第二章色谱法分析原理（邹）

1、第二章 色谱法原理（Principles of Chromatography）,第一节 色谱法及其分类 第二节 色谱流出曲线及有关术语 第三节 色谱法分析的基本原理,第一节色谱法及其分类,一、色谱法 定义：是一种分离分析方法 利用各组分在两相中的分配系数不同，当两相作相对运动时，组分在两相中作反复多次的分配，达到分离的目的。 例：GC，PC，TLC，HPLC，等,历史,A：1903年华沙自然科学学会生物学年会 俄国：M.Tswett 固定相：CaCO3 流动相：石油醚 样品：植物绿叶的色素 1906年 命明为色谱法 （chromatography）,历史,B 1931年R.Kuhn重复了上述实

2、验分离样品为类胡萝卜素 离子交换色谱法 纸色谱法 薄层色谱法,历史,C 1940年，瑞典科学家：提出吸附液相色谱法 d：1941年，Martin，提出分配色谱法， 创立了-气-液色谱法，提出了塔板理论， 气相色谱有了大幅度的发展。 e：50年代， GC中，FID ，ECD，TCD的发展 f：1956年，Van Deemter提出速率理论 g：60年代，HPLC出现 h：近几十年，数据处理系统，联用技术,二、色谱法分类,1按两相状态分类 气相色谱法GC 气固色谱 气液色谱 液相色谱法LC 液固色谱 液液色谱,2按固定相的形式分类,柱色谱 填充柱色谱，填充柱 开管柱色谱，毛细管柱 平板色谱 纸色谱

3、 薄层色谱法,3按分离的原理分类,分配色谱： 如GC中 气-液色谱，HPLC中液-液色谱 吸附色谱： 如GC中 气-固色谱，HPLC中液-固色谱 也就是说，固定相:a: 固-吸 b：液-分,4按动力学过程分类,洗脱法： 组分在流动相中的溶解能力不同而分离。又名冲洗法。 顶替法： 组分在固定相上的吸附和溶解能力不同，吸附溶解能力差的成分先出峰。 迎头法： 样品连续经过固定相，极性弱的先出峰。,5按固定相的不同材料进行分类 方法 固定相 离子交换色谱法（LEC） 离子交换剂 凝胶色谱法（SEC） 多孔固体 键合色谱法（BPC） 键合固定相 液固色谱法（LSC） 固体吸附剂 液液色谱法（LLC） 液

4、体 纸色谱法（PC） 纸纤维中水 薄层色谱法（TLC） 吸附剂 气固色谱法（GSC） 固体 气液色谱法（GLC） 液体,根据以上所述，将色谱法的分类总结于表l中。,第二节 色谱流出曲线及有关术语一色谱流出曲线,1定义： 被分离的组分经过检测器将浓度讯号转换成电讯号，并记录下来，得到讯号随着时间变化的曲线，称为色谱流出曲线。,以洗脱法为例,流动相对固定相的亲和力比其他任何组分要弱， 当样品进入， 各组分随着流动相的移动在两相之间反复地进行 溶解，挥发，吸附和解吸附的过程。 分配系数不同， 就有可能达到分离。 分配系数大的组分，滞留固定相的时间长，移动速度慢，后流出。 分配系数小的组分，滞留固定相

5、的时间短，移动速度快，先流出。,色谱流出曲线,如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用Gauss正态分布函数表示：,式中：C不同时间t时某物质的浓度，C0进样浓度，tr保留时间，标准偏差。,二、基线,是柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值 稳定的基线应该是一条水平直线 基线与：检测器、流动相、体系洁净、仪器的脉动等因素有关。 三、峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图中BA,四、保留值,1死时间tM 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图中 OA。,tM的影响因素,与 柱前后连接管道 柱内空隙

6、体积的大小 流动相的流速 等因素 有关。,平均线速,因为这种物质不被固定相吸附或溶解， 故其流动速度将与流动相的流动速度相近 测定流动相平均线速时， 可用往长L与tM的比值计算。,2保留时间tR 试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间， 如图3 OB它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间,tR的影响因素,：与组分性质、流速、流动相、固定相有关。,3调整保留时间tR 某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间，即 tR = tR-tM,tR包含了 组份在流动相中所需的时间， 组份在固定相中滞留所需的时间， tR实际上是组份在固定相中停留的总时间,保留时间的单位、

7、影响因素,保留时间可用时间单位（如s）或距离单位（如cm）表示。 保留时间和保留体积 保留时间是色谱法定性的基本依据， 但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响， 因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定,4死体积 VM 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和 当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速F0（Lmin）计算： VM = tMF0,5保留体积 VR 指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间的关系如下： VR = tRF0,F0为在一定的柱温和柱压下，柱

