高分辨溶解(HRM)分析

1、第二课高解析元(HRM)和高解析元(HRM)分析是新技术。仅通过能够检测PCR片段小序列差异的PCR后溶解曲线分析，应用于突变扫描、序列匹配、基因型的多个方面。第一，原理，PCR扩增产物的溶解曲线完全取决于DNA碱基序列。只要碱基序列中有一个突变，就会改变DNA链的解链温度。但是这个差异很小，只能渡边杏到摄氏0度，如果仪器的分辨率不高，完全无法检测到。HRM分析在具有饱和染料和高分辨率仪器的情况下，使用加热PCR放大器的高精度仪器，温度从50C逐渐上升到95C。在此过程中，随着放大者逐渐解链，达到熔体温度(Tm)，DNA链将分离，荧光强度将迅速减小。HRM分析初期，荧光强度很高，温度升高，双链

2、DNA逐渐减少，荧光强度也下降。HRM设备通过相机记录荧光变化的整个过程。数据映射生成熔体曲线。双链DNA的溶解分析可以追溯到20世纪60年代。当时是通过紫外线吸收进行监测的。分析需要几微克的DNA，样品以0.1-1.0C/分钟的速度缓慢加热，因此通常需要几个小时才能完成。后来，随着LightCycler定量PCR分析器的出现，荧光溶出分析变得越来越受欢迎。由于毛细管作用，样品量减少到纳克级，熔化速度达到0.1-1.0C/秒，熔化时间缩短到几分钟。当时使用的染料是SYBR Green I。双链DNA的溶解分析可以追溯到20世纪60年代。当时是通过紫外线吸收进行监测的。分析需要几微克的DNA，样

3、品以0.1-1.0C/分钟的速度缓慢加热，因此通常需要几个小时才能完成。后来，随着LightCycler定量PCR分析器的出现，荧光溶出分析变得越来越受欢迎。由于毛细管作用，样品量减少到纳克级，熔化速度达到0.1-1.0C/秒，熔化时间缩短到几分钟。当时使用的染料是SYBR Green I。但是，在确认PCR扩增产物是否有引物二聚体及其他非特异性扩增等情况下，当时这种融合分析只能区分片段大小和GC含量之间差异更大的DNA序列。没有足够的分辨率来区分SNP。饱和染料、不饱和染料、不饱和染料对PCR有抑制作用，实验中使用的浓度很低，没有饱和DNA双螺旋结构的小沟。这样，DNA双链高温变性时，单链部

4、分的荧光染料分子重排，荧光染料分子重新结合在双链DNA的空部分，荧光信号不变，产生假阴性、特异性减少，饱和染料对PCR没有影响，高浓度染料饱和DNA双螺旋结构的小沟，在DNA链释放过程中不重排，融合曲线可以获得更高的分辨率。目前市场上有很多饱和染料，包括LC绿色、LC绿色Plus、SYTO 9等，HRM分析器目前有几家制造商提供Idaho技术、Corbett(乔根和Roche等HRM分析设备)。美国中本悠太学院桥医学院的Wittwer研究所，HRM的发明者，它包含HRM功能，评估了市场上各种乐器的遗传型和突变扫描的性能。他们发现，对于大多数仪器的准确基因型，平板电脑的空间温差(Tm的标准差为0

5、.020-0.264C)是主要限制。其他差异(例如数据密度、信噪比和熔化速度)也会影响杂波的扫描。据调查，单独控制空气加热设备和样品温度的设备的Tm标准偏差(0.018-0.065)较低，而加热块设备的温度为0.092-0.274。HR-1，HR-1仪器采用精密温度控制技术，结合高速数据采集技术，使用高分辨率饱和LC绿色荧光染料，提高仪器的灵敏度和特异性。分析时不消耗测试的PCR产品样本，分析结束后，PCR产品可用于排序等下游分析。，HR-1特性：加热速度：0.01 -1/秒数据收集密度：100数据/使用LC绿色荧光染料反应系统5-20ul分析时间：40-45采样/小时(0.3/相关研究方向：

6、1)对样本内特定突变位点(SNP)的筛选检查，包括对一片不同部位的复合异型突变。(2)对与疾病相关的基因(肿瘤基因)的特定部位突变部位进行扫描，发现了新的突变。(3)遗传育种中特定突变的筛选，发现未知突变。4)植物抗逆性、突变和特性的相关性研究。5)动植物质量相关多态性部位研究。2，人类白细胞抗原(HLA)基因组排列器官移植HLA匹配，同胞间HLA基因型确定，HLA高度多态性部位类型及郑智薰亲缘关系对象间异种造血干细胞移植前HLA基因型确认。3，等位基因频率分析4，物种鉴定，品种鉴定1)微生物品种，物种快速鉴定。2)动植物品种识别。5，甲基化研究1甲基化部位筛选。2甲基化程度分析。在启动子区检测甲基化的HRM方法检测甲基化程度低0.1%。并根据已知甲基化程度的标准曲线，测定了未知样品的甲基化率。HRM是高灵敏度甲基化检测方法，其高重复性和低成本将对肿瘤的研究和林爽应用有很大帮助。6法医鉴定，亲子鉴定