基因工程概论

1、,基因工程 细胞工程 发酵工程 酶 工 程 蛋白质工程,生物工程,武汉生物工程学院学科基础课,Principles of Genetic Engineering 基 因 工 程 原 理,武汉生物工程学院 阮景军,教学目的与要求,基因工程学自20世纪70年代初期诞生以来，在短短的30多年间已经取得了许多令世人瞩目的成就，成为当代生命科学研究领域中最具生命力、最引人关注的前沿学科之一，是现代分子生物学与生物技术的核心内容。 本课程充分考虑到我院生物口研究生的来源及其知识结构的特点，着重加强有关基因工程原理部分的讲授，并努力将基因工程学同分子生物学、分子遗传学以及生物化学等基础学科有机地联系起来进行

2、讨论。在内容安排上，强调基础性、先进性、系统性和实用性，同时也努力反映国内外有关学者的最新研究成果。,教学目的与要求,本课程为分子生物学、分子遗传学、发育生物学、细胞生物学、生物化学等有关专业研究生的学科基础课，同时也是植物学、动物学以及微生物学等专业研究生的重点选修课。我们期望不同专业的研究生在修完本课程之后，能够较为系统、全面地掌握基因工程的基础知识和最新进展，并能跟上该专业学科的发展进程。,教学目的与要求,学时/学分：60/3 上课方式：讲解为主，讨论为辅 考试时间：待定 考试方式：课堂开卷 勤于思考，勇于发言 Participate and Enjoy it!,教材与参考书,GENE

3、VII或VIII 分子克隆实验指南(第三版) 吴乃虎，基因工程原理(第二版，上册)，科学出版社，1998 吴乃虎，基因工程原理(第二版，下册)，科学出版社，2001 楼士林等，基因工程(第一版)，科学出版社，2002 吴乃虎、张方、黄美娟，基因工程术语，科学出版社，2005,本课程的地位：,现代科技革命,高新技术,生物技术,基因工程,基因克隆,基因工程原理纲要,第一讲 基因工程概论 第二讲 基因工程的主要技术 第三讲 基因工程的酶学基础 第四讲 基因克隆的载体与受体 第五讲 目的基因的分离与克隆 第六讲 克隆基因的检测与鉴定 第七讲 基因表达调节与产物纯化 第八讲 从原核到真核基因工程,第一讲

4、 基因工程概论,1、现代生物技术重塑自然生命 2、基因研究的发展 3、基因的现代概念 4、基因工程的诞生与发展 5、基因工程的应用 6、基因工程的安全性,现代生物技术,从传统的生物技术 到现代生物技术,基 因 工 程,细 胞 工 程,现代生物技术的人文忧患,基因工程发展的过程,基因工程的本质特征,基因工程在农业医药卫生领域的应用,细胞工程的主要内容,克隆技术,现代生物技术会打破生物物种间的平衡吗？,对转基因食物的担忧,我们是否要接纳克隆人？,1、现代生物技术重塑自然生命,生物技术发展历程,第一代生物工程技术(19世纪20世纪30年代) 很早人们就掌握了酿酒、制造酱油、奶酪、醋、面包等发酵技术，

5、其实这些都是生物工程产品。 直至十九世纪，微生物的发现证明了从粮食到酒精是由活的酵母菌引起，其他发酵产物也是由不同的微生物作用而形成，随后科学家又发现了发酵过程中的高效催化剂酶，从此揭开了发酵的奥秘，大规模发酵生产得以开始。,生物技术发展历程,第二代生物工程技术(20世纪40年代60年代) 以获取微生物的代谢产物抗生素为目的的抗生素工业为这一时期生物工程产业的支柱产业。 1928年英国的Fleming爵士在对细菌的研究中发现一种青色霉菌能杀死长在培养皿中的金黄色葡萄球菌，随后他又发现这种青霉菌的培养汤也能杀死葡萄球菌，于是他推断是青霉菌的代谢产物中含有杀菌物质，他称之为青霉素。1943年英美科

6、学家联合开发出大规模从青霉中提取青霉素的工艺，从此开始了大规模抗生素的生产，拯救了无数人的生命。,生物技术发展历程,第三代生物工程技术(20世纪70年代起) 1953年遗传物质DNA的双螺旋结构模型的提出和1972年DNA重组技术的诞生，开辟了分子生物学和现代生物技术的新纪元。 基因的发现使科学家们不再满足于利用现有的生物来为人类服务，而基因重组技术的问世使通过改造生物基因创造有新的遗传特性的生物成为可能，从而使以往的生物工程实现了向代表二十一世纪发展方向的现代生物工程的飞跃。,现代生物技术的含义,生物工程也叫生物技术，就是以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他自然科学原理，按照预

7、先的设计改造生物体，或利用微生物、动物体、植物体或其组成部分（包括器官、组织、细胞等）作为反应器对原料进行加工，为人类生产出所需要的产品或达到某种目的的技术。,现代生物技术的目的,对生物体进行改造，培育出具有优良品质的动物、植物、微生物新品系。 利用微生物、动物、植物为反应器对原料进行加工，生产出人类所需要的产品。 进行疾病的防治、诊断和治疗。 环境污染的检测。,现代与传统生物技术的区别,现代生物技术通过操作基因来改变自然生命物质的原有结构和成分。显然，现代生物技术与传统生物技术已经有了区别，即它不再是在原有物种水平上和沿袭自然的途径，而是超越物种的界限，实现的是创造崭新的品种和有目的的改造和

