基因工程常用技术课件

1、第三章基因工程常用技术，一、质粒DNA提取二、核酸凝胶电泳技术三、核酸分子单孢杂交技术四、聚合酶链式反应(PCR )技术五、DNA序列分析技术、质粒DNA提取是基因工程操作中最基本的技术，最常用的是碱裂解法。 一、质粒DNA提取，在强碱性溶液中，DNA双链氢键破坏改性； 溶液恢复中性后，DNA双链复活。 (1)碱解法提取质粒DNA，1、原理、改性后双链不分离，恢复性快。共价键环状质粒DNA :线性染色体DNA :2、碱裂解法质粒DNA提取步骤，1 )增加溶血工作团队、葡萄糖：溶液黏性系数，维持渗透压，防止DNA在机械功率裂解。 抑制EDTA :Mg2、Ca2鳌合剂、DNase活性，防止DNA分

2、解。 溶菌工作团队：氰苷类水解作用酶催化剂，水解作用细胞细胞贴壁主要化学成分肽聚蛋白中的- 1，4糖苷键，有溶菌酶作用。 2 )改性，NaOH :为强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链改性。 在络离子性界面激活剂中，溶解胞质膜和细胞球内蛋白质，与“蛋白质-SDS”复合物结合，使蛋白质(包括DNase )变性沉淀。 用中和、KAc :冰HAc将KAc溶液的pH调节到4.8，中和NaOH改性液，使DNA恢复。 高浓度KAc沉积有利于变性的高分子染色体DNA、RNA、蛋白质SDS复合体。 冰HAc :上清中含有质粒DNA。 4 )离心沉淀；5)DNA、酚-三氯甲烷-异戊醇(253360-243

3、360-1 )萃取或提纯柱色谱分析法。 苯酚：比重大，可以加速有机相和水相的层，减少水相中残留的苯酚。 蛋白质改性剂进一步提取DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。 防止提取时起泡。 三氯甲烷：异戊醇：二倍体积的无水乙醇沉淀DNA。 6 )使DNA沉淀，DNA分子以水合状态“溶解”于水中，乙醇剥夺了DNA分子的水环境。 用70%乙醇洗涤和干燥DNA。 7 )洗涤，用含有RNaseA(20g/ml )的TE溶解DNA，储存在-20中。 由TE :Tris-HCl缓冲液和EDTA制备。 EDTA抑制DNase，防止DNA被酶催化剂分解。 Tris-HCl不含金属络离子(与磷酸和硼酸缓冲液不同)，有利

4、于后续的操作。 RNaseA :分解残留的RNA。 众多公司研制商品化质粒提取工具包，原理多遵循碱解法，纯化工艺采用柱色谱分析法。 3、影响质粒DNA产量的因素，质粒产量受提取过程各因素的影响，但最重要的是菌株的遗传背景和质粒本身的拷贝数。 一般使用endA突变型基因的E.coli菌株，例如DH5、JM109等。 1 )接纳体菌株、endA基因查询密码核酸内切酶I，在Mg2的存在下，能够将双链DNA消化成7bp的寡聚核苷酸片段。 常用质粒的理论产量有：质粒分子大小拷贝数质粒产量(kb) (g/ml )、(2)DNA的定量和纯度测定、1、紫外光谱法、原理： DNA在260nm波长具有特异的紫外吸

5、收峰(蛋白质在280nm处吸收峰) 在波长260nm的紫外光下，1OD值的吸光率相当于双链DNA浓度50g/ml。 纯DNA样品： OD260/OD280=1.8 OD260/OD230 2.0、OD260/OD230 2.0:残留盐和小分子杂质，例如核苷酸、氨基酸、酚等。OD260/OD280 1.6:有蛋白质污染OD260/OD280 1.6 :有RNA污染原理：利用溴化乙锭(EB )插入DNA分子中，在紫外光的照射下可以发出红色荧光，其荧光强度为已知浓度的DNA (例如DNA marker (2)琼脂糖凝胶电泳的推测，(3)DNA分子量的推测，通过琼脂糖凝胶电泳，与已知的分子量的DNA

6、marker相比是明确的。 二、核酸凝胶电泳技术，(一)阳离子电泳的基本原理，生物大分子在一定的pH条件下，通常带电荷，放置在电场中，以一定的速度向与该电荷性质相反的电极移动，移动速度称为阳离子电泳速度。 摩擦系数与分子的大小、构型及介质的黏性系数有关。阳离子电泳速度与电场强度、分子具有的净电荷数成正比，与分子和介质的摩擦系数成反比。 在大姨妈条件下，由于DNA分子的糖-磷酸骨架中的磷酸化学基发生络离子化，DNA实际上呈现多聚阴离子状态，在电场中向方向移动。 由于糖磷酸骨架在结构上重复，所以等量的双链DNA具有基本等量的净电荷。 如果正极的电场强度一定、阳离子电泳介质相同，则阳离子电泳速度依赖

