共聚焦激光扫描荧光显微镜

1、共聚焦激光扫描荧光显微镜, 基本原理、应用及样本制备原则,宋 健,武汉大学医学院结构生物学研究中心 Centre for Structural Biology Wuhan University School of Medicine,什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？ 共聚焦激光扫描荧光显微镜（Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscope；LSFM） 以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统,共聚焦系统 细胞CT,荧光和荧光显微镜,一、荧光的基础术语 荧光物质： 某些物质在特

2、定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线 荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素 激发光(EXCITATION)： 能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸收波峰(最大吸收波长),发射光(EMISSION): 发射光谱；发射波峰(最大发射波长) 荧光探针： 能产生荧光的特异性生物染料（PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体） 自发荧光(AUTOFLUORESCENCE): 组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光自发荧光。 伊文斯蓝、硼化氢钠处理 漂白(BLEACH)： 荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐

3、渐下降并最终丧失 漂白。,二、荧光显微镜术的基本原理,荧光显微镜,激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。 带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490 长、短通滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490 双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。 阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490,共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置,共聚焦装置,光源 针孔,检测 针孔,荧光显微镜,光电倍增管,步进聚焦电机,物镜,Bio-Rad LaserSharp 系统操作，图像处理 3-D重建,X/Y扫描 装置,光电倍增管,检测针孔,光源针孔,光源,分色镜,物镜,样本,聚集平面,共聚焦

4、扫描显微镜光学原理,检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔 高分辨率的光学切片 激光穿透性强，可对样本进行一定深度光学断层，获得高标准的连续光学切片 实现三维重建,三维胶原基质培养的血管平滑肌细胞,共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域,只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。 形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的F联系、肿瘤细胞分类 分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量，DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、定位，荧光能量共振转移大分子构象的改变、受体与配体相互作用 活细胞动态荧光测量：细胞内Ca+、K+、H+等离子的动态

5、分布及动态定量、荧光漂白恢复细胞连接间的信息沟通 直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白,1. 荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传递,2. 荧光能量共振转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer),I.荧光能量共振转移: 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。,供体荧光素 受体荧光素,1.供体与受体间的距离 10nm或=1-7

6、nm 2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠,II.荧光能量共振转移的条件,488nm 520nm 650nm,供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素 (Cy3),供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素 (Cy3),FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP,Fluorescence Intensity,Time,检测 以供体的激发波长的光照射样品,没有共振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现荧光。 应用 受体与配体的相互作用：亚基的结合 与分离 大分子构象的改变,III. 常用荧光共振转移探针对,3. 绿色荧光蛋白（GFP） GFP的发现

7、：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白 (aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白（ green fluorescent protein GFP）。,GFP, CFP, BFP, YFP商品化质粒 转基因动物: Green mouse 外源基因的报告基因: 将外源基因与GFP DNA 相连, 可实时监测外源基因的表达. 检测细胞能否表达某一基因: 将待测基因的启动子与GFP DNA 相连, 可实时监测细胞能否表达兴趣基因. GFP-蛋白融合技术: 将结构蛋白基因

8、与GFP DNA 相连可实时监测结构蛋白的表达亚细胞结构的形成,原理: 检测游离Ca2+变化的荧光探针多为Ca2+螯合剂，通常不能透过细 胞膜，只有与乙酰甲酯(AM)相连方可进入细胞内, 被细胞内酯酶水解后方能与胞内游离钙结合后发出荧光。 Kd值：为Ca2+解离常数，指示检测Ca2+浓度的范围: 0.1xKd-10 xkd 和很多因素有关（pH、 Mg2+、温度、与蛋白的结合、等） 细胞内生理Ca2+浓度值：10-100nM 细胞内Ca2+超载浓度值：基础Ca2+浓度的10倍左右,4. 活细胞内离子动态变化测量,细胞内游离Ca2+测量,KCL诱导的细胞外Ca+内流测量,培养/分离的细胞 20M

9、 Fluo 3-AM负载液30-60min 清洗、换液 扫描,双光子激光扫描荧光显微系统,照射光波长大于荧光染料吸收峰波长2倍 高能量(2KW)、超短脉冲(兆分之一秒)聚焦, 使聚焦点瞬间产生高密度光子, 出现双光子吸收激发荧光 双光子吸收仅发生在聚焦点, 避免了焦点外激发而产生的漂白现象 高能量、超短脉冲聚焦、穿透性更强 50 m 500 m,488nm 520nm,FITC,976nm,共聚焦激光扫描荧光显微镜术样本制备的基本原则,2. 荧光探针的选择,原则：尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。,3. 3-D样本制备的基本原则,1.固定 2.是否需要切片？ 激发光的穿透力：50um (单光子) - 500um (双光子) 荧光探针对组织的渗透能力 用震荡切片机切40-100m厚片 3.透明 酒精脱水 二甲苯透明 二甲苯+少量中性树胶湿封 4.封片： 防止样本变形 防止荧光褪色：封片剂：1）用PH8.5-9 PBS配制90%甘油，加苯二胺