两水相萃取法.ppt

1、19双水相萃取法，传统溶剂萃取法不适合大分子生物制品： 1、细胞球内制品需要经细胞球破碎后提取纯化，细胞球颗粒尺寸的变化给固液分离带来困难2 .生物制品对pH值、温度和离子力等因素敏感，在有机溶剂中的溶解度低，发生变性。 因此，迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便、快速高效的分离纯化技术。 其中，双水相萃取技术也称为水溶液两相分配技术，是近年来出现的备受关注、极有前途的新分离技术。 双水相萃取法的优点： 1、可以保持生成物的活性，整个操作可以连续化，除去细胞球及其东鳞西爪时，蛋白质也可以精制25倍，与以往的过滤法或离心法相比，无论是收率还是成本上都非常出色。2、双水相萃取法与以往的酶催化剂组

2、分离方法(盐析、有机溶剂沉淀等)相比较，具有较大优势。 例如，3、处理量相同时，双水相萃取法与以往的分离方法相比，设备需求量少310倍。 1、广泛应用于生化、细胞生物学和生化工业领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和细小病毒等产品的分离纯化和分析等。 该法纯化的酶催化剂已达到数十种，其分离过程也达到相当规模，如甲酸黄素脱氢酶的分离已达到数十千计程仪克的湿细胞球规模，半乳糖苷酶的提取也达到试制规模。 应用概况：2，近年又进行双水相萃取小分子生物活性物质如赤霉素、头孢菌素c、氨基酸的研究和亲和双水相萃取的研究，扩大了应用范围，提高了选择性，使双水相萃取技术具有更大的潜力和广阔的前景。 3、但双水相萃取

3、技术真正工业化的例子很少。 因为成本高，技术优势受到损害。 在双水相萃取中，产品材料成本占总成本的85以上，总成本随着生产规模的扩大而显着增加。 解决办法：加强合成廉价、分配性能好的聚合物提取后的资源再生研究。一、双水相的形成取决于两种聚合物溶液相互混合时，调查竞争是阶层化还是混合在一个相中，两个因素，即1，熵的增加。 2 .分子间作用力。 两种物质混合时，熵的增加与相关的分子数有关。 因此，用摩尔修正，小分子间和大分子间的混合、熵的增加是相同的。 但是，分子间的作用力可以看作是分子中各化学基间相互作用力的和，毋庸赘言分子越大作用力也越大。 由以上讨论可知，对于大分子来说，摩尔单位中分子间的作

4、用力与分子间的混合熵相比占主要地位，主要由分子间的作用力决定混合的结果。 如果2种聚合物分子间存在斥力，平衡后，有可能分成二相。 这种现象称为聚合物的不相容性。 在两种聚合物之间有引力且引力强的情况下，例如，在具有反电荷的两种电解质之间，它们相互结合存在于共同的相位上。 两种聚合物之间如果不存在强的斥力和引力，两者可以相互混合。 聚合物和盐类溶液也可以通过PEG和盐化学基性磷酸盐或硫酸盐的二相等的盐析作用形成二相。 在生物化学工程中应用的仅限于聚乙烯管乙二醇葡萄糖和聚乙烯管乙二醇无机盐类。 这是因为两种聚合物都没有毒性，而且这些多元醇和多糖体的结构使生物大分子稳定。 例如，点m代表整个系统的构

5、造，其中该系统实际上由两相构成，上相与下相分别由点t与b表示。 m、t、b三点在一条直线上，t和b表示平衡的两相，其连接的直线称为线程，同一线程上各点分开的两相，虽然具有相同的组成，但体积比不同。 二、相图对于由p、q两种聚合物和水构成的系统，p、q达到一定浓度时形成二相。图中的曲线将均匀区域和两相区域隔开，称为二节线。 根据(19-1 )、式(191 )的证明，线向下移动时长度逐渐减少，这是因为两相的差减少，到达k点时线的长度为0，没有两相间的差，点k被称为限制点或折叠点。 二节线的位置形状与聚合物的分子量有关。 分子量越高，相分离所需的浓度越低，两多聚体的分子量差越大，二节线的形状越不对称