7、于核酸分子的大小和配置。 配置相似的分子：分子量越大，移动越慢。 分子量相同的分子(如质粒):cccDNA转移最快，L-DNA次快，ocDNA最慢。 固体支持介质：阿加里肌肉聚亚克力酰胺、固体支持介质形成复杂的网眼结构，DNA通过这些个的网眼到达正极。 分子量小、结构致密的DNA分子容易通过网格，泳动速度也快。 (二)琼脂糖凝胶电泳为从红海藻产物琼脂中提取的线性多糖体多聚体。 阿加里肌肉凝胶：阿加里肌肉凝胶：阿加里肌肉凝胶在阳离子电泳液中加热到沸点溶解，蒸发制冷而凝固成均匀的胶体“蛋白胨”，成为好的阳离子电泳介质。阿加德里肌肉浓度(% )分离DNA的范围(kb )、0.360.620.710.

8、97.26.54.0.13，阿加德里肌肉浓度的高低决定凝胶细孔的大小，浓度越高细孔越小，分辨率越高。 (三)聚丙烯酰胺凝胶阳离子电泳、聚亚克力酰胺：亚克力酰胺与n，N-亚甲基双亚克力酰胺聚合。 过硫酸铵与TEMED存在时，亚克力酰胺单体形成长链，n，n亚甲基双亚克力酰胺的二功能化学基与链末端的自由基反应交联，形成聚亚克力酰胺。 因为中枢神经毒物，请尽量避免接触和吸入！ 过硫酸铵：催化过硫酸铵产生自由基，加速聚合。亚克力酰胺和n，N-亚甲基双亚克力酰胺：在盐化学基条件下产生自由基。 TEMED(N，n，n，N-四甲基乙亚胺):聚亚克力酰胺浓度(% )分离DNA的范围(bp )、3.5千- 200

9、0-5.085-500.0-6.0-40012.0-20015.0-150-20.0-100、聚亚克力酰胺浓度的琼脂糖凝胶电泳分辨率： 6.0，000100bp； 3.5-20%聚丙烯酰胺凝胶的阳离子电泳解析度： 2000至6bp。 (4)阳离子电泳缓冲液、Tris-冰乙酸(TAE) Tris-硼酸(TBE) Tris-磷酸(TPE )、TAE价格便宜但缓冲容量低； TBE和TPE缓冲容量高，分离效果好，而TPE回收DNA片段时磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀。EDTA螯合二价阳络离子，抑制DNase活性，防止DNA的分解。 临时用水为0.5TBE(20倍稀释)，10TBE缓冲液的制备： Tri

10、s碱108g硼酸Boric acid 55g EDTA 9.3g和H2O至1l(ph调整为8.0-8.2 )，(5)核酸电泳的指示剂和染色剂，指示剂：常用溴酚烷、盐化学基性液体中呈紫色在0.6%、1%、1.4%、2%琼脂糖凝胶电泳下，迁移率分别与1kb、0.6kb、0.2kb、0.15kb双点画线DNA片段大致相同。 使样品显色，容易追加样品的指示剂和蔗糖，甘油组成的样品缓冲液。 可以增加样本的比重，形成确保DNA均匀嵌入样本孔的阳离子电泳肉眼可见的指示带，可以预测DNA阳离子电泳的速度和位置。 2、染色剂：核酸阳离子电泳后，不染色不能表现带状。 溴化乙锭染色法银染色法、溴化乙锭(ethidi

11、um bromide，EB )可以插入DNA分子的邻接盐化学基之间，在波长300nm的紫外光下发出红色荧光。 1 )溴化乙染色法：可以将EB直接加入凝胶介质中(最终浓度0.5g/ml )。 阳离子电泳后，也可以在该浓度的溶液中浸泡凝胶进行10-15min染色。 EB与DNA分子结合，不与凝胶结合，DNA分子吸收EB发荧光。 阿加里肌肉凝胶EB染色后，在紫外光下观察，检测出50ng的DNA。 在适当的染色条件下，荧光强度与DNA片段的数目成比例。2、银染色法：Ag与核酸形成稳定的复合物，用还原剂(如甲醛)将Ag还原成银粒子，将阳离子电泳录音带染成黑褐色，用于聚丙烯酰胺凝胶染色。 优点：灵敏度比E