8、控制自然界已有的生化过程。,现代生物技术研究的主要内容,主要由以下5个分支组成： 基因工程(核心所在) 蛋白质工程(第二代基因工程) 酶工程 发酵工程 细胞工程,蛋白质工程,也称“第二代基因工程”，其主要内容和基本目的可以概括为：以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的基因修饰和基因合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。,酶工程,酶工程即利用酶的催化作用，在特定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需的产品。酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术，它的应用主要集中于食品工业、轻工业和医药工业等

9、领域。,发酵工程,发酵工程也叫微生物工程，是指利用微生物的特定性状，在生物反应器中生产有用物质的技术。 当前的医用抗生素、农用抗生素等已有数百种，绝大部分是发酵的产品。除抗生素外，发酵工程产品还包括氨基酸、工业用酶等。人们日常生活中广泛使用的味精、维生素等都是发酵工程的产品。,细胞工程,细胞工程是利用细胞的全能性，在体外条件下，采用组织与细胞培养技术对动、植物进行修饰，从而改良和创造新品种，生产人类所需要的新的生物类型。 细胞工程主要包括动植物细胞的组织培养技术、细胞融合技术、细胞核移植、细胞器摄取和染色体片段重组技术等。,细胞工程,细胞融合技术是指两个不同种类的细胞，加上融合剂，在一定条件下

10、，彼此融合成杂交细胞，使来自两个亲本细胞的基因有可能都被表达，从而打破了远缘生物不能杂交的屏障，提供了创造新物种的可能。 细胞器摄取主要是指叶绿体和线粒体的摄取。如用白化型原生质体摄取正常的叶绿体，进而发育成正常的绿色植物；用抗药型草履虫的线粒体植入其他草履虫细胞，使后者获得抗药性。,细胞工程,染色体片段重组是利用染色体替换来改变生物遗传特性，如利用染色体的易位、缺体等方法，获得新的染色体组合。 细胞核移植对动物优良杂交种的无性繁殖具有重要的意义。它的典型应用就是用于动物无性繁殖的“克隆”。,克隆技术,克隆也就是细胞核移植，即将一个细胞中的核经显微手术和细胞融合的方法移植到去核的另一个细胞中，

11、重组胚胎发育至产仔的过程。 广义的说法就是动物不经过受精作用而获得新个体的方法，即无性繁殖。无性繁殖的英文名称叫“Clone”，译音为“克隆”。在技术上，科学家的“克隆”试验经历了从两栖动物的核移植到高等动物的核移植；从胚胎细胞核移植到体细胞的核移植的过程。,第一讲 基因工程概论,1、现代生物技术重塑自然生命 2、基因研究的发展 3、基因的现代概念 4、基因工程的诞生与发展 5、基因工程的应用 6、基因工程的安全性,2、基因研究的发展,基因工程或称基因操作，是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上，于上世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。其创立与发展，直接依赖于基因分子生物学的进

12、步。可以说，基因的研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础，而基因工程技术的发展与应用，又深刻有力地影响着基因的研究，使我们对基因本质的认识提高到了空前的高度。,2、基因研究的发展,20世纪以来，基因研究一直是影响整个遗传学发展的主线。根据不同历史时期的水平和特点，可分3阶段： 20世纪50年代前：基因的染色体遗传学阶段，主要从细胞染色体水平上进行研究； 20世纪50年代70年代：基因的分子生物学阶段，主要从DNA大分子水平上进行研究； 20世纪80年代以来：重组DNA技术不断完善，人们能够直接从克隆目的基因出发，研究基因的功能及其与表型间的关系，使基因研究进入了反向生物学阶段。,2、基因研究

13、的发展,（1）基因学说的创立 （2）基因与DNA分子 （3）基因与多肽链 （4）基因的结构 （5）基因的表达与调控 （6）基因的分离 （7）基因的合成,（1）基因学说的创立,基因的最基本性质是在一个多世纪前由孟德尔(G. Mendel)定义的。由他提出的两大定律分离律与独立分配律可总结出：A、基因是一种由亲代传到子代的特殊因子遗传因子(hereditary factor)；B、基因可能存在变异的形式。(1857-1864，豌豆杂交),G. J. Mendel,（1）基因学说的创立,35年的湮没。1900年荷兰H. De Vries(德弗里斯)、德国C. Correns(科伦斯)和奥地利E. T

14、schermak(丘歇马克)等植物学家重新发现。“科学论文文献核查”的做法，为科学界所接受，一直沿用至今。,Hugo de vires 1848-1935 荷兰 阿姆斯特丹大学 Carl Correns 1864-1933 德国 土宾根大学 Erich von Tschermark 1871-1962 奥地利 维也纳农业大学,（1）基因学说的创立,1909年，丹麦生物学家W. Johannsen根据希腊文“给予生命”之义，创造了基因(gene)一词，替代了孟德尔的“遗传因子”。遗传性状的符号，尚未具体涉及基因的物质概念。 摩尔根(T. H. Morgan)学派对基因学说的建立作出了卓越的贡献。

15、他们通过果蝇突变体的研究第一次将代表某一特定性状的基因同某一特定的染色体联系了起来，创立了遗传的染色体理论，使基因学说得到了普遍的承认。(1910-1915),Morgan, Thomas Hunt (1866-1945),2、基因研究的发展,（1）基因学说的创立 （2）基因与DNA分子 （3）基因与多肽链 （4）基因的结构 （5）基因的表达与调控 （6）基因的分离 （7）基因的合成,（2）基因与DNA分子,在人们认识核酸的过程中，1928年发现的“转化”现象具有重要作用。肺炎双球菌能够通过引起肺炎杀死老鼠。这种细菌的有毒物质被认为是它的外壳多糖，是一种细菌表面的物质，能够避免细菌被宿主破坏掉

