专题5DNA和蛋白质技术

1、专题五 DNA和蛋白质技术,课题1 DNA的粗提取与鉴定课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片断课题3 血红蛋白的提取和分离,课题1 DNA的粗提取与鉴定,一、提取DNA的方法,1、提取生物大分子的基本思路 （1） 选用一定的_或_方法分离具有 不同物理或化学性质的生物大分子。 （2） DNA的粗提取就是利用DNA与_、_和_等在物理或化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。,物理,化学,RNA,蛋白质,脂质,（1）利用DNA的溶解性 DNA的溶解度,2、提取DNA分子的基本原理, DNA不_酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则_酒精。利用这一原理，可将DNA与蛋白质进一步分离。,溶于,溶于,

2、蛋白酶能水解蛋白质，但对_没有影响。 大多数蛋白质不能忍受_的高温，而 DNA在80以上才会变性。 洗涤剂能够瓦解_，但对_没 有影响。,温度,洗涤剂,DNA,60-80,细胞膜,DNA,（2）利用DNA和蛋白质对酶、_和_的耐受性不同,（3）DNA的鉴定： DNA在沸水浴的条件下，遇_反应会 呈现_,二苯胺,蓝色,二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计,（一）实验材料的选取,材料：新鲜的鸡血,注意： 本实验中，要往鸡血中加入抗凝剂（柠檬酸钠溶液）,原则上只要含DNA的生物材料都可以，但是选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。,(1)先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞 (2)在鸡血细胞中加入

3、一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅 拌，过滤后收集滤液即可,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、破碎细胞,讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 利用了什么原理？,2、过滤，获取含DNA的滤液,（三）去除滤液中的杂质,讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开； 方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐

4、受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离 方案二利用了酶的专一性；方案三利用了DNA的稳定性。,（四） DNA的析出与鉴定,DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95），静置2-3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水,1、DNA的析出,A:2mol/L 的NaCl溶液5ml + DNA丝状物 + 二苯胺试剂4ml B:2mol/L 的NaCl溶液5ml + 二苯胺试剂4ml 混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色,2、D

5、NA的鉴定,以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长,1、鸡血细胞做实验材料的原因,鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得,2、实验原理, DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14 molL时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。, DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。, DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作

6、为鉴定DNA的试剂。,实验材料和用具,实验材料： 1、鸡血细胞液（510ml）； 2、体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）； 3、蒸馏水； 4、质量浓度为0.1g/ml的柠檬酸钠溶液（抗凝剂） 5、物质的量浓度分别为2mol/L和0015mol/L的NaCl溶液； 6、二苯胺试剂,答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中,讨论：,（2）观察丝状物呈什么颜色？,答：白色,（1）为什么要加50mL的冷酒精？,答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色,（4）这一鉴定结果说明什么问题？,（3）比较两个试管中溶

7、液的颜色有什么不同？,答：提取出的丝状物是DNA,（5） DNA的直径约为2010-10 m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？,答： DNA分子直径只有2 nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的,答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，六次搅拌”,总结：,两次蒸馏水,第一次：使鸡血细胞吸水胀破，提取核DNA 第二次：稀释NaCl溶液，使DNA黏稠物析出,（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次搅拌？,三次过滤,第一次： 过滤核外物质，除去不溶的杂质 第二次： 过滤除DNA的其他核内物质，尤其是蛋白质 第三次： 过滤含DNA的NaCl溶液，得到滤液,六次搅拌：

8、,DNA的溶解,均匀稀释以析出更多DNA,DNA的溶解,含杂质较少的DNA,DNA的溶解,观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备,四、课题成果评价,（一）是否提取出了DNA,本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质,（二）分析DNA中的杂质,课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片断,DNA分子的结构,C、H、O、N、P,1.元素组成：,脱氧核苷酸,2.基本单位:,3.DNA分子的双螺旋结构,（1）DNA分子是由 的（脱氧核苷酸长链盘旋而成的

9、规则 结构。,（2） 与 交替连结，排列在外侧，构成基本骨架； 排列在链的内侧。,（3）两条链上的碱基通过 连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与 配对， 一定同胞嘧啶配对。,双螺旋,两条反向平行,脱氧核糖,磷酸,碱基,氢键,胸腺嘧啶,鸟嘌呤,4.DNA的复制,b.时期,有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。,c.场所,细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。,a.概念,由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。,d.基本条件,酶:解旋酶、DNA聚合酶 能量:ATP 原料:四种脱氧核苷酸 模板:DNA的两条链,一、PCR技术,是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DN

