病毒检验技术#医者仁心

1、第17章病毒检测技术，本章内容，学习目标和重点，学习目标：掌握病毒标本采集和检验应遵循的原则；病毒检查和鉴定的常用技术熟悉病毒血清学诊断的常用方法了解病毒感染的实验室快速诊断了解病毒培养的基本操作本章重点介绍病毒标本采集和运输的原则。病毒学诊断和鉴定的常用方法。病毒培养的基本操作。病毒学检验技术是对临床和流行病学样本(如人或宿主的血液、组织、尿液、粪便和组织液等)进行定性和定量的病毒学分析。)通过实验室检查方法，从而为病毒性感染和病毒性疾病的诊断、治疗和预防提供科学依据。检验程序包括标本采集、分离、培养和鉴定以及快速诊断。第一节标本的收集、处理和运输；第一节标本的收集和处理；收集时间：在疾病的

2、早期或急性期尽快收集。在许多急性病毒感染中，病毒在症状出现之前就已经被释放，并且病毒数量在症状的初始阶段迅速达到峰值，然后逐渐减少，直到疾病被治愈，但也有例外。第一节标本的收集、处理和运输；1.标本的收集和处理；2.收集地点：这取决于临床症状和疑似病毒。从病原体侵入部位取样，从病原体感染的靶器官取样，根据病原体的排泄途径从环境中取样，如流感病毒感染、鼻咽拭子乙型脑炎病毒感染、脑脊液轮状病毒感染、粪便乙型肝炎病毒感染、血液，第1节标本的收集、处理和运输，第1节。标本的采集和处理，采集期间的无菌操作，可添加抗生素杀灭杂菌；2.标本的运输和保存。尽快将标本送去检验，进行冷冻、冷藏、防漏、专人和标记；

3、2.标本的保存-70可以保存很长时间。可以加入甘油或二甲基亚砜、汉克斯溶液或小牛血清来防止病毒失活。第一节标本的采集、处理和运输，采用不同的病毒分离方法，主要有细胞培养法、鸡胚培养法、动物接种法等。但是对细胞和鸡胚不敏感且没有合适的动物模型的病毒可以采用基因克隆的方法。第二节病毒分离与鉴定、第一节病毒分离与培养、第二节鸡胚培养、第二节病毒分离与鉴定、原代细胞培养、二倍体细胞培养、传代细胞培养、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种、组织细胞培养、鸡胚培养和动物接种是培养分离的活组织块或分散组织细胞的技术通称，是病毒分离与鉴定中最常用的基本方法。(1)组织细胞培养，鸡成纤维细胞，Hep-2细胞，

4、细胞培养瓶，Vero细胞，第2节病毒的分离和鉴定，1。原代细胞原代细胞是指取出体外后立即培养的细胞。原代细胞培养是指细胞、组织和器官直接从体内取出后立即进行的培养。因此，严格地说，它指的是成功传代前的培养，此时细胞保持了原始细胞的基本特性，如果它们是正常细胞，它们仍然保持二倍体数目。2.二倍体细胞是指原代细胞在体外分裂50代后仍能保持其双倍染色体数目。二倍体细胞系来源于正常的人胎儿组织，主要用于培养病毒和制备疫苗。3.传代细胞来源于肿瘤细胞或在细胞系传代过程中突变的细胞的传代细胞被称为传代细胞，它可以在体外无限期传代。大多数是肿瘤细胞或突变二倍体细胞。常用的传代细胞系包括Hela细胞(人宫颈癌

5、细胞)、Hep-2细胞(人喉上皮癌细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)等。2.鸡胚培养，第二节病毒分离与鉴定鸡胚培养是一种培养对鸡胚敏感的动物病毒的方法，可用于分离病毒一般选择914天龄的鸡胚，具有来源丰富、组织分化程度低、病毒和细菌少、无抗接种病毒抗体、病毒易增殖等特点。2.鸡胚培养，优势：在第二节，病毒分离和鉴定中，选择不同的接种部位是病毒分离成功的关键。常用的有：尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种和绒毛尿囊膜接种。第二部分，病毒的分离和鉴定，不同病毒在鸡胚不同部位的生长特性有很大不同。2.鸡胚培养、尿囊接种、羊膜腔接种、尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种，常用于流感病毒

6、、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养，也常用于临床流感病毒的初始分离。第2节病毒分离与鉴定、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种、卵黄囊、绒毛尿囊膜、人工气室。鸡胚培养，主要用于虫媒病毒、衣原体和立克次体的分离和繁殖。常用于痘苗病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离，卵黄囊的分离和鉴定、第二节病毒，3。动物接种，常用的实验动物包括小鼠、乳鼠、豚鼠、兔、猴和鸡等。包括皮下、皮内、腹腔、静脉、角膜、鼻腔和脑接种等。2.病毒增殖的观察(1)细胞中病毒增殖的鉴定指数1。细胞形态学2的变化。红细胞吸附3。细胞培养基ph值的变化(2。病毒数量和病毒传染性的测定。血凝试验2。中和试验3。斑块形成测试4。中位感染