8、出口流量 在HPLC中直接测定 在GC中用皂膜流量计测定、校正,6调整保留体积VR,某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即 VR = VR- VM,7相对保留值2.1 某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比，称为相对保留值：,由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关， 而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据 必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比 .,8选择因子 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值此时，ri/s可能大于1，也可能小于1在多元混

9、合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数在这种特殊情况下，可用符号表示：,式中tR2为后出峰的调整保留时间，所以这时总是大于1的 。,五、区域宽度 度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：,1. 标准偏差 即0607倍峰高处色谱峰宽的一半，如图3中EF距离的一半。 2. 半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽，如图3中GH间的距离它与标准偏差的关系是： W1/2 = 2.354,3. 基线宽度W 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图3中IJ的距离它与标准偏差。的关系是： W = 4,从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：,（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品

10、中所合组 份的最少个数 （2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析 (3) 根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析 （4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据 （5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据,第三节 色谱法分析的基本原理,色谱分析目的：将样品中各组分彼此分离。 组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远。 决定因素分配系数的， 即热力学性质有关。 但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽， 以致彼此重叠，还是不能分开。 这些峰的宽或窄是传质和扩散行为决定的， 即动力学性质有关。 因此，要从热力学和动力学来研究色谱行为。 热力

11、学因素 动力学因素,一、分配系数K和分配比k,1分配系数K 它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即,在温度与压力变化的情况下,在一定的温度和压力下K是常数。 在温度变化的情况下，lnK=-rGm/RTc rGm标准状态下自由能 R气体常数 Tc柱温,2.分配比k,分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即,分配容量或容量因子。,k 值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。,k 的影响因素,k 值也决定于组分及固定相热力学性质。 它不仅随柱温、柱压变化

12、而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。,k 的影响因素,式中CS，Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度； Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。 Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。要求真正参与分配，吸附 吸附剂吸附表面积 固定液固定液体积 离子交换剂离子交换容量 凝胶凝胶孔容,3滞留因子Rs（保留比）,分配比k值可直接从色谱图测得。 设流动相在柱内的线速度为u，组分在柱内线速度为us，由于固定相对组分有保留作用，所以usu此两速度之比称为滞留因子Rs。,4.K与Rs 的关系式 Rs若用质量分数表示，即,K大、k大、 Rs小、后出峰 K小、k小、 Rs大、先出峰

13、 对组分和流动相通过长度为L的色谱柱，其所需时间分别为,5.整理上式，可得 基本保留方程式,用时间来表示 用保留体积来表示,6. 分配系数K与分配比k的关系,其中称为相比率，它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其值一般为635；对毛细管柱，其值为60600。,7分配系数K及分配比k与 选择因子的关系,选择因子（相对保留值）。根据上式，对A、B两组分的选择因子，用下式表示,上式表明： 通过选择因子把k与K直接联系起来， 对固定相的选择具有实际意义。 如果两组分的K或k值相等，则=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。 两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。 因此两组分具有

14、不同的分配系数是色谱分离的先决条件。,8.保留指数,柯瓦指数，是国际公认的正构烷烃作为系列标准物 式中： 被测物质的保留指数 被测物质的调整保留时间 具n个碳正构烷烃调整保留时间 t具n+1个碳正构烷烃调整保留时间,二、塔板理论 最早由Martin等人提出塔板理论， 把色谱柱比作一个精馏塔， 沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为， 同时引人理论塔板数作为衡量柱效率的指标。,1该理论假定： （i）板高内迅速达到平衡 （ii）载气（流动相）进入不是连续进行的， （iii）组分开始时存在于第0号塔板上，无扩散 （iv）分配系数是常数,2流出曲线性质：流出曲线正态分布 由塔板理论可建流出

15、曲线方程：,m为组分质量，Vr为保留体积，n为理论塔板数。,3浓度极大值的意义当V=Vr 时，C值最大，即,4理论板高计算公式的来源由流出曲线方程可推出：,而理论塔板高度（H）即：,从上两式可以看出，色谱峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指标。 通常填充色谱柱的n103，H1mm。而毛细管柱 n=105-106，H0.5mm,由于死时间tm包括在tr中,而实际的tm不参与柱内分配,所计算的n值尽管大,H很小,但与实际柱效能相差甚远.所以,提出把tm扣除,采用有效理论塔板数neff和有效塔板高Heff评价柱效能。,5有效理论塔板数neff （N）,6 n与N的关系,说明；主要是由容量因子k在起作用 如k大，则N与n的差别就小 如k小，则N与n的差别就大