免疫细胞分离与功能检测.ppt

1、目的要求,掌握：Ficoll-hypaque分层液分离PBMC的原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、方法及应用，T细胞增殖试验的方法，B细胞的数量及功能的检测； 熟悉：T细胞功能的体内试验，T细胞介导的细胞毒检测的方法； 了解：淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。,第一节 免疫细胞的分离,3,免疫细胞的分离及检测,检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定 方法：体外法为主 目的：判断机体免疫状态 意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效,免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来,免疫细胞种类,免疫细胞的分离流程,PBMC包括：淋巴细

2、胞、单核细胞 各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进行分离 常用分层液：ficollhypaque，percoll,一、 外周血单个核细胞的分离和纯化,外周血各细胞成分的密度,Ficoll分离液法是一种单次差速密度梯度离心的分离法，主要用于分离外周血中的单个核细胞。 Ficoll分层液：密度1.0770.001 离心：密度梯度离心 分离：各类细胞按其相应密度重新分布,一、Ficoll分离法,Ficoll分层液分离单个核细胞示意图,二、淋巴细胞的分离 纯淋巴细胞群的采集 原理：利用单核细胞在37和Ca离子存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单个核

3、细胞中除去单核细胞的方法，以获得高纯度的淋巴细胞群。,(一)粘附贴壁法 因B细胞也有贴壁现象，因此，本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。 (二)吸附柱过滤法 将单核 细胞吸附于玻璃柱中，洗脱下来的主要是淋巴细胞,(三)磁铁吸引法 利用单核细胞具有吞噬的特性，在悬液中加入羰基铁颗粒，待单核细胞吞噬铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞群。,（四）Percoll分离法,返回章目录,三、T、B细胞和T细胞亚群的分离,免疫磁珠分离法 流式细胞术分离法 其他方法,（一）免疫磁珠分离法,488 nm 激光,-,前向散射光 检测器,荧光检测器,电磁场,单个细胞被分类 进入检测管,流式细胞

4、术分离原理示意图,第二节 淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类,一、T细胞表面标志及亚群,CD4+T CD8+T,CD3+CD4+CD8-,CD3+CD4-CD8+,主要为Th（help T cell）辅助性T细胞,主要为Tc（cytotoxic T cell）细胞毒性T细胞,二、B细胞表面标志及亚群亚群,NK细胞典型标志：CD56和CD16,三、 NK细胞表面标志,第三节 抗原提呈细胞表面标志,抗原提呈细胞（APC）： 是指能摄取、加工、处理抗原，并将抗原信息提呈给抗原特异性淋巴细胞的一类免疫细胞。,单核-巨噬细胞,树突状细胞,（1）分泌TNF-、NO、反应氧中间产物及蛋白水解酶等 （2）ADC

5、C效应 （3）激活T细胞产生细胞因子等活化巨噬细胞协同杀伤肿瘤细胞。,（一）单核吞噬细胞（CD14）,1.吞噬和杀伤作用 2.杀伤肿瘤细胞,形态呈树突样 具有一些相对特征性表面标志 抗原提呈能力强能激活初始T细胞 免疫应答的始动者,二、树突状细胞 （dendritic cells，DC）,特征：,1.起源于造血干细胞 由髓样干细胞（多数）、淋巴干细胞分化。 2.表面标志丰富 如：MHC类分子及类分子、B7-1和B7-2、CD40、CD1以及粘附分子等。 3.分泌多种细胞因子 IL-1、IL-6、IL-12、TNF-、IFN-等。,DC主要标志：CD1a、CD11c、CD83,第四节 T细胞功能

6、检测,一、T细胞功能检测,形态学检查法 3H-TdR掺入法 MTT比色法,淋巴细胞转化的检测方法,形态学检查法,未转化和转化淋巴细胞的形态特征,原理：,刺激物,3756h,G1期 S1期,合成DNA,3H-TdR,3716h,DNA- 3H-TdR,测淋巴细胞内放射量（cpm）,计算SI,判断淋巴细胞转化程度,外周血（T）G0期,3H-TdR掺入法,评价：该方法敏感性高、客观性强、重复性好、可自动操作；设备昂贵、放射污染。,刺激指数（stimulating index，SI ） SI=试验管cpm均值/对照管cpm均值,3H-TdR掺入法,3H-TdR摻入法,原理:用刺激剂体外激活淋巴细胞，用

7、蛋白转运抑制如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞外，细胞内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因子向高尔基体积聚，用流式细胞仪便可测出淋巴细胞内的细胞因子种类，从而确定TH1/ TH2细胞的百分率。,淋巴细胞内细胞因子检测,（二）T细胞分泌功能检定,Thl和Th2分泌的细胞因子,原理:,靶细胞抗原,T细胞,观察杀伤活力,致敏CTL,靶细胞,（三）T细胞介导的细胞毒试验,试验方法: 同位素法 淋巴细胞（CTL）+含51Cr 的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏 51Cr 释放 测定射线,51Cr特异释放率=,100%,（三）T细胞介导的细胞毒试验,（三）T细胞介导的细胞毒试验,背景无效应细胞,效应细胞/靶细胞 1:1

8、,效应细胞/靶细胞 5:1,效应细胞/靶细胞 20:1,细胞溶解,特异性抗原皮肤试验 PHA皮肤试验,（四）体内试验,溶血空斑试验 酶联免疫斑点试验 体内试验,二、B细胞功能检测,（一）溶血空斑试验,溶血斑,补体,抗血清包被 绵羊红细胞,（二）酶联免疫斑点法,抗体产生 B细胞,抗原包被,酶联抗抗体,凝胶底物 显色,刺激体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌等。 将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功能。,（三）体内试验,染色计数,离心取上清 测LDH或AKP,测发

9、光强度,测CPM值,形态法 酶释法 放射性核素释放法 流式细胞术,靶细胞溶解,常用靶细胞: K562细胞株,三、NK细胞活性检测,返回章目录,大吞噬细胞:即单核-吞噬细胞系统 小吞噬细胞:即中性粒细胞,第五节 其他免疫细胞功能检测技术,吞噬细胞的种类,特征性标志 CD14 分离技术 Pecoll密度梯度分离法 流式细胞仪分离技术 免疫磁珠分离法：为目前较常用的方法 黏附法,一、吞噬细胞的分离,（一）单核细胞的分离,斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取,（二）巨噬细胞的分离,聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞,RBC,血浆,(抗凝血),WBC,RBC,Ficol

10、l分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞,（三）中性粒细胞的分离,Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞,吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。 （一）中性粒细胞功能检测技术 （二）巨噬细胞功能检测技术,二、相关功能检测,细胞趋化功能的检测 吞噬功能的检测 杀菌功能的检测,（一）中性粒细胞功能检测,体内试验法：皮肤窗法 体外试验法：滤膜渗透法 琼脂糖平板法,趋化功能检测检测细胞运动功能,皮肤窗法 在受检者前臂屈侧中央3范围内，搔刮皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2，5，8，12，24，36小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集开始

11、时间、聚集程度等。健康正常人一般23h后开始聚集，达50100个，6小时可达1000个以上。,原理及技术要点 在一特制的分上下两层的小盒，将趋化因子加入下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分隔，37温育数小时后，上室的中性粒细胞受下室趋化因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取滤膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍镜下观察细胞穿越滤膜的移动距离，从而判断其趋化功能。,滤膜渗透法,原理及技术要点 在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液，左孔加趋化因子，右孔加对照液，温育48小时后，用显微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离A和向右孔的移动距离B，计算趋化指数。,趋化指数= A/B 趋化指数越大，表明中性粒细胞运动功能越强,琼脂糖平板