10、A为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。,（1） 3端和5端：为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基（OH）末端称为_，而含_的末端称为_；一个双链DNA分子中含两个3端和两个5端，如果一条链的方向是_，则另一条链的方向就是_，这就是反向平行的含义。,3端,5端,磷酸基团,53,35,1、PCR扩增方向,（2） DNA分子中相邻两个脱氧核苷酸残基通过 _相连，该化学键是由一分子脱氧核苷 酸中3号碳原子上的羟基（OH），与相邻的另一分子脱氧核苷酸中5号碳原子上的磷酸基团脱水聚合而成。所以DNA的合成方向总是从子链的_向_延伸。,35磷酸二酯键,5端,3端,2、PCR技术原理 （1

11、）PCR： DNA分子在一定条件下可以进行 _复制。,（2）DNA的热变性原理： 在_的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为_；当温度缓慢下降后，两条被分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为_。,体外,80-100,变性,复性,二、PCR的反应过程,DNA模板,与模板DNA两条链相结合的两种引物,1、反应条件,稳定的缓冲液环境,四种脱氧核苷酸,耐热的DNA聚合酶,严格控制温度变化的控温设备,第一步：变性（90-95）,2、反应过程,3、结果（P60页图5-9复制结果）,（1）PCR的每一轮循环包括变性、复性和延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也做模板参与

12、反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸。这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的DNA序列呈_。,指数扩增,（2）PCR一般要经历三十多次循环，处于两引物间固定长度的序列数目约为_。,230,1、PCR仪,（一）.设备及用具,实质上一台能够自动调控温度的仪器。,三、PCR的实验操作,2、微量离心管,一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml,3、微量移液器,用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。,1.准备,2.移液,（二）实验操作步骤,按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。,用微量移液器按照

13、PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。,混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。,3.混合,（1）过程：将微量离心管放在离心机上,离 心约10s。,4.离心,（2）离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。,将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。,5.反应,PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤变性、复性和延伸.,PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：,6.注意事项,（1）隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓 冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；,（2）分装试剂，简化操作程序，使

14、用一次性枪 头,（一）、理论上DNA扩增数目的计算,三、课题成果评价,1.一条DNA，复制n次，DNA为2n,2.a条DNA，复制n次，DNA为a2n,（二）、实验中DNA含量的测定,1.原理,可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。,2.过程,（1）稀释,2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释.,以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。,取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值,DNA含量(g)50(260nm的读数)稀释倍数,50：在

15、标准厚度为1cm比色杯中，OD260为1相当于50g/mL的双链DNA分子,（2）对照调零,（3）计算,（4）计算,光吸收,波长nm,260,240,220,280,0.1,0.2,比色杯,课题3 血红蛋白的提取和分离,一、分离蛋白质的基本方法原理,1、凝胶色谱法（分配色谱法）：,a .凝胶：,一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）,b.概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的 有效方法，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作 用来进行分离。,大于,凝胶外部,快,小于,慢,2、 缓冲溶液的作用和组成：,（1）作用：能够抵制_的对溶液_ 的影响，

16、维持pH基本不变。,外界的酸或碱,pH值,(2)缓冲溶液的配制,通常由_种缓冲剂溶解于水中配制而成。调 节缓冲剂的_就可以制得_ 使用的缓冲液。,1-2,比例,在不同pH范围内,思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？,使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察红色和材料的科学研究活性。,在同一电场下，由于各种分子带电性质（正电荷或负电荷）的差异及分子本身大小、形状的不同，而使带电粒子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,（2）原理：,（1）概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,3、电泳：,（3）常

17、见方法,琼脂糖凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳,二 、粗提取血红蛋白,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,血液,血浆,血细胞,白细胞,血小板,红细胞 （最多）,血红蛋白,两个a肽链,两个一肽链,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,(1)目的：去除_,1、红细胞的洗涤,杂质蛋白,(2)方法：,采集血样：为防止血液凝固，需在采血器中加入 抗凝血剂柠檬酸钠,低速短时间离心：500 r/min，离心2min，这样做的目的是防止红细胞与白细胞一同沉淀，达不到分离效果,吸去血浆：用胶头吸管吸去上层黄色血浆,：直至上清液中没有黄色，表明红细胞已经洗涤干净，否则需重复洗涤,生理盐水洗涤：向盛有暗红色红细胞液体的烧杯中加入五

18、倍体积的生理盐水，缓缓搅拌10min,低速短时间离心,重复步骤3次：直至上清液中没有黄色，表明红细胞已经洗涤干净，否则需重复洗涤,（1）方法：加_到原血液体积，再加40体 积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟。,（2）目的：使红细胞吸水_，血红蛋白释放出来。,涨破,蒸馏水,2、血红蛋白的释放,（3）原理：渗透作用,3、分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层:,第1层 无色透明甲苯层,第2层 脂溶性物质沉淀层，白色薄层固体,第3层 红色透明液体（血红蛋白水溶液）,第4层 其他杂质的暗红色沉淀,4、透析,(1)原理：_能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。 (2)过程：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12