试验二质粒DNA电泳鉴定

1、实验2质粒DNA电泳鉴定，生物技术制药实验，生物技术实验室，武汉大学药学院实验教学中心，讲师：刘咏梅刘永平，实验目的，掌握琼脂糖凝胶电泳用于DNA分离的原理；学习琼脂糖凝胶电泳的操作方法、实验原理和背景知识。电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。例如，DNA制备、浓度测定、目标DNA片段的分离、酶消化和重组体的鉴定需要电泳。根据分离的DNA的大小和类型不同，DNA电泳主要分为两类：聚丙烯酰胺凝胶电泳适用于分离1kb以下的片段，最高分辨率为1bp，也可用于分离寡核苷酸。在引物的纯化中，这种凝胶通常用于纯化，也称为聚丙烯酰胺凝胶纯化。琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小随凝胶浓度而变化，凝胶浓度

2、为0.50.6%的凝胶可分离的DNA片段范围为20bp50kb。溴化乙锭染色后，电泳结果可直接在紫外下观察，观察到的DNA条带浓度为毫微克，整个过程可在1小时内完成。由于其简单和快速，这种方法通常用于基因工程。琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，分辨率越强。分离原理，DNA分子在碱性环境中带负电荷，并在外部电场的作用下迁移到正极。当DNA分子在琼脂糖凝胶中迁移时，它们具有电荷效应和分子筛效应。不同的DNA，具有不同的分子量和构型，在电泳过程中将具有不同的迁移率，从而分离不同的区域。琼脂糖凝胶电泳法是利用分子筛效应。迁移速度与分子量的对数成反比，分子量的对数可以根据D

3、NA分子的大小来区分。核酸分子在高于等电点的酸碱度溶液中带负电，并在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。电泳原理，影响DNA电泳的因素(一)，DNA分子的大小越大，凝胶中的摩擦阻力越大，迁移越慢，并且迁移率与线性DNA分子质量的对数成反比。由于电泳过程中的不同阻力，不同构型的DNA分子导致不同的泳动速率。在常规电泳中，质粒DNA分子的迁移速率有三种构型：超螺旋最快，线性分子次之，开环分子最慢。同一分子的凝胶浓度越高，电泳速度越慢。浓度较低的凝胶具有较宽的线性范围，而浓度较高的凝胶与小分子DNA片段具有较好的线性关系。因此，在常规实验中，高浓度凝

4、胶用于分离小的DNA分子(有时甚至使用2个凝胶)，而低浓度凝胶用于分离大的DNA分子。影响DNA电泳的因素(2)，电场强度一般在5V/cm左右。分辨率不高。当精确测量DNA分子的大小时，电压应该降低到1V/cm。电场强度越高，分离的线性范围越窄，这也会产生大量的热量并导致DNA片段的降解。选择合适的电压，例如，可以在较低的电压下进行大片段DNA的分离(南方杂交中的DNA电泳)，以避免夹尾现象的发生；对于小分子DNA，由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊，可以选择相对高的电压来缩短电泳时间。溴化乙锭EB具有水平结构，可嵌入DNA碱基对之间，对线性分子和开环分子影响不大，但对超螺旋分子影响很大。

5、当嵌入DNA分子中的EB分子数量逐渐增加时，处于负超螺旋状态的分子开始转变为共价闭合环，电泳迁移开始DNA电泳的影响因素(3)、琼脂糖凝胶电泳中常用的缓冲液、三硼酸(TBE)、三乙酸(TAE)、三磷酸(TPE)、电泳指示剂溴酚蓝在碱性液体中呈紫蓝色，通常与蔗糖、甘油或聚蔗糖400形成加载缓冲液。功能：增加样品的比重，以确保DNA均匀地沉入样品添加孔。形成肉眼指示带是为了预测核酸电泳的速度和位置。使样品颜色，并使样品添加操作更加方便。溴化乙锭是一种荧光染料。EB分子可以嵌入核酸双链的碱基对之间，并在紫外线的激发下发出红色荧光。荧光强度与DNA含量成正比。因此，可以粗略估计样品的DNA浓度。爱泼斯

6、坦-巴尔染色显示，核酸电泳带肉眼可见，DNA量一般为5ng。核酸染色，注意：EB是一种致癌物质，不要用手触摸，更不要污染环境。实验材料和设备、用于提取大肠杆菌质粒DNA的电泳仪、水平凝胶电泳槽、梳子及其凝胶制作模块、电子天平、凝胶成像系统、移液管、枪头、三角瓶、样品板、琼脂糖如微波炉、TAE电泳缓冲液、装载缓冲液、EB储存液、电泳级琼脂糖粉末、DNA分子量标准、微波炉溶胶、实验仪器、凝胶电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、实验制备、TAE电泳缓冲液的制备(50储存液、 pH8.5:242克三碱，57.1毫升冰醋酸，37.2克乙二胺四乙酸二钠，将水加入1L) 1000溴化乙锭储存溶液(0.5毫克/毫升

7、：50毫克溴化乙锭溶于100毫升乙二胺四乙酸二钠)10样品缓冲液(20%菲科尔400，0.1摩尔/升乙二胺四乙酸二钠pH8.0，1.0%十二烷基硫酸钠，0.25%溴酚蓝)； 1.5毫升离心管和移液管尖端经过灭菌。(1)称取0.5g琼脂糖粉末，放入三角瓶中，加入50毫升TAE电泳缓冲液(1)，在微波下煮沸1分钟。用50毫升准备了两片胶水。(注意烧瓶中的琼脂糖粉末，待其完全熔化后，停止微波炉。)(2)平衡凝胶罐，将挡板放在两侧，调整梳齿和底板之间的距离(一般比底板高0.51毫米)。(3)铺贴：向溶解的凝胶中加入最终浓度为0.5微克/毫升的溴化乙锭水溶液，轻轻混合，冷却至50左右后倒入凝胶罐中，凝胶

8、厚度一般为58毫米。静置10-20分钟。(4)待凝胶完全凝固后，取下两侧挡板，将凝胶放入装有电泳液的槽中(加样孔朝向负极，DNA从负极向正极移动)，使液面高出凝胶23毫米，小心地拔出梳子。实验步骤(2)点样，(5)切一张光滑的纸(或密封膜)并将DNA样品与6个样品混合，加入缓冲液51。如果样品浓度高，可以用蒸馏水稀释。例如3l蒸馏水、1l 10样品添加缓冲液和2l质粒DNA溶液，以制备6l DNA样品。(6)将3-5 l的混合样品加入凝胶的凹孔中，同时加入1.5-3 L的DNA分子量标准。添加样品时，握住移液器的手用肘固定在桌子上，另一只手握住这只手的手腕，以减少移液器的晃动。看到蓝色样品吸管的尖端伸入样品添加孔后(不要伸得太深，以免穿透凝胶底部)，慢慢将蓝色样品压入样品添加孔。不要让蓝色样品流出孔。实验步骤(3)电泳分离和结果观察(7)根据电泳槽的长度将电泳仪的电压调至170伏(10伏/厘米)，注意正负极的正确连接。(8)打开电源开关，样品将形成蓝色水平带并向前移动。电泳大约需要30分钟。(9)根据染料移动的位置确定电泳是否终止。当蓝色溴酚蓝迁移到离凝胶边缘1厘米处时，关闭电源。(10)将凝胶置于紫外线灯下观察并拍照，时间不宜过长。DNA电泳图谱，常用DNA分子量标准，样品电泳结果，前处理2拔出梳子前，胶水必须