與鹽析，有機溶劑沉澱等方法結合使用，在實際應用種主要用於去雜蛋白。在蛋白質疏水性比較大和結合水比較小時的沉澱更有效。最大缺點：無機酸有引起較大的蛋白質不可逆變性的危險。

等電點沉澱注意事項(1)生物高分子的等電點易受鹽離子的影響發生變化。由於無機離子的影響，蛋白質的等電點通常會發生“漂移”，陽-高，陰-低。即：若蛋白質分子結合多量陽離子如：如Zn2+、Ca2+

、Mg2+等，會造成等電點升高；若蛋白質分子結合多量陰離子如：如Cl-、SO42-、HPO42-等，則等電點降低。自然界中許多蛋白質較易結合陰離子，使等電點向酸側移動。(2)在使用等電點沉澱時還應考慮目的物的穩定性。有些蛋白質或酶在等電點附近不穩定。如α-糜蛋白酶(pI=8.1～8.6)，胰蛋白酶(pI=10.1)，它們在中性或偏堿的環境中由於自身或其他蛋白水解酶的作用而部分降解失活。所以在實際操作中應避免溶液pH上升至5以上。(3)生物大分子在等電點附近鹽溶作用很明顯。所以無論是單獨使用或與溶劑沉澱法合用，都必須控制溶液的離子強度。某些大分子聚合物，具有沉澱蛋白質的作用。非離子多聚物是20世紀60年代發展起來的一類重要沉澱劑，最早應用於提純免疫球蛋白(IgG)和沉澱一些細菌與病毒，近年來逐漸廣泛應用於核酸和酶的分離純化。所用非離子多聚物包括各種不同分子量的：聚乙二醇(PEG)、壬苯乙烯化氧(NPEO)、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯。4.5非離子型聚合物沉澱法聚乙二醇結構式：HO-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OHPEG相對分子品質從200D到20KDa的不同聚合程度的產品都是有效的。通常在蛋白質沉澱中使用PEG-6000或PEG-4000。使用PEG沉澱分離蛋白質方法的優點①沉澱溫度只需控制在室溫條件下；②沉澱的顆粒往往比較大，產物比較容易收集；③PEG非但不會使蛋白質變性，而且可以提高它的穩定性。使用PEG沉澱分離蛋白質方法的缺點1、PEG比其他沉澱劑更難從蛋白質溶液中除去，為此需用超濾和液－液萃取來解決。2、價格較昂貴。所得的沉澱中含有大量沉澱劑。除去的方法有吸附法、乙醇沉澱法、鹽析法。將沉澱物溶於磷酸緩衝液，用35％硫酸銨沉澱蛋白質，PEG則留在上清中。用DEAE纖維素吸附目的物也常用，因為PEG不被吸附。用20%乙醇處理沉澱複合物，離心後也可將PEG除去(留在上清中)。用葡聚糖和聚乙二醇作為兩相系統分離單鏈DNA、雙鏈DNA和多種RNA製劑在20世紀60年代也有過報導。此法近10多年來發展很快，特別是用聚乙二醇沉澱分離質粒DNA，已相當普遍。沉澱中雜質的去除4.6成鹽類複合物沉澱此類沉析劑有以下三種：（1）高價金屬鹽：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+

與酸性基團結合；（2）苦味酸鹽、單寧酸鹽、鞣質等，與鹼性基團結合（3）無機複合鹽：磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等缺點：容易導致活性蛋白的不可逆變性，需採用較溫和的條件，有時還需加入一定的穩定劑。１）金屬離子沉澱金屬離子的沉澱作用是由於它們能與蛋白質分子中的特殊部位起反應造成的。例如鋅易與組氨酸殘基中咪唑基結合，從而降低蛋白質的溶解度。金屬離子在蛋白質分級沉澱上的應用可以追溯到1905年，真正的認識是後來從金屬離子與純血漿蛋白的特異相互作用的研究中得到的。Zn2+用於沉澱桿菌肽、尿激酶和胰島素。Ca2+（CaCO3）用於分離乳酸，血清蛋白和檸檬酸。硫酸鋇在檸檬酸生產中用以去除重金屬。MgSO4用以去除DNA和其他核酸。金屬離子沉澱蛋白質一般可分三類：①能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環化合物強烈結合的一些金屬離子，如：Mn2+、Fe2+、Ｃo2+、Ni2+、Ｃu2+、Zn2+、Cd2+;②能與羧酸結合而不與含氮化合物結合的一些金屬離子，如：Ca2+

、Ba2+、Mg2+、Pb2+;③能巰基化合物強烈結合的一些金屬離子，如：Ｈg2+、Ag2+、Pb2+。實際應用時，金屬離子的濃度常為0.02mol/L。複合物中金屬離子的去除，可用離子交換法或EDTA金屬螯合劑。例：

調pH4.2上清液胰島素粗品溶液

30%丙酮沉澱（雜蛋白）調pH6.0上清液Zn2+

胰島素鋅鹽↓2）有機酸複合鹽法含氮有機酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能夠與生物分子的鹼性功能團形成複合物而沉澱析出。但這些有機酸與蛋白質形成鹽複合物沉澱時，常常發生不可逆的沉澱反應。工業上應用此法製備蛋白質時，需採取較溫和的條件，有時還加入一定的穩定劑，以防止蛋白質變性。（1）丹寧酸（鞣酸）廣泛存在於植物界，其分子結構為5-雙沒食子酸醯基葡萄糖，為多元酚類化合物。分子上有羧基和多個羥基。由於蛋白質分子中有許多氨基、亞氨基和羧基等，這樣就在蛋白質分子與丹寧分子間形成為數眾多的氫鍵而結合在一起，從而生成巨大的複合顆粒沉澱下來。丹寧沉澱蛋白質的能力與蛋白質種類、環境pH及丹寧本身的來源(種類)和濃度有關。丹寧與蛋白質的結合相對比較牢固，用一般方法不易將它們分開。多採用競爭結合法。即選用比蛋白質更強的結合劑與丹寧結合，使蛋白質游離釋放出來。競爭性結合劑有乙烯氮戊環酮(PVP)、聚乙二醇、聚氧化乙烯及山梨糖醇甘油酸酯等。4.7親和沉澱

親和沉澱是分離過程的一部分，但是其沉澱原理與通常的沉澱方法有很大的不同。它是利用蛋白質與特定的生物合成分子（免疫配位體、基質、輔酶等）之間高度專一的相互作用而設計出來的一種特殊選擇性的分離技術。所以其沉澱原理不是依據蛋白質溶解度的差異，而是依據“吸附”有特殊蛋白質的聚合物的溶解度的大小。親和沉澱

親和過程提供了一個從複