16、。不同类型的肺炎双球杆菌有不同的外壳多糖。但它们都有平滑的表面。 已死亡的病菌中的参与转化的那一部分物质称之为转化物。1944年Avery和他的同事们的实验表明转移物的化学组成实际上就是脱氧核糖核酸（DNA）。,图1.1 转化过程的核心是DNA 这个结果说明了原核生物的遗传物质是也是DNA，还为细菌和高等生物的遗传提供了一种独特的观点。,原文对图1.1的结果是这样分析的：这种引入的物质，就它的化学和物理性质而言，看起来是高度聚合且有粘性的DNA。另一方面，III 型外壳多糖的合成是由可转移的物质激发的，它是由不含氮的多糖组成。因此我们认为，引入的物质以及反过来产生的产物在化学上是不同的，在功能

17、上有生物特异性，两者对于决定它们所在细胞的特异性是必须的。 这个讨论描述了遗传物质及表达产物之间的区别，为后来的研究奠定了重要的理论基础。,当可转移分子被发现由DNA组成之后，下一步需要证明的就是DNA可在一个完全不同的体系中提供遗传物质。 1952 年，Hershey和Chase用放射性标记T2噬菌体感染细菌 (32P 标记DNA，35S标记蛋白质) 的实验进一步说明了不管是在细胞基因组中还是病毒中，遗传物质就是DNA这一结论。 图 1.2 说明了这个试验的结果。,图 1.2 T2 噬菌体的遗传物质被证明是DNA(捣碎实验)。 本实验直接表明父代噬菌体的DNA进入到细菌中，变成了子代噬菌体的

18、一部分，恰好符合是遗传物质的遗传特性。,（2）基因与DNA分子,证明了DNA是遗传物质和基因的载体之后，遗传学家和分子生物学家进而着手研究维系生命现象的基础DNA分子的自我复制过程，以揭示遗传信息是怎样从亲代准确地传递到子代的本质。 这个问题是在1953年J. Watson和F. Crick创立DNA双螺旋结构模型之后才逐步得到解决的。,（2）基因与DNA分子,DNA双螺旋模型的提出基于以下三个方面的发现： X光衍射实验数据表明DNA是一种规则螺旋结构：每3.4nm旋转一周，直径约为2nm。因为相邻核苷酸距离为0.34nm，因此每圈有10个核苷酸单位。 DNA密度测量说明这种螺旋结构应有两条链

19、。而且如果两条链间的碱基都是朝里而且严格的按嘌呤对嘧啶排列，那么就可以阻止嘌呤对嘌呤(太粗)，嘧啶对嘧啶(太细)的形成。 不论碱基数目多少，G的含量总是与C一样，而A与T也是一样。因此通常以G+C的含量来描述DNA的组成。不同物种G+C的含量一般在2674%。,图 1.3 多核糖键是由一系列53糖-磷酸键作为主链和含有碱基突出组成的。,图 1.4 由于嘌呤碱基总是与嘧啶碱基配对，因此双螺旋的宽度是恒定的，图中序列为T-A、C-G、A-T、G-C。,两条核苷酸链反向平行。沿着螺旋旋转方向，一条是5-3方向，而另一条是3-5方向。,图 1.5 DNA的双链构成双螺旋,每个碱基相对于其相邻的碱基对都

20、绕螺旋轴旋转约36度。这样约10个碱基对就能旋转一周。双螺旋体中的两条链彼此环绕形成一条窄沟(约12nm)和一条宽沟(约22nm)，这两条沟在电镜下形状见图1.5。双链是沿右手方向的；即顺时针方向转动。所有这些都是B-DNA所具有的特征,图 1.6 碱基配对是DNA复制原理的基础。,图上部是一对父本链，下部是通过碱基对互补产生的子代链。未复制的亲本双链由两条原始的亲本链组成。复制要求两条链分开，从而为互补提供模板。每一个子代双链与原始亲本的序列相同，并且包括一条亲本链和一条新合成的链。如此DNA的结构使得它的序列能稳定的遗传。,图 1.7 DNA 的复制是以半保留方式进行的。,亲本双螺旋复制形

21、成两个子代双螺旋，每一个携带一条亲本链和新合成的子代链，这种组合在代与代之间非常保守，两条链之中总是有一条亲本链。这种复制方式称为半保留复制(Semiconservative replication)。,不管是杂合双体还是纯合双体，其中任何一条链要么是含重原子的要么是含轻原子的。1958年的Meselson-Stahl实验证实了这一观点，在这个实验中观察了三代酵母菌的DNA复制。从细胞中提取出DNA，离心测量其密度，则DNA按密度分成三带：最重的是母体，杂合体是第一代，第二代中一半是杂合体一半是纯合双体。(图 1.7),图 1.8 复制叉是指从未解旋的母链向新复制的子链过度的区域。,DNA 分

22、子在复制过程中，非复制区保持着亲本双链结构，复制区分开，从此处形成两个代双链(图1.8)。这两个相接区域称为复制叉，此处双螺旋的结构被破坏。复制涉及到复制叉沿着亲本双链移动，因此存在亲本双链连续解螺旋以及重新螺旋形成子代双链。, （2）基因与DNA分子,DNA分子是基因的载体，是否每一段DNA都是基因呢？ 经典的基因概念：在染色体或DNA分子上，基因都是成串珠似的一个挨一个排列，它们之间由非遗传的物质连接起来。交换只是在基因之间进行，而不在基因内部发生。基因既是遗传的功能单位，也是交换单位和突变单位。 以T4噬菌体为材料的研究工作表明，事实并非如此。, （2）基因与DNA分子,1955年，S.

