miRNA用荧光定量PCR检测的完整流程

1、一、微小核糖核酸的引入微小核糖核酸是一种1928nt的调节性核糖核酸分子，主要包括微小核糖核酸(MicroRNA)和小干扰核糖核酸(siRNA)。其中，微小核糖核酸已成为继小核糖核酸之后的新的研究热点之一，在2002年和2003年的十大科学成就中名列前茅。微小核糖核酸是长核糖核酸序列的一部分，长核糖核酸序列是一种相对较短的单链小核糖核酸，类似于小核糖核酸。它通常来源于染色体的非编码区，由大小约为70 nt的发夹状前体加工而成。它与其靶基因分子的3-非翻译区(3 UTR)互补，导致其翻译受到抑制。mirbase (/)中有来自不同物种的1W以上的miRN

2、A序列。一种检测微小核糖核酸的方法要了解微小核糖核酸在基因调控中的作用，一个关键的方法是快速准确地检测微小核糖核酸的基因表达。因此，检测微小核糖核酸的表达水平已经成为科学家们研究的热点。然而，由于小核糖核酸是一种小分子，一些小核糖核酸的表达水平可能很低，因此需要极其灵敏的定量分析工具。常用的检测方法有：1.1北方印迹1.2基于该方法的核糖核酸酶保护分析和液相杂交。1.3逆转录聚合酶链反应也用于检测微小核糖核酸前体的表达水平。基于聚合酶链反应技术检测微小核糖核酸的其他方法包括：引物延伸法，在引物的5-末端添加特异性标记，定量测定低丰度核糖核酸的含量；原位杂交(CISH，荧光原位杂交)可以方便地检

3、测微小核糖核酸的时空表达差异。1.4微阵列技术46，47是研究miRNA表达的快速方法。二、逆转录引物的分类和设计原则实时聚合酶链反应克服了短miRNA分子(22 nt)带来的最大定量问题，引入了靶向特异性逆转录引物，可与成熟miRNA结合形成逆转录引物/成熟miRNA复合物，并在miRNA的5端延伸。这样，获得了一个长的逆转录扩增因子，为进一步的实时定量聚合酶链反应提供了一个满意的模板。有两种类型的逆转录引物：1.寡核苷酸特异性逆转录引物(主要是QIAGEN产物)它由特定序列(t) 20左右的附加碱基v或VN组成。(所有的微小核糖核酸可以共享一个寡核苷酸逆转录引物，但是核糖核酸需要在逆转录前

4、被聚腺苷酸终止)2.具有茎环结构的逆转录引物(主要是ABI产品)它由一个特定的序列组成，该序列可以是环茎形的6-8个末端反向互补碱基。(一个微小核糖核酸序列特异性地对应于一个具有茎环结构的逆转录引物)。3.引物探针设计因为反转录后获得的基因是一个复杂的片段。上游引物可以在miRNA自身的序列上找到。如果气相色谱含量太低，可以在上游引物的5端加入保护碱基，如气相色谱。下游引物位于逆转录引物的反向互补序列中。也就是说，上游引物对每个微小核糖核酸都是唯一的，而下游引物是通用引物。荧光定量聚合酶链反应检测方法包括SYBR绿色染料法和TaqMan探针法。前者需要调整引物浓度和引物扩增效率，并将引物二聚体

5、调整得尽可能小；探针规则要求设计荧光探针，其中推荐使用MGB探针(未做广告)，因为其碱基数量少且特异性好。探针有三个设计位置：与微小核糖核酸序列完全相同，位于微小核糖核酸和逆转录引物的交叉点，完全位于逆转录引物上；其中，有两种正负互补的情况。至于探头应该设计在哪里，根据我自己的测试情况，我认为效果差不多。四、测试操作流程1.核糖核酸提取在上述两种逆转录引物中，Ologod(T)特异性引物所需的核糖核酸尽可能小，用专用试剂盒提取，而茎环逆转录引物需要常规的核糖核酸提取。此外，由于不同样品的核糖核酸提取方法不完全相同，普通组织样品和细胞可用三唑+氯仿研磨提取；血液和植物样品需要预处理，然后用三唑+氯仿或特殊试剂盒提取。2.反转录已经证实，当使用寡核苷酸特异性逆转录引物时，核糖核酸应该用3聚腺苷酸进行跟踪。对逆转录酶没有特殊要求，所以请遵循每种逆转录酶的说明。这里需要注意的是，逆转录中使用的逆转录引物(常规的是随机引物、寡核苷酸和特异性引物)是上述的寡核苷酸特异性引物和茎环逆转录引物，它们分别属于寡核苷酸和特异性引物，在逆转录中不需要添加其他的逆转录引物。在确定逆