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文档简介

1、,限制酶切方式及连接,1限制酶切的方式,1.1单酶切1.2双酶切1.3部分酶切1.4完全酶切,1限制酶切的方式,1.1单酶切若DNA样品是环状DNA分子，产生与识别序列（n）相同的DNA片段数。若DNA样品是LDNA片段，完全酶切产生n+1个DNA片段。,1限制酶切的方式,1.1单酶切酶切体系：13LddH2O反应体系2L10buffer4L底物DNA1L限制酶总体积：20L,酶切步骤：加样；摇匀，短时离心；反应13h；反应终止。65水浴1015min,1限制酶切的方式,1.2双酶切用不同的限制酶切割同一DNA分子的方法。环状DNA分子完全酶切的结果，产生DNA片段数是两种限制酶识别序列数之和

2、。线性DNA分子完全酶切的结果，产生DNA片段数是两种限制酶识别序列数加1.,双酶切可以在不同的反应系统中进行。A需要较低盐浓度的酶先切割，然后升高盐浓度，另一个酶切割；B最适反应温度较低的酶先切割，然后升高温度，另一个酶切割；C第一个酶切割后，经凝胶电泳回收DNA，再选用合适反应系统，进行第二个酶的切割。,D双酶切在同一个反应系统中。,1限制酶切的方式,1.3部分酶切指限制酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。用途：当某种限制酶的多个识别序列之中有一个识别序列恰好在回收待用的DNA片段上，若完全酶切，将此DNA片段从中切断。为了解决这个问题，就需要用到部分酶切，以满足实验的需要

3、。,2限制酶切后的连接,2.1DNAligase:能催化dsDNA片段紧靠在一起的3羟基末端与5磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。,2.2DNA片段之间的连接具互补黏性末端之间的连接具平末端之间的连接,具互补黏性末端片段之间的连接,5GGACTG-0HP-AATTCTGCAA-33CCTGACTTAA-P0H-GACGTT-5E.coRI切割E.coRI切割DNAligase5GGACTGAATTCTGCAA-33CCTGACTTAAGACGTT-5E.coRI识别序列,结论：待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一个酶切割的，连接后仍保留原限制酶的识别序列。,BamH切割反应,T4DNAligase,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点的连接,EcoR切割位点,Bgl切割位点,具平末端DNA片段之间的连接,5CAAGCTCA35GTAGCTTA33GTTCGAGT53CATCGAAT5AluIAluIP-CTCA-35CAAG-OHP-CTTA35GTAG-OHOH-GAGT53GTTC-POH-GAAT-53CATC-PT4DNAligase5CAAGCTTA-33GTTCGAAT-5AluIAGCTHindAAGCTT,结论：如果两个DNA片段的末端是用同一种酶切割后产生的，连

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