23、 Benzer正式使用“顺反子”(cistron)这个术语，将T4噬菌体导致寄主快速溶菌的rII区的两个亚区分别称为rIIA顺反子和rIIB顺反子(即rIIA基因和rIIB基因)。 每一个顺反子就是一段核苷酸序列，或曰相当于一个基因的DNA或RNA单元，它编码一种完整的多肽链。这种多肽链既可以是一种具有生物活性的蛋白质，也可以同别的多肽聚合形成多功能的蛋白质。,（2）基因与DNA分子,顺反子是功能单位，由许多可以突变的位点组成。这些位点之间又可以发生交换。 据Benzer计算，在功能DNA中，最小交换单位约为13个核苷酸对，这同理论上的最低值一个核苷酸对极为接近。所以，顺反子中的最小交换单位(

24、又称交换子)和最小突变单位(又称突变子)，都应是DNA分子中的一个核苷酸对。也只有在这种情况下，交换子才等于突变子。,（2）基因与DNA分子,一般说来，一个顺反子即是一个基因，大约含有1500个核苷酸对，是由一群突变单位和重组单位组成的线性结构。 顺反子的概念表明：基因不是最小单位，它仍然是可分的；并非所有的DNA序列都是基因，而只有其中某一特定的多核苷酸区段才是基因的编码区。 由于所有生物的DNA的基本结构都是一致的，因此，来自两种生命形态的基因(DNA)可以融为一体，这是进行基因工程的重要理论基础之一。,2、基因研究的发展,（1）基因学说的创立 （2）基因与DNA分子 （3）基因与多肽链

25、（4）基因的结构 （5）基因的表达与调控 （6）基因的分离 （7）基因的合成,（3）基因与多肽链,基因是细胞中所有的RNA及蛋白质分子的“蓝图”。 20世纪40年代，G. W. Beadle和E. L. Tatum提出“一种基因一种酶”假说(“one-gene-one-enzyme hypothesis”)。(X-射线诱导红色面包霉，营养缺陷突变体，1941年) 1957年，英国剑桥V. M. Ingram在对镰形细胞贫血症的血红蛋白和正常血红蛋白的氨基酸序列作了对比研究之后，才第一次用实验证实了基因同蛋白质之间的直接联系。(GluVal)表明基因的突变会直接影响到它编码的蛋白质多肽链成份的改

26、变。 多体蛋白质的发现。假说修正为“一种基因一种多肽链”。,基因的碱基顺序与蛋白质的氨基酸顺序对应关系？,1958年，F. Crick在综合分析了50年代末期有关遗传信息流转向的各种资料的基础上，提出了描述DNA、RNA和蛋白质三者关系的中心法则(central dogma) ； 1970年，D. Baltimore和H.M.Temin在一些RNA肿瘤病毒中，发现了一种依赖RNA的DNA多聚酶逆转录酶。 1971年，F. Crick根据新的进展修改了中心法则：,RNA,Dogma,Central,DNA,Protein,转 录,翻 译,Transcription,Translation,Rep

27、lication,复 制,逆转录,Reverse Transcription,?,在生命的初始阶段，中心法则是：?,RNA自我复制并翻译（生产）蛋白质 RNA只由四种核苷组成，有的结构非常简单，把核苷链片段放在一起就可能组成有自我复制能力的RNA，这已经被实验证明。,但是有一个困难：RNA的自我复制和翻译蛋白质这两个过程都需要酶的催化，而酶是一种蛋白质。究竟是先有RNA还是先有蛋白质呢？,1981年，美国生物学家切赫(T. Cech)等发现四膜虫26S rRNA前体的自我剪接作用，随后又证明前体中的居间序列(intervening sequence，IVS)有五种酶的活力。1983年，Altm

28、an从纯化的RNase P中，证明催化tRNA前体成熟的催化剂是RNase P中的RNA。以后又发现RNA自己不需要蛋白质的帮助，就可以用氨基酸合成肽链。,切赫(T.R.Cech) (1947-),1989年的诺贝尔化学奖授予了美国耶鲁大学的悉尼奥尔特曼与科罗拉多大学的托马斯切赫,DNA本身是否也具有酶活性呢？1994年，乔依斯（GFJoyce）等人发现一个人工合成的DNA分子具有一种特殊的磷酸二酯酶活性。此后，国外又有多例报道人工合成的DNA序列具有各种不同的酶活性。1995年，我国学者王身立等人发现，从多种生物中提取的DNA均具有酯酶活性，能催化乙酸萘酯水解为萘酚和乙酸。这种较弱的酯酶活性

29、并不需要特定序列的DNA编码，而是非特异性DNA的一般性质。王身立推测，在生命起源时，RNA和蛋白质都还未出现，原始海洋营养汤中的DNA可能利用本身的酯酶活性水解萘酯等物质以获得能量。随着生命的进化，酶活性更强的蛋白质出现了，在生命世界中DNA作为酶的作用则为蛋白质所取代。但DNA分子本身的酯酶活性仍作为一种“分子化石”的遗迹，一直保存到今天。,2005年发表在Science上的一篇文章表明，来自Mount Sinai医院的研究人员发现了一种蛋白，它可以为DNA复制提供编码信息。新发现的蛋白叫Rev 1 DNA聚合酶，它可以以自身为模板在复制链上加一个胞嘧啶。这个C是无论G是否在DNA链中存在

