案例二第一组ppt.ppt

1、问题,作为疾控中心检验人员，应该如何应对此次爆发,列出案例二中与检验人员有关的案例要点： 患者共同暴露史的婚宴举行于11月9日 目前为止的7名患者出现症状时间为11月9-11日 检验人员到达现场时间为11月13日 该县已经采集了7例患者的粪便标本送往实验室检测以明确诊断。,一.初步分组，制定采样方案,检验科应分为两组： 一组应尽快检验已送检的七份新鲜病人的粪便样本，以确保样品的检验质量和代表性，以防前去现场采样的检验组由于各种客观原因（如：病人已服用抗生素）而未采集到新鲜的代表性样品或途中样品不慎损失污染。,另一组检验人员按照制定好采样方案迅速开始样品采集的工作： 本小组讨论后认为检验人员所需

2、采集样品： 婚宴承办处的餐饮从业人员的粪便或肛拭标本、手部涂抹标本 婚宴承办处厨房内的所有餐具刀具的涂抹标本 婚宴承办处的剩余水样、食物、食材或现有水样、食物、食材 病人的粪便、肛拭子、呕吐物。 根据时间线索，第一份血清已可进行采样，第二份血清待发病15-20天时再次采集,注意： 以上中提到的样品由于时间问题或服用抗生素原因，代表性较小，仅作参考，若检测结果为与患者症状有关的致病菌阳性才具有重要参考性，但若为阴性，不能排除与患者疾病的爆发有关。 中的两份血清样品的检验结果结合之前送检的新鲜样品的检验结果为确证实验,二.样本采集,水样便或呕吐物取1-3 mL； 成形便取指甲大小； 肛拭子进行肛拭

3、； 水样500mL； 涂抹标本以3-5支无菌棉拭子涂抹后为一件； 食品 ：液体：250 mL；固体：25-50克,三.所采样品的送检,样品采集后应立即送检。 若不能立即送检，应保存于PH8.8-9.0的碱性蛋白胨水中尽快送检。标本与保存液比例约为1：5。 24小时以上才能送检的标本，应使用文一腊二氏保存液保存。,四.检验程序,五.检验步骤,（一）快速辅助诊断：其结果只是初步报告，不是确诊报告。 动力及动力抑制试验： 如是急性期病人的水样便，则用接种环或滴管取1滴水样便在玻片上然后盖上盖玻片，直接用暗视野显微镜观察动力；或加生理盐水1滴在玻片上，用接种环取较干的粪便1 环放置生理盐水中研匀，盖上

4、盖玻片直接用暗视野显微镜观察动力；高度可疑的标本可取已增菌的碱性蛋白胨水1滴在玻片上然后盖上盖玻片，直接用暗视野显微镜观察动力。如在镜下见到穿梭样运动（象夜空中的流星）即动力试验阳性，否则阴性。, 动力试验阳性的标本，则取O1和O139群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体各2滴放置玻片上，取标本1滴或1环放在其中研匀，盖上盖玻片，用暗视野显微镜观察是否有原来的穿梭样运动，如穿梭样运动已迅速停止并凝集成块状即动力抑制试验阳性，否则阴性。,动力试验和动力抑制试验结果可口头初步报告，但不是确诊报告。双阳时口头报告：高度可疑。,（二）分离培养 1. 粪便、呕吐物和肛拭子：对急性期病人水样便标本在碱性蛋白胨水增菌

5、培养的同时，可用接种环取一满环或用棉拭子直接接种在庆大霉素琼脂培养基上；所有病人标本都应接种碱性蛋白胨水增菌培养。37增菌68h后，从菌膜下表层取一接种环培养物，把接种环在试管壁上轻轻碰一下，待接种环上留有残液后划线接种庆大霉素琼脂培养基，划线时接种环在基线处反复多次划线以接种的菌液干了为准，最后用接种环从基线处开始不间断划线到完成或四区划线（必须保证结果划出单个菌落）。37培养，18h-24h。必要时（高度可疑或服药的病人）可取第一次增菌液1 mL转种于8-10mL碱性胨水管中37二次增菌培养68h后做分离。,2.水样、液体食品样品：取450mL样品，用1mol/L氢氧化钠调整至pH8.8-

6、9.0。 然后加 10倍浓缩碱性胨水50mL。为抑制杂菌可再加入1%亚碲酸钾0.25 mL和1000单位/ mL青霉素1 mL。37培养过夜划线接种庆大霉素琼脂培养基，接种划线方法同粪便等样品。 培养时把瓶盖打开三分之一。培养后取菌膜下表层培养物0.2-0.3 mL接转种于10mL碱性胨水管中作二次增菌，37培养68h，再划线接种庆大霉素琼脂培养基，37培养18-24h。接种划线方法同粪便等样品。,3.涂抹标本：使用无菌棉签涂抹35只以上水生动物表面、腮部及泄殖腔或食品、餐饮人员、餐具等表面，直接接种到10 mL碱性蛋白胨水，37增菌培养812h，划线培养。 同时取菌膜下表层培养物接种庆大培养

7、基分离培养，同样的菌膜下培养物再吸0.20.1 mL转种于10mL碱性胨水管中作二次增菌，37培养812h再划线接种庆大霉素琼脂培养基，37培养18-24h。接种划线方法同粪便等样品。,4.固体食品样品：取25-50克标本放入碱性胨水中增菌培养，标本与碱性胨水的比例为1：5。增菌培养方法与以上水样及液态食品相同。,（三）增菌培养后，确定可疑菌落,每一庆大霉素琼脂平板上各挑取9-10个可疑菌落，（少于9个的全部挑取）做革兰染色镜检和玻片凝集试验进行鉴定。 可疑菌落的形态：略带青灰色、半透明、扁平、微隆起、光滑湿润。如延长培养时间或室温放置到48h，菌落略带黄色，中心形成黑色金属碲沉淀。 镜下革兰

