Car-T细胞培养标准操作流程#优质严选

1、细胞培养的标准操作程序前言：目的：确保细胞的制备和培养符合要求。适用范围：适用于符合实验要求的患者外周血的制备和培养3负责人：实验室人员和临床相关人员。4内容4.1耗材：50毫升离心管、10毫升移液管、5毫升移液管、75平方厘米培养瓶、150平方厘米培养瓶、电生理管和1.8毫升冷冻管4.2试剂：X-VIVE 15TM、PBS缓冲液、75%医用酒精、人淋巴细胞分离液、CD3/CD28免疫磁珠、白介素-2、注射用人血清白蛋白。4.3环境：4.3.1外周血的分离培养应在10000级恒温恒湿层流室中进行，开放操作必须在100级生物安全柜中进行。4.3.2实验室人员应提前对净化室和生物安全柜进行消毒，紫

2、外线照射时间为不少于30分钟。消毒后，净化空调的开启时间不应少于30分钟。只有生物安全柜运行稳定，才能运行。4.4操作：4.4.1收集和接收外周血4.4.1.1的病人符合治疗计划，所有测试都符合要求。收集60-80毫升外周血。4.4.1.2接收外周血并填写外周血采集交接记录，检查外周血患者的相关信息和医院提供的相应检测报告，至少包括乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、抗总蛋白和谷丙转氨酶。4.4.2操作前的准备4.4.2.1净化室和生物安全柜消毒后，打开净化空调运行30分钟，这就是生物安全整个机柜运行稳定。4.4.2.2从试剂室的冰箱中取出细胞培养基，并将其恢复到室温。4.4

3、.2.3生物安全柜表面用75%酒精消毒，外周血袋表面用酒精消毒后转移至安全柜。4.4.3单核细胞的分离(PBMC):4.4.3.1用消毒剪刀剪断血袋的塑料管，或者用一次性注射器放入血袋将外周血转移到50毫升离心管中。4.4.3.2根据1:1用PBS缓冲液稀释外周血，并混合均匀。4.4.3.3在室温下将稀释的血样缓慢加入15毫升人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10毫升移液管吸取血样，将其延伸至分离液液面以上0.5厘米处，自然滑动血样，将其铺在分离液液面上，然后轻轻加入血样，注意不要突破液面。4.4.3.4以1200克(2100转/分钟)离心20分钟，然后缓慢增加和减少。4.4.3.5离心

4、完成后，离心管自下而上呈现明显的分层现象：红细胞层、粒细胞层、菲科尔层、单核细胞层和血浆层。将血浆层吸到距离白色膜层约5毫米的地方，然后丢弃它。小心地将红细胞层以上的所有液体吸入离心管，用PBS稀释，与细胞悬液的体积比应大于1:3，并混合均匀。4.4.3.6以600克(1600转/分钟)离心5分钟，将细胞重悬于PBS中，并计数少量细胞。4.4.3.7以300克(1200转/分钟)离心5分钟，上清液送去进行无菌检查。4.4.4细胞培养：4.4.4.1细胞培养条件：恒温37，CO2浓度5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基酸碱度7.2-7.4。根据细胞计数，将4.4.4.2加入到密度调节为2x106

5、/ml的培养瓶中(T150 200x106/100ml，T75 100x106/50ml，T25 50x106/25ml)。混合均匀，放入CO2培养箱中2小时。4.4.4.3拿出培养瓶，轻轻摇晃，让悬浮在底部的细胞漂浮起来。培养瓶倾斜30度。用移液管吸取培养基并转移到离心管中。在培养瓶中洗涤较少的培养基以收集所有悬浮的细胞，将其均匀混合并计数。根据细胞计数，4.4.4.4将细胞浓度调整为1.2x106/ml，接种培养瓶(T150中100-120毫升，T75中50-60毫升，T25中15-29毫升)，加入CD3/CD28磁珠，并按细胞与磁珠的比例1，333，603加入白介素-1(加入前，磁珠用培

6、养基洗涤3次，取出保存液)。4.4.4.5细胞是邪教根据4.4.4.9的细胞状况和临床治疗需要，经过9天的培养，细胞数量达到要求，各项检测均合格。包括无菌检查、内毒素检查、细胞活力、细胞表型等。4.4.5汽车T细胞采集：4.4.5.1证实所有细胞测试都符合要求。根据治疗方案(一般一个疗程分为多次回输，间隔一天)，在4.4.5.2取出相应的细胞悬液，剩余细胞补充培养基进一步回输。将4.4.5.3细胞悬浮液转移到离心管中，并在300克离心5分钟。4.4.5.4去除上清液，稀释并与PBS缓冲液混合，以300克离心5分钟，弃去上清液，在PBS缓冲液中以300克/分钟离心5分钟。4.4.5.5细胞装袋(一般静脉回输，采用100毫升双阀生理盐水袋)，离心后取上清液，进行无菌检查。将细胞重悬于20毫升生理盐水中，用100m细胞滤器过滤，取少量细胞悬液进行细胞计数、细胞活力、革兰氏染色和内毒素检查。细胞过滤完成后，将其转移至100毫升生理盐水袋中，加入5%的人血白蛋白进行注射，贴上标签，并填写相关记录。4.5细胞运输和保存：4.5.1检查单元格标签的内容，并填写退发记录。4.5.2将细胞盐水袋放入运输容器中(一般为疫苗盒，4度)，并填写交接记录表。4