7、剂量(ID50)和组织培养中位感染剂量(TCID50)。第二节。病毒分离和鉴定。第二，病毒增殖的观察(1)细胞内病毒增殖的鉴定指标(1)细胞毒性效应(CPE)，第二节病毒分离与鉴定，正常细胞毒性细胞是指一些病毒，特别是无包膜病毒感染组织细胞后，正常生长的梭形细胞，变圆、变性、坏死、溶解并从培养瓶壁脱落。第二部分是病毒的分离和鉴定。(2)多核巨细胞，1细胞形态改变，多见于包膜病毒，如呼吸道合胞病毒、麻疹病毒等。被感染细胞融合形成多核巨细胞。(3)包涵体，1细胞形态改变，部分病毒感染宿主细胞后，细胞内出现光学显微镜下可见的蛋白质结构。一般来说，它是由完整的病毒颗粒或尚未组装的病毒亚单位组成的，称为

8、包涵体。在第二部分，病毒的分离和鉴定，2在红细胞吸附一些病毒感染的细胞后，病毒基因编码的糖蛋白可以嵌入细胞膜，其中一些可以吸附特定种类的红细胞，或者在刮去细胞培养单层后，经过适当的处理，它们可以凝集特定种类的红细胞，这些糖蛋白在细胞表面形成尖峰，称为血凝素。3.细胞培养基的酸碱度发生变化；2.观察病毒增殖。病毒感染细胞后，细胞代谢发生变化，导致培养基的酸碱度发生变化。第二节病毒分离和鉴定，(2)病毒数量和病毒感染性测定，(2)病毒增殖观察，(1)血凝试验，病毒颗粒，红细胞，某些病毒(如流感病毒)表面的血凝素(HA)可引起人或某些哺乳动物红细胞凝集，因此用这种病毒感染细胞后收集的病毒溶液以不同方

9、式稀释， 在第二节病毒分离与鉴定中，能完全凝集红细胞的病毒的最高稀释因子是病毒的血凝滴度，即1个血凝单位(HAU)， 在第二部分，病毒分离和鉴定中，如果病毒特异性抗体首先加入到病毒溶液中，抗体将与病毒表面的抗原特异性结合，从而抑制病毒与抗原的结合第二节病毒分离和鉴定，第二节中和试验(nt)将病毒和特异性抗体的混合物在体外孵育，使病毒和抗体相互反应，然后将混合物接种到敏感宿主体内，观察培养后CPE或红细胞吸附是否消失，即特异性抗体是否中和相应的病毒，从而测定残留病毒的传染性，第三节菌斑形成试验，第二节病毒分离和鉴定，这是一种检查和准确测定病毒滴度的方法。将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒

10、被吸附后，被一层融化的半固体营养琼脂覆盖，使病毒在单层细胞培养中扩散。结果是，每种传染性病毒都能在单层细胞中产生有限的感染病灶。当用活性染料(如中性红)染色时，活细胞将被染色，而被病毒感染损伤的细胞将不会被染色，形成可见的斑块。每个斑块都是由传染性病毒颗粒形成的，称为斑块形成单位(PFU)。病毒悬液中传染性病毒的滴度可用PFUml表示。4中位感染剂量(ID50)和组织培养中位感染剂量(TCID50)用于确定感染鸡胚、动物或细胞后导致50%死亡或病理变化的病毒的最小量。它用于估计病毒感染的程度，但不能准确确定传染性病毒粒子的数量。第2节病毒分离和鉴定，第3节病毒学检测和诊断，1。形态学检查和诊断

11、。光学显微镜观察：*直接观察到大的病毒体(如痘病毒)*包涵体狂犬病病毒感染-嗜酸性包涵体巨细胞病毒感染-“猫头鹰眼”样趋向性2。电子显微镜：*透射电子显微镜用于观察病毒的大小、形态和结构以及细胞的超微结构等。*扫描电子显微镜用于观察病毒和细菌的表面结构和附属结构，1。形态学检查和诊断、扫描电镜、第3节病毒学检测和诊断、第3节病毒学检测和诊断、(1)标本制备、超滤、超速离心、细胞快速增殖、免疫凝集、(2)阴性染色、超薄切片和免疫电镜，这些是常用的观察方法。病毒颗粒有亮度，在黑色背景上显示亮点。这个过程类似于病理切片。免疫组化与电镜、透射电镜相结合，第三节病毒学检测与诊断，第二节血清学检测与诊断的原理：用已知病毒抗原检测患者血清中的抗体水平或用已知病毒抗体直接检测标本中的病毒抗原1。病毒抗原检测：用荧光素、酶或胶体金标记病毒抗体，检测标本中相应的病毒抗原。例如，通过酶联免疫吸附试验检测乙型肝炎表面抗原，第3节中的病毒学检测和诊断，以及检测病毒抗体：众所周知，大多数病毒抗原是通过基因工程技术制备的重组抗原，其次是从患者样品中分离和纯化的抗原。抗体类型的检测