12、B高200倍。 缺点：银染色后，DNA是回收使不得。 聚丙烯酰胺凝胶阳离子电泳银染的结果显示，银染10min、银染15min，三、核酸分子杂交技术，1968年，瓦合成子卡内基学院Roy Britten及其同事发明。 根据：盐化学基的互补性、变性和恢复性，随着温度的下降，变性的双链再次形成互补双链。 在高温下核酸双链分解成两条单链； 利用核酸双链的盐化学基互补、变性和恢复性的原理，以已知的盐化学基序列的单链核酸片段为探针，与测定样品中的单链核酸互补地情侣对戒，判断是否存在互补的同源核酸序列。 (1)核酸探针是指与目标DNA片段特异性互补且具有已知序列的核酸片段。 探针长度一般优选为50-300b

13、p。核酸探针类型：放射性探针非放射性探针、寡聚核苷酸探针、基于对生物简并密码子的喜好合成系列探针、简并性探针的设计依据：参考生物EST(expressed sequence tag )数据库EST :对随机选择的cDNA爱沙尼亚克朗进行5末端和3末端的单序列，得到的cDNA的部分序列表示完整基因的一部分，平均长度为360120 bp。 齐聚物探针的优点：序列短，杂交速度快，专一性强选择在短时间内能够大量制造的单链探针合成，避免了双链探针在杂交中的自我修复性，能够提高杂交效率检测营销对象序列内的1盐化学基的变化。 寡聚核苷酸探针的设计原则：长度18-50bp； G C含量40-60%； 使相同的

14、盐化学基不连续出现(超过4个为要不得)，与非靶序列的70%以上的同源性，或者8个以上的盐化学基序列连续相同，最好不要使用。1、标记种类：前者敏感，而后者保存时间长，无同位素污染。 非放射性：生物素、地高辛、萤光素等。 放射性： 32P、35S、125I等，(2)核酸探针的标识牌、缺口位移法、随机引物延伸法、逆转录标识牌法、末端标识牌法，2、探针标识牌法：1 )放射性同位素元素体：1 )基于1)Klenow酶的三末端标记法：末端标记法，2 )基于TDT的三末端标记法：3 ) 介由T4-PNP的5末端标识牌法：2 )非放射性同位素标识牌：酶促反应标识牌法化学修饰标识牌法、酶促反应促进标记法、1 )

15、标记-dUTP的生成； (例如，bio-1.1-dUTP、Dig-11-dUTP )、bio-1.1-dutp :生物素(Biotin )、Biotin和dutp之间的连接臂的碳链长度。 在1.1 :Bio :各种组织中广泛存在，如果样品自身含有内因性生物素，则会影响结果。 Dig-11-dUTP :digoxigenin；Dig :洋地黄植物花和叶Dig是自然段唯一来源，抗Dig抗体不能与其他生物物质结合，能满足特异标识牌需要。 从洋地黄植物中提取的甾类化合物物质。 地高辛标记：化学修饰标记法利用标记分子上的活化基团和探针分子上的化学基发生的化学反应，使标记直接与探针分子结合。 ABC荧光标

16、识牌：ABC:avidinbiotincomples、ABC显色酶催化剂标识牌：ABC:avidinbiotincomples、(三)核酸分子的杂交分类、测定的核酸样品首先与固相支撑体(硝酸电池里肌肉膜、尼龙膜等)结合，溶液中的特异性测定核酸试样和特异性探针溶解在云同步的单孢杂交液中进行单孢杂交反应。 液相杂交：固相杂交：液相核酸分子杂交、固相核酸分子杂交、预单孢杂交：消除膜对探针的非特异性结合，降低杂交背景。Southern印迹杂交Northern印迹杂交斑点杂交/狭缝杂交菌落杂交原位杂交、常用固相核酸杂交方法：1，Southern印迹杂交是将DNA分子从阳离子电泳凝胶转录到硝酸池里肌肉膜上

17、来进行核酸杂交的实验方法。 1975年由英国爱丁堡高等院校的Edwen Southern成立，被称为Southern blot。 提取DNA样品限制酶催化剂酶催化剂，与琼脂糖凝胶电泳分离NaOH改性DNA转移到膜的预单孢杂交标识牌探针杂交，分析了从显影或显色反应检测单孢杂交信号的结果。 Southern blot的基本过程：用DNA (或RNA )探针检测DNA样本。 水稻叶绿体基因组分别被Bgl II(A-C )、BamH I(D-F )、EcoR I(G-I )、Hind III(J-L )消化，用琼脂糖凝胶电泳分离，与32P标记的玉米psbA探针Southern进行杂交，在x射线负片上出现阳性条纹，tot 2、Northern印迹杂交，1979年、J.C.Alwine等人发展起来，是将RNA分子从阳离子电泳凝胶转移到硝酸池里肌肉膜中进行核酸杂交的实验方法。 因为方法与Southern blot相似，所以被称为Northern blot。 提取RNA样品RNA改性阿加里肌肉凝胶，分析了膜转录的预单孢杂交标识牌探针与单孢杂交放射自显影或显色反应单孢