化学蛋白质组学PPT

1、第五节化学蛋白质组学：随着人类基因组计划的成功实施，生命科学研究的重点逐渐转移到生物功能的整体研究上。蛋白质表达模式和功能模式作为生物功能的主要体现或执行者，其研究必将成为生命科学的发展趋势。20世纪90年代中期，一门研究细胞中各种蛋白质组成和活性规律的新学科蛋白质组学在世界范围内兴起。蛋白质组的概念是由澳大利亚学者在1995年首次提出的。它起源于蛋白质和基因组的杂交，是指在特定的时间和空间内由基因组、细胞组织或生物体表达的所有蛋白质。蛋白质组学的研究被称为蛋白质组学，它主要从整体水平研究细胞内蛋白质的组成和活性。在这里，化学再次与生物学的最新发展相结合，形成了一个新的跨学科研究领域化学蛋白质

2、组学。化学蛋白质组学是一个崭新的领域，还在不断拓展，学术界对它还没有一个明确的定义。在某种程度上，化学蛋白质组学可以理解为“化学加蛋白质组学”。具体而言，由于大多数蛋白质的功能直接取决于小分子配体和靶蛋白质之间的结合步骤，因此通过干扰和检测具有小化学分子的蛋白质组，可以揭示感兴趣的特定蛋白质的功能及其与小化学分子的相互作用，所述小化学分子可以在蛋白质组的总体水平上与靶蛋白质特异性地相互作用。它不同于以往主要基于蛋白质定性和定量鉴定的蛋白质组学技术，因此被认为是有前途的新一代基于功能的蛋白质组学技术。第一，化学蛋白质组学的研究方法，蛋白质组学研究系统中的蛋白质作为一个整体，有三种常见的研究模式：

3、第一种是“完全蛋白质组学”来检测蛋白质组学的理化参数；二是差异蛋白质组学，主要通过比较和分析不同状态下的蛋白质表达图谱，实现对系统中代谢调控的动态监测，从而更容易揭示人体对内外环境变化反应的本质规律；第三是蛋白质功能模型的研究，包括蛋白质功能和蛋白质相互作用。化学蛋白质组学的主要任务是开发和应用生物活性靶向探针，用于复杂蛋白质组学中特定酶或蛋白质家族的功能研究。小分子和细胞内靶蛋白之间的相互作用是许多蛋白质生物功能的基础。这种相互作用有不同的强度，可以是可逆的，也可以是不可逆的；它可以是单个靶或同时作用于多个靶蛋白。生物体(细胞组织等)所有蛋白质的蛋白质组图谱。)化学小分子处理前后的蛋白质组可

4、用于研究这种相互作用。对于化学来说，通过功能蛋白质组学的研究，如寻找先导药物和药物的靶分子，为人类健康服务，促进分子医学的发展，是一个重要的目标。(1)蛋白质组学的基本技术过程目前，蛋白质组学研究通常有三个步骤：首先，用双向电泳从样品中分离蛋白质；其次，利用质谱技术对双向电泳分离的蛋白质进行鉴定；第三，应用生物信息学技术存储、处理和比较获得的数据。1975年，奥法雷尔和克洛泽在两个实验室首次建立了二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(双向电泳)，其基本原理是分离不同等电点和不同分子量的不同蛋白质。他们将高分辨率等电聚焦(IEF)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)结合起来

5、形成二维电泳。第一个方向是IEF，它利用经典的两性电解质载体在电流的作用下形成一个酸碱度梯度，并根据不同的进行分离；在第二个方向，根据分子量，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。将基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱与基于多肽质量/电荷比的数据库数据进行比较，然后鉴定蛋白质。这种方法通常被称为肽质量指纹法。3.色谱和质谱的结合可以有效克服二维凝胶电泳/质谱的缺点，保证分析的准确性。首先将蛋白质混合物用酶消化，得到混合肽段，然后用强离子交换反相色谱柱多次分离，肽段用液相色谱-串联质谱进行分析，通过放射性核素标记肽段实现蛋白质的定量分析。分离后，产物离子被