30、都会被Rev1加上去的。 这是研究人员第一次发现蛋白作为一种合成DNA的模板。细胞利用这种崭新的机制在含有致癌物质的情况下对受损的DNA进行复制。这开启了一种预防与治疗癌症的创新研究模式,遗传信息的控制和进化法则不是中心法则，是双向法则。 由DNA到RNA再到蛋白质的信息流是遗传信息流，而由蛋白质向DNA、RNA的信息流向是反馈信息流，它们是两种性质不同的信息流，前者为了保持不变，是以拷贝、转录等方式进行的，而后者反馈新信息影响DNA局部的改变，是通过传导、催化、参与、调控等方式进行的；前者是一次性的拷贝和转录便可实现信息流动的目标，形成对象性的蛋白，而后者却要多代持久的反馈才能由渐变到突变实

31、现进化的目标。不区分不同目标和方式的信息流，认为蛋白质只有像DNA一样能进行拷贝，才能出现逆向信息流，就会永远陷入中心法则的单向信息流而不得其解。,中心法则仅仅说明了构成生物体的材料的来源，却没有这些材料相互时空关系的信息来源，显然，众多的材料要形成一个特定的构造必须要有一个相当复杂、完备的调控程序，不仅需要图纸还需要工艺设计和施工顺序。这些东西都不可能是蛋白质这样的材料。 软件这是中心法则没有说明的东西，中心法则只提供了硬件的来源，忽视了建造、调控、运行的程序。 无疑，这些程序也只能存贮在DNA里，而且是那些不直接作为蛋白质编码的程序段，或者说很可能是那些不被认为是“基因”的“垃圾DNA”。

32、,科学是永无止境的，它是一个永恒之谜。 爱因斯坦,中心法则是科学的，但不是绝对没有问题的。 清道夫鱼的性别变换(性转换中，染色体没有变化)； 分子重排现象，转录与翻译之后的修饰； 某些肽类抗生素(如短杆菌肽等)并非在信使RNA模板上合成的，而是由短杆菌肽合成酶按顺序吸附了相应的氨基酸排列在酶分子表面，然后使其聚合而成的，于是原有的蛋白质成了合成新蛋白质的模板。,mRNA分子上从5至3方向，由AUG开始，每三个相邻的核苷酸为一组，在蛋白质合成中代表某种氨基酸或其他信息，称为密码子或三联体密码(Triplet Code)，统称为遗传密码（genetic codon)。 反密码子： 转运RNA能与信

33、使RNA的碱基相互配对的三个相邻碱基。,（3）基因与多肽链（遗传密码）,密码比(coding ratio)问题 密码是否同叠？ 三联体之间是否存在“逗号”？ 三联密码子编码的破译,（3）基因与多肽链（遗传密码）,1954年，物理学家George Gamov根据在DNA中存在4种核苷酸，在蛋白质中存在20种氨基酸的对应关系，做出数学推理，认为只有43=64这种关系是理想的。 1961年，Brenner和Crick根据DNA链与蛋白质链的共线性(colinearity)，首先肯定了3个核苷酸的推理。随后的遗传学实验证实，是由3个碱基编码一种氨基酸，人们称这种碱基三联体为密码子(codon)。,（3

34、）基因与多肽链（遗传密码）,在1962年，用大肠杆菌提取液进行体外合成试验，加入细菌病毒f2的RNA，结果合成了一个与天然的f2外壳蛋白完全相同的蛋白质，其氨基酸顺序完全一样。这便证明在体外条件下，可以准确地按照mRNA的遗传信息合成相应的蛋白质。,1) 在体外无细胞蛋白质合成体系中加入人工合成的poly 开创了破译遗传密码的先河。,1961年发现mRNA后，美国NIH的Nirenberg和Mathaei合成了polyU作为模板，以观察无细胞系统中蛋白质合成速率。当把翻译产物分离、纯化和做序列分析后，结果出乎意料，合成的肽链中的氨基酸残基全部是苯丙氨酸，即polyPhe。于是第一次确认了UUU

35、是Phe的密码子。这样，就在一个偶然的机会开创了破译密码的工作。, 生物化学方法破译遗传密码,2) 以两种不同比例的核苷酸混合物合成不均一的多聚核苷酸来推测密码子的核苷酸组成。,1963年，Speyer和Ochoa等发展了用两个碱基的共聚物破译密码的方法。例如，以A和C原料，合成polyAC。polyAC含有8种不同的密码子:CCC、CCA、CAA、AAA、AAC、ACC、ACA和CAC。各种密码子占的比例随着A和C的不同而不同，例如当A和C的比例等于5 : 1时，AAA : AAC的比例=555 : 551=125 : 25。实验显示AC共聚物作模板翻译出的肽链由六种氨基酸组成Asp，His

36、，Thr，Pro，Glu和Lys，其中Pro和Lys的密码子早先已证明分别是CCC和AAA。,2) 以两种不同比例的核苷酸混合物合成不均一的多聚核苷酸来推测密码子的核苷酸组成(续)。,根据共聚物成份不同的比例和翻译产物中氨基酸比例亦不同的关系，Speyer等确定了Asp、Glu和Thr的密码子含2AlC; His的密码子含1A2C; Thr的密码子也可以含1A2C; Pro为3C或1A2C; Lys为3A。但上述方法不能确定A和C的排列方式，而只能显示密码子中碱基组成及组成比例。Asp，Glu和Thr的2A1C可能有三种排列方式，即AAC、ACA、CAA。此外，通过反复改变共聚物成份比例的方法