8、染色阴性，菌体弯曲或直的短杆菌，呈弧形或逗点状，单鞭毛。,（四）鉴定分型,1 玻片凝集试验： 01、0139群霍乱弧菌初步鉴定：挑取上述可疑菌落与01群、0139霍乱弧菌单克隆抗体 做玻片凝集试验。如可疑菌落很快(一般在10s内)出现肉眼可见的明显凝集颗粒，在生理盐水中不凝集者判为阳性。均为阴性时方可报告：样品中未检出01、0139群霍乱弧菌。 分纯：用接种环取抗原抗体复合物接种于普通营养琼脂板上分纯，37过夜培养。,复核及分型：挑取分纯后的可疑菌落和纯培养物。 01、0139群霍乱弧菌用诊断血清和单克隆抗体复核。 01群霍乱弧菌分型使用小川型及稻叶型的单价血清和单克隆抗体做玻片凝集反应，同时

9、用生理盐水做对照。 与小川型单价血清和单克隆抗体凝集、与稻叶型单价血清和单克隆抗体不凝集者为小川型。 与小川型单价血清和单克隆抗体不凝集、与稻叶型单价血清和单克隆抗体凝集者为稻叶型。 与小川型、稻叶型单价血清和单克隆抗体均呈明显凝集者为彦岛型。,PCR技术测定霍乱毒素基因，从而辅助鉴定O1群菌种。,2.氧化酶试验和菌种保存： 取纯单个菌与相应的血清和单克隆抗体，进一步验证鉴定的结果，此结果凝集阳性者做氧化酶试验。 氧化酶试验时应注意：不要用过期试剂和金属铁质的接种针（环）。 此次氧化酶试验阳性者，做出确诊霍乱的报告。 同时，需保存此菌种：用接种环取单个菌落穿刺半固体培养基中，底部1/3以下不必

10、穿刺。37过夜培养，换胶塞密封室温保存。,（五）血清学检查,血清学检查适用于有典型霍乱症状但粪便霍乱弧菌培养阴性者。有助于流行病学追溯诊断，检查的成分为抗菌抗体。为进行血清学诊断，需要采取病人的双份血清，在发病第13 天采第一份血清，第1520 天采第二份血清。 检查血清中抗菌抗体常用凝集试验和杀弧菌试验 杀弧菌试验比凝集试验敏感。,1.试管凝集试验： 用生理盐水 对倍 连续稀释待检血清，每管含稀释血清0.5mL。将标准菌在营养琼脂上的1618h 培养物用0.2福尔马林生理盐水制成约含18 亿菌/mL(相当于细菌标准比浊管浓度)的悬液，每稀释血清管加0.5mL；另将菌悬液加入0.5mL 生理盐

11、水中作对照。摇匀，置37 3h 观察初步结果，再放冰箱(4)或室温过夜，观察最后结果。生理盐水对照不出现自然凝集，能使菌凝于管底成伞状，上清半透明者判为，以能使菌呈凝集的血清最高稀释度判为血清凝集效价。 第二份血清效价比第一份血清增长4 倍或以上者有诊断意义。,2.杀弧菌抗体检测：可采用改良微量法，检测程序如下： 2，3，5氯化三苯四氮唑溶液(TTC)的配制：用无菌蒸馏水配制0.5(W/V)溶液，加热溶解，置灭菌棕色瓶中，4保存备用。 补体指示菌混悬液制备：选取标准01 群及0139 群霍乱弧菌为指示菌，分别连续在营养琼脂平板上分离2 次，选取光滑型菌落23 个，挑取小量接种于5mL 营养肉汤

12、中，37培养6h，取0.1mL 转种于5mL 营养肉汤，37培养2h，用分光光度计测定492nm 吸光度(OD)值，调整OD 值至0.1 为原液。将原液作150稀释后与110 补体等量混合，即为补体指示菌混悬液。,待检血清稀释：于经洗涤处理、无水乙醇浸泡5min 和紫外灯照射灭菌1h 的微量培养板或410 孔聚苯乙烯塑料板用微量加液滴管每孔加入一滴(0.025mL)灭菌磷酸盐缓冲盐水PBS 或生理盐水，再将待测灭活血清一(0.025mL)加入每排的第1 孔，自第1 孔开始作连续对倍稀释至第10 孔。 加补体指示菌悬液：于每孔稀释血清加入补体指示菌悬液一滴，加盖，在微型振荡器上振荡12min，置

13、37水浴箱孵育30min。 加TTC 营养肉汤：每孔加入含0.01TTC 的营养肉汤0.15mL(2 大滴)，混匀后，继续置37水浴箱孵育4h。,观察结果：以孔内无颜色变化的血清最高稀释度为被检测标本的杀弧菌抗体滴度，第二份血清效价比第一份血清升高8 倍或以上者有诊断意义。,六.实验室质量控制,1. 用接种环取完标本、诊断血清、做完每一份标本实验等，接种环应严格在酒精灯火焰上消毒，避免交叉污染。 2. 玻片凝集试验阳性时，一定同时做生理盐水对照。在生理盐水中不凝集者，方可判断为阳性。 3. 标本、增菌管、培养平皿要严格编号，标识清晰，避免结果错报。 4. 诊断血清、培养基保存在指定温度范围内；诊断血清要在有效期内使用，培