6、完美地扫描，肽片段可以一起分析以将待检测的蛋白质与其它类似物区分开来。信息查询和生物信息学是生物学、计算机和应用数学相结合形成的一门新学科。通过对生物实验数据的采集、处理、存储、检索和分析，可以达到解释数据生物学意义的目的。蛋白质组学研究由任何物种的基因组编码的一整套蛋白质，通常是高通量的。生物信息学已经成为蛋白质组学研究中蛋白质功能预测和结构分析的核心技术之一。常用几种软件进行分析。肽是一个基于肽质量指纹数据的蛋白质鉴定查询软件。它是用我们选择的酶“理论上消化”数据库中的所有蛋白质以形成肽片段，计算理论肽片段质量，建立索引，然后与输入的实验数据进行比较，并根据实验数据的匹配数排列和输出匹配结

7、果。蛋白质的等电点、分子量和种类可以详细限制候选蛋白质，减少假阳性误差。特别是考虑到多肽在数据库中的分布频率，微软Fit和Mascot软件都采用了MOWSE评分法。吉祥物软件还将MOWSE分数转换为绝对概率，以减少结果的不确定性。蛋白质组学相关网站，http:/www . proteing eworks . bio-proteing research technology and information等。从新药开发的角度来看，新的蛋白和新的功能被发现了。可以找到蛋白质组学研究的相关企业、各种仪器来源、新闻等等。http:/www

8、.micromass.co.uk teome.co.uk的蛋白质组研究介绍了先进的蛋白质鉴定仪器。瑞士生物信息学研究所.au蛋白质鉴定专家系统，澳大利亚蛋白质分析设施http:/加拿大生物信息资源中心蛋白质鉴定专家系统，第二，功能蛋白质组学技术，主要研究蛋白质功能、蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质-小分子相互作用，其方法主要包括蛋白质阵列、噬菌体展示、cDNA微阵列、酵母双杂交技术等。通过筛选小分子配体来描述新蛋白质的功能是化学蛋白质组学的主要研究内容，化学蛋白质组学筛选也将为新药开发提供先导化合物。共价结合靶蛋白并促进

9、纯化和鉴定的化学探针无疑是该领域最重要的工具。化学探针可用于评估不同水平的纯化蛋白、细胞裂解物、活细胞和活动物的药物作用强度和选择性。一方面，它可以识别与不同疾病相关的新药靶点；另一方面，它可以用于药物先导化合物的快速鉴定，从而加快候选化合物的临床应用。其中，活性探针是一种新的化学蛋白质组学研究技术。基于活性的探针，ABPs，该技术的原理是合成具有反应基团和标记基团的ABPs试剂，以与待研究的蛋白质组相互作用(ABPs中的反应基团可以特异性共价修饰蛋白质组中的某些种类的酶蛋白，以将小化学分子“钩”到感兴趣的靶酶上， 然后这些靶酶可以通过使用荧光或生物素标记基团逐个地被“捞出”(ABPs) AB

10、Ps是为待研究的靶酶的活性而设计的小化学分子，因此它可以直接检测蛋白质组中感兴趣的靶酶的活性。 ABP的分子量通常为700-1000 D，主要由报道基团(荧光基团或生物素)引起。这些报道基团也可能改变体内活性分子的性质及其与靶蛋白的相互作用模式，从而限制ABP分子在体内细胞中的吸收和分布。ABPP实验通常在体外进行，例如细胞或组织匀浆，这可能改变细胞或组织中活性或非活性酶的浓度及其亚细胞分布。因此，体外功能蛋白质组学研究只能粗略地揭示蛋白质在活细胞或动物组织中的功能状态。1.不可逆探针就其主要的基本结构而言，不可逆化学探针具有三个特定的功能位点：与酶共价交联的反应性基团、调节反应性基团反应特异

11、性的连接区域和便于识别和纯化目标酶的标记。(1)活性基团为靶蛋白提供了必要的共价修饰，其选择性是化学探针设计过程中最大的挑战。困难在于功能基团的双重性，一方面它们具有特定蛋白质中氨基酸残基的反应性，另一方面它们不识别细胞或细胞提取物的其它活性片段。(2)连接区域通常使用长链烷烃或聚乙二醇作为化学探针的连接区域，连接反应基团和标记。它主要是在反应基团和标记物之间提供足够的空间，防止空间屏障的形成，便于反应基团和酶的结合和偶联物的纯化。烷基链可以调节探针的疏水性，使其易于进入活细胞和组织；聚乙二醇链可以提高疏水探针的溶解度，并促进其进入水溶液。(3)通常选择生物素、荧光物质和放射性物质作为化学探针