37、亦十分麻烦和费时。,3) 核糖体结合试验破译密码子的核苷酸顺序,Nirenberg和Leder于1964年建立了破译密码的新方法，即tRNA与确定密码子结合实验：在缺乏蛋白质合成所需因子的条件下，特异氨基酸-tRNA也能与核糖体-mRNA复合物结合。这种结合并不一定需要长的mRNA分子，三核苷酸就可。例如，当polyU与核糖体混合时，仅有Phe-tRNA与之结合；相应地Pro-tRNA特异地与polyC结合。还有GUU可促进Val-tRNA结合，UUG促进Leu-tRNA结合等。虽然所有64个三核苷酸(密码子)都可按设想的序列合成，但并不是全部密码子均能以这种方法决定，因为有一些三核苷酸序列与

38、核糖体结合并不象UUU或GUU等那样有效，以致不能确定它们是否能为特异的氨基酸编码。,图1.9 核糖体结合实验 人工合成的三核苷酸与对应的氨酰-tRNA分子及核糖体复合物可以保留在硝酸纤维膜上。,4) 用重复共聚物(repeating copolymers)破译密码,1966年，H. G. Khorana等发明了利用重复的共聚体，例如GUGGUG，AAGAAG，来破译密码子的途径，并因此发现了3个终止密码子：UAA，UAG，UGA。蛋白质在核糖体上的合成可以在这些有规律的共聚物的任一点开始，并把特异的氨基酸掺入肽链。,由Poly(GUA)或Poly(GAU)只获得两种均聚肽。 UAG和UGA为

39、终止密码子,1966年，尼伦伯格(Nirenberg)和科拉纳(Khorana)等人完成了对全部遗传密码的破译，2人共同获得1968年的诺贝尔奖。,密码表,遗传密码(genetic codon)的特点,连续性 简并性 摆动性 通用性 不重叠,遗传密码(genetic codon)的特点,连续性 (commaless) mRNA分子的ORF中，组成遗传密码的 三联体没有间断，须3个一组连续读下去， 直至出现终止密码子为止。 mRNA链上碱基的插入或缺失，就会改 变密码阅读的顺序，造成框移，使下游翻译 出的氨基酸完全改变，即移码突变。,遗传密码(genetic codon)的特点,简并性(dege

40、neracy) 一种氨基酸可有几个意义相同的密码子，即同义密码子。除Trp、Met外，其余氨基酸均有24个最多达6个密码子。同义密码子之间，前两个碱基均相同，只是第三个碱基不同。若头两个碱基发生点突变，可译出不同氨基酸，而第三个碱基的突变，不会影响氨基酸的翻译。,遗传密码(genetic codon)的特点,摆动性(wobble) 反密码子和密码子配对时，有时会出现不遵从碱基配对规律的情况，称为遗传密码的摆动现象。这一现象常见于反密码子的第一位碱基与密码子的第三位碱基之间。,按照Wobble假说密码子与反密码子配对,遗传密码(genetic codon)的特点,通用性(universal) 不

41、同种属的生物都使用同一套遗传密码。但近年发现线粒体和叶绿体使用的遗传密码稍有差别。 如线粒体、叶绿体以AUG、AUU、AUA为起始密码子，而AUA兼有Met密码子功能。终止密码子是AGA、AGG，Trp密码子是UGA等。,遗传密码(genetic codon)的特点,不重叠 通常说来，密码子是不重叠的，每个三联体中的三个核苷酸只编码一个氨基酸，核苷酸不重叠使用。 噬菌体x174中某些基因之间有重叠现象,2、基因研究的发展,（1）基因学说的创立 （2）基因与DNA分子 （3）基因与多肽链 （4）基因的结构 （5）基因的表达与调控 （6）基因的分离 （7）基因的合成,（4）基因的结构,最早试图揭示

42、基因内部精细结构的研究工作是S. Benzer在20世纪50年代晚期进行的。1955年他发展出了一种应用T4噬菌体rII区的不同等位基因绘制基因内部图谱(intragenic maps)的方法，为探索产生等位基因的分子机理提供了新的手段。 1967年C. Yanofsky等通过对E.coli色氨酸合成酶基因(trpA)的研究，首次将基因的精细结构遗传图(genetic map)同物理图(physical map)进行比较。,（4）基因的结构,只有到了70年代中期，随着基因克隆和DNA序列分析技术的相继发展，人们才真正有可能从单碱基水平上剖析基因的分子结构。,非编码区,非编码区,编码区,编码区上

43、游,编码区下游,与RNA聚酶 结合位点,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。, 原核基因的结构,能够转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质的区域。,位于编码区上游和编码区下游的DNA序列，虽不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等。,非编码区(调控序列),编码区(编码序列), 原核基因的结构,编码区,非编码区,非编码区,与RNA聚酶 结合位点,

44、内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA,编码区上游,编码区下游,内含子,外显子, 真核基因的结构,原核细胞与真核细胞的基因结构比较：,非编码区与内含子都是基因结构中不能编码蛋白质的序列,它们有哪些不同,?,内含子能转 录为信使RNA,启动子与起始密码有何不同,?,启动子是基因结构中位于编码区上游的核苷酸序列，是RNA聚合酶结合位点，能够准确地识别转录的起始点并开始转录，有调控遗传信息表达的作用。而起始密码则是mRNA上的三个相邻碱基。启动子不止三个碱基。,外显子与内含子的角色是否固定不变,?,一般说，真核细胞结构基因都是由外显

45、子和内含子组成，但是，外显子和内含子的关系并不是完全固定不变的，有时同一条DNA链上的某一段DNA序列，当它作为编码某多肽链的基因时是外显子，而作为编码另一多肽链的基因时，则是内含子，结果是同一基因可以同时转录为两种或两种以上的mRNA。,终止子和终止密码有何不同,?,终止子是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的DNA序列。它特殊的碱基排列顺序能够阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，从而使转录工作结束。终止密码位于mRNA上，共有三种：UAA、UAG、UGA。,2、基因研究的发展,（1）基因学说的创立 （2）基因与DNA分子 （3）基因与多肽链 （4）基因的结构 （

46、5）基因的表达与调控 （6）基因的分离 （7）基因的合成,基因表达(gene expression)：是遗传信息通过转录生mRNA再经翻译生成蛋白质的过程。,（5）基因的表达与调控,1961年，F. Jacob和J. Monod提出大肠杆菌的乳糖操纵子模型。 操纵子(operon)是一种完整的细菌基因表达单位，由若干个结构基因、一个或数个调节基因及控制单元组成。控制单元包括一个操纵基因和启动区序列。 结构基因(structural gene)：细胞中基本看家蛋白质如代谢酶类、转运蛋白质和细胞骨架成份等的编码基因。 调节基因(regulatory gene)：编码用以控制其它基因表达的RNA或蛋

47、白质产物的基因。 操纵基因(operator)：接受来自调节基因合成的调节蛋白的作用，使结构基因转录活性得以控制的特定的DNA区段。,（5）基因的表达与调控,1961年，F. Jacob和J. Monod提出大肠杆菌的乳糖操纵子模型：,（5）基因的表达与调控,操纵子概念指出基因不但在结构上是可分的，在功能上也是有分工的。,（5）基因的表达与调控,1969年，R. J. Britten和E. H. Davidson提出一个假想的真核细胞的基因调控模型。根据这个模型，与调节基因相连的一段DNA叫做传感基因(sensor gene)，细胞根据需要向它发出信号。这种信号可能是由细胞中的化学分子传达，当

48、其到达传感基因后，调节基因就开始发生作用，制造出激体RNA (activator RNA)，并由它指示同结构基因相邻的受体基因(receptor gene)，令其发动结构基因行使功能转录出mRNA，进而转译成相应的蛋白质分子。,2、基因研究的发展,（1）基因学说的创立 （2）基因与DNA分子 （3）基因与多肽链 （4）基因的结构 （5）基因的表达与调控 （6）基因的分离 （7）基因的合成,（6）基因的分离,据生物的表现型来研究基因型这种间接的研究法不能满足科学发展的要求，有必要将基因分离出来，在试管中直接研究其结构、功能及调节等一系列问题。 1969年，美国哈佛大学R. Beckwith等应用

49、DNA-DNA分子杂交技术，分离到了一种特殊的基因大肠杆菌乳糖操纵子的-半乳糖苷酶基因，首创了单基因分离的成功先例，激发了人们从不同角度、用不同方法分离基因的积极性，从而加速了基因研究工作的进展。,2、基因研究的发展,（1）基因学说的创立 （2）基因与DNA分子 （3）基因与多肽链 （4）基因的结构 （5）基因的表达与调控 （6）基因的分离 （7）基因的合成,（7）基因的合成,1970年美国MIT的H. G. Khorana等首次报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸基因(77bp)全合成；1976年，大肠杆菌酪氨酸转移核糖核酸基因(200bp)全合成。将之导入E. coli之后，表现出特有的生物活性，

50、起到了基因的作用。 1977年，H. W. Boyer等将化学合成的人脑激素基因连接在乳糖操纵子上并导入大肠杆菌细胞，成功实现转录和转译，产生出有生物活性的蛋白质。这是第一个以DNA重组技术完成的基因工程。,第一讲 基因工程概论,1、现代生物技术重塑自然生命 2、基因研究的发展 3、基因的现代概念 4、基因工程的诞生与发展 5、基因工程的应用 6、基因工程的安全性,3、基因的现代概念,（1）移动基因 （2）断裂基因 （3）假基因 （4）重复序列及重复基因 （5）重叠基因,（1）移动基因,移动基因，又叫转位因子。由于它可以从染色体基因组上的一个位置转移另外一个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁，因

51、此在文献上有时也形象地称之为跳跃基因。 移动基因最早是由美国冷泉港实验室的女科学家B. McClintock，于上个世纪40年代晚期在玉米中首次发现的。她因为本项发现，获得了1983年的诺贝尔生物医学奖。,基因在染色体上作线性排列，基因与基因之间的距离非常稳定。常规的交换和重组只发生在等位基因之间，并不扰乱这种距离。在显微镜下可见的、发生频率非常稀少的染色体倒位和相互易位等畸变才会改变基因的位置。可是，麦克林托克这位女遗传学家，竟然发现单个的基因会跳起舞来：从染色体的一个位置跳到另一个位置，甚至从一条染色体跳到另一条染色体上。麦克林托克称这种能跳动的基因为“转座因子”(目前通称“转座子”，tr

52、ansposon)。,巴巴拉麦克林托克（Barbara McClintock，1902-1992）,面对荣获诺贝尔奖这一崇高荣誉，麦克林托克平静地说：“我觉得自己获得这种意外的奖赏似乎有些过分。多少年来，我在对于玉米遗传的研究中已获得很多的欢乐。我不过是请求玉米帮助我解决一些特殊的问题，并倾听了她那奇妙的回答。”这就是麦克林托克，一位经历简单然而思想深刻的天才科学家。,3、基因的现代概念,（1）移动基因 （2）断裂基因 （3）假基因 （4）重复序列及重复基因 （5）重叠基因,（2）断裂基因,过去人们一直认为，基因的遗传密码子是连续不断地并列在一起，形成一条没有间隔的完整的基因实体。但以后通过对