12、的标记，可以快速鉴定和纯化探针修饰的蛋白质。蛋白质凝胶电泳是最简单和最有效的蛋白质分离方法，因此用于标记探针的物质应与SDS-PAGE相容。目前，该方法已成功用于丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、脱蛋白酶等目标酶的功能蛋白质组学研究。并且已经发现了一些具有在体内起作用的小化学分子的新的疾病相关靶标。2、可逆探针。由于不可逆探针的设计受到缺乏蛋白质(酶)活性中心结构信息和酶上小分子化合物抑制位点信息的限制，人们希望直接使用可逆抑制剂作为化学探针。该方法有望扩展到所有靶蛋白的功能蛋白质组学研究，并可用于新药筛选。3、未标记的探针，ABPP实验已经在细胞或组织匀浆中进行，其中一个主要原因是报告基团非常大(分

13、子量通常为700-10o0Da)，这限制了探针分子的吸收和分布，甚至可能改变探针分子的作用方式。近年来，点击化学被引入到ABPP实验中，并且开发了没有标签的探针分子。报道基团(荧光素或生物素)在共价标记靶蛋白后，通过惠生1，3-偶极环加成反应(炔基与叠氮基反应形成稳定的三唑结构)与探针分子相连。夏普勒斯等人发现，在铜()的催化下，三唑可以在温和的条件下由炔基和叠氮基高产率地得到，这使得点击化学有效地应用于功能蛋白质组学的研究。未标记探针分子的设计需要应用光亲和标记技术和引入光亲和标记基团，其功能是在探针分子和靶蛋白结合(可逆)后通过光解在探针分子和靶蛋白之间引入共价键。通常，这种探针分子包括活

14、性单元、光亲和标记基团、连接位点和报道基团。光亲和标记探针分子的光亲和基团是苯基叠氮基、三氟甲基苯基二嗪、二苯甲酮等。一般来说，理想的光亲合基团应具有以下特征： (1)它具有一定的化学稳定性，并能耐受常见的化学反应；(2)自然光下的合理稳定性；(3)在黑暗中稳定，在紫外光(300 nm)下容易光解，不会对生物样品造成损害；(4)光解后的活性中间体既能与亲核的X-H(X=N，S，O)官能团反应，也能与C-H官能团反应。通过与受体相互作用的光解中间体获得的产物应该是稳定的，并且能够经受分离、纯化和分析的操作。目前，光亲和标记ABPP (CC-ABPP)的实验仅限于共价探针分子的设计和研究。然而，在

15、许多情况下，我们可以得到活性小分子和蛋白质之间的非共价相互作用。此时，我们希望将点击化学引入到光亲和标记技术中，设计用于蛋白质组学研究的非共价探针分子，这将成为蛋白质组学研究的更强有力的工具，在促进药物发现方面发挥更大的作用。化学探针可用于药效学研究。通过分析候选药物和化学探针之间的简单竞争组合，可以识别复杂蛋白质组中的药物靶标。同时，更接近生理条件的天然酶可以用来验证候选药物的功效。此外，相关的组织样本可用于分析候选药物抑制特定靶标的能力。化学探针可用于评估不同水平的纯化蛋白、细胞裂解物、活细胞和活动物的药物作用强度和选择性。化学蛋白质组学是一个跨学科的领域，它极大地提高了我们对生物学和药物开发的理解。共价结合靶蛋白并促进纯化和鉴定的化学探针无疑是该领域最重要的工具。一方面，它可以识别与不同疾病相关的新药靶点；另一方面，它可以用于药物先导化合物的快速鉴定，从而加快候选化合物的临床应用。利用基于目标酶活性的活性探针(ABPs)检测功能蛋白质组。该技术的原理是，合成的同时具有反应基团和标记基团的AB