53、真核蛋白质编码基因结构的分析发现，在它们的核苷酸序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。我们称这种编码序列不连续的间断基因为断裂基因(split gene)。有人认为断裂基因是近二三十年来在生物学上最惊人的发现之一。断裂基因最初是在腺病毒中发现的，1977年提出科学报告。,（2）断裂基因,除了腺病毒外，很快在SV40中也发现了同样的mRNA剪辑加工现象。首先在哺乳动物基因中发现间隔序列的是美国国立卫生研究院的P. Leder博士，他证实在小鼠-珠蛋白中存在有不转译的间隔序列。 根据今天的资料，所有的哺乳动物、脊椎动物和高等植物以及简单的真核生物如酵母，甚

54、至少数原核生物中都存在着断裂基因。,3、基因的现代概念,（1）移动基因 （2）断裂基因 （3）假基因 （4）重复序列及重复基因 （5）重叠基因,（3）假基因,1977年，GJacq等人根据对非洲爪蟾5S rRNA基因簇的研究，首次提出了假基因的概念。他们的研究发现，这个5S rRNA基因，与一个基本上相同、但又不完全相同的5S rRNA基因的复本序列直接相邻。由于在体内从未检出过这段5S rRNA基因复本序列的mRNA分子，说明它是没有表达活性的。 因此， Jacq等人特称之为假基因(pseudogene)。现已在大多数真核生物中发现了假基因，这是一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同、

55、但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。,（3）假基因,许多假基因都是同“亲本基因”(parental gene)连锁的，而且其编码区及侧翼序列的DNA具有很高的同源性。可见产生此种类型的假基因拷贝的一种可能机理是由含有“亲本基因”的染色体区段串联重复形成，故称之为重复的假基因。珠蛋白基因家族。 在真核生物的染色体基因组中还存在着一类加工的假基因(processed pseudogene)。这类假基因没有与“亲本基因”连锁，而且其结构是同转录本而非“亲本基因”类似。如它们都没有启动子和间隔子，但在基因的3-末端都有一段延伸的腺嘌呤短序列，表明此类假基因可能是来自加工的RNA之DNA拷贝，因此称之为

56、加工的假基因。,3、基因的现代概念,（1）移动基因 （2）断裂基因 （3）假基因 （4）重复序列及重复基因 （5）重叠基因,（4）重复序列及重复基因,比较真核和原核的基因结构后发现，几乎所有的真核生物(除单细胞的酵母以外)的基因组DNA中，都具有重复序列(repeated sequence)。而且在有些例子中，重复序列的拷贝数可高达百万份以上。在人DNA中，重复序列(至少具有20份拷贝)的DNA占总DNA的30%左右。 根据对多种生物DNA所作的详细分析表明，在真核基因组存在有四种不同类型的DNA序列：,（4）重复序列及重复基因,（1） 不重复的唯一序列（只有一个拷贝）； （2） 低度重复序列

57、（10个拷贝）； （3） 中度重复序列（10到几百个拷贝）； （4） 高度重复序列（几百个到几百万个拷贝）。 当然，这种分类的界限是人为划分的，所以在作这些类型的一般性概述时，要特别留心它的具体内容。此外，由于通常研究的都是二倍体细胞，因此一种不重复的唯一序列，实际上是存在着2个拷贝。,3、基因的现代概念,（1）移动基因 （2）断裂基因 （3）假基因 （4）重复序列及重复基因 （5）重叠基因,（5）重叠基因,英国剑桥分子生物学家F. Sanger(1977)在分析了一种小的单链DNA噬菌体X174的全序列后，惊奇地发现在5386个核苷酸中组成了11个基因，通过对这11个基因编码的氨基酸总数，按

58、三联体密码子的原则计算，其所需核苷酸数超过5386个。后来Sanger实验室的G. G. Garrell等发现X174基因组中有些密码是重读的，从而形成重叠基因(overlapping gene)。所谓重叠基因是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列为两个或两个以上基因的组成部分。,（5）重叠基因,重叠基因的重叠方式可以有许多种，如小基因包含在大基因之内、前后两个基因的首尾重叠甚至三个基因重叠、操纵子重叠、或反向重叠(DNA双链都转录，密码读框相同，但方向不同)。如在噬菌体X174中(图1-23)，基因B完全包含在基因A之内，基因A与基因K共用一段序列，基因D和E的读码

59、框相差一个碱基。虽然这些基因使用的是同样的DNA序列，但它们表达时使用的读码框不同，因而表达出来的是不同的蛋白质。重叠基因现象反映了原核生物利用有限的遗传物质表达更多生物功能的能力。,（5）重叠基因,图1-23噬菌体X174的重叠基因,（5）重叠基因,在原核生物中，重叠基因是一种较为普遍的现象。1978年猴病毒SV40基因组全序列发表后，发现编码病毒外壳蛋白的三个基因VP1、VP2和VP3都有重叠部分。在真核生物甚至高等真核生物包括人的基因组中也偶尔发现有重叠基因。1998年12月公布的秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)全基因组序列分析表明，有的内含子序列中包含了tRNA基因，且tRNA基因的转录方向不一定与它所包含的基因的转录方向相同。,第一讲 基因工程概论,1、现代生物技术重塑自然生命 2、基因研究的发展 3、基因的现代概念 4、基因工程的诞生与发展 5、基因工程的应用 6、基因工程的安全性,4、基因工程的诞生与发展,（1）基因工程诞生的理论基础 （2）基因工程诞生的技术突破 （3）基因工程的诞生 （4）基因工程的基本概念与内容,A. D