6、。 三、分配理论(一)、表面能的影响与溶剂萃取法同样，蛋白质在两个水相间的分配用分配系数KClC 2描述，习惯上Cl表示上相中的浓度，C2表示下相中的浓度。 相系统固定后，k与蛋白质的浓度无关，是一定的，达到平衡后，分子和粒子就像在某个相中时一样能量低，它们就比较集中地分配到那个相中。 分子从相2向相1移动所需的功设为e，根据相平衡时、化学位相等的原则，分配系数k由上式可知，在某个相系统中，分配系数主要取决于分子的表面积和表面性。 (二)电荷的影响；(三)、综合因素、表面自由能用于测定表面的相对疏水性，可改变聚合物的种类，其平均分子量和分子量分布及浓度影响相的疏水性。 由于表面积一般较大，微小

7、的变化会使蛋白质的分配系数发生很大变化。 编入系统的盐类以及pH对相间电位差和蛋白质所带有的电荷数有影响，对分配系数也有影响。 如上所述，因为影响分配系数的因子很多，且这些个的因子相互影响，所以不能将分配系数独立测量的蛋白质的一些分子性质与它们之间的关系定量关联。 只有通过实验才能得到合适的操作条件。 实验可以用带刻度的离心试管10 ml容易地进行。 检定工作赶上的话，几天之内就能求出必要的提取条件。 但是，液体的黏性系数比较大，如果用吸管操作有时会容易引起误差，需要注意。 影响分配的残奥表主要有聚合物的分子量和浓度、pH、盐的种类和浓度、温度等。 适当选择各残奥仪表，可获得较高的分配系数和选

8、择性。 双水相萃取法的一个重要优点是，无需分离细胞球东鳞西爪，可直接从细胞球破碎模拟液中提取蛋白质，因此可以用一头地操作实现固液分离和纯化两个目的。 可通过改变pH值和电解质浓度进行反萃取。 如果聚合物的分子量降低，则蛋白质容易分配到富含该聚合物的相中。 例如，在PEGDx (Dx表示右旋糖酐Dextran )系统中，PEG的分子量越小，则分配系数越大，右旋糖酐的分子量越小，则分配系数降低。 这是普遍的法则，无论是什么样的聚合物系统，进行什么样的分配的生物大分子都可以适用。 (1)、聚合物的分子量、(2)、聚合物的浓度接近限制点时，蛋白质均匀地分配到二相，分配系数接近1。 当聚合物的总浓度和聚

9、合物盐混合物的总浓度增加时，体系远离限制点，线的长度也增加，此时二相性的差也变大，蛋白质有向一侧分配的倾向，即，有分配系数超过1或低于1的倾向。 如果远离限制点，系统的表面张力也会增加。 如果分配细胞球等固体粒子，则细胞球容易集中在界面，如果位于界面，则界面面积减少，因此系统能减少，但对于溶解的蛋白质来说，该现象很少，(3)、盐类的影响、各种无机络离子在PEG Dx二相下的分配系数如表192所示，例如，添加NaCl引起的卵蛋白和溶血工作团队分配系数由此可知，如果加入适当的盐类，带有反电荷的2种蛋白质的分离将大大促进。 盐类浓度持续增加，影响逐渐减弱，分配系数几乎没有变化。 盐类浓度大时，由于盐

10、析作用，蛋白质容易分配到上相，随着NaCl浓度的升高，1ogK大致线性增大(图195 )。 各种蛋白质的增大程度有差异，利用这个性质，可以使蛋白质之间分离。 由于HPO42络离子在PEG右旋糖酐系统中的分配系数较小，因此，当施加pH大于7的磷酸盐缓冲液时，可以容易地改变相间电位差，使带负电荷的蛋白质移动到富聚乙烯管二醇的相中。 (4)、pH的影响改变蛋白质所具有的电荷和分配系数，因为pH影响蛋白质中可解离化学基的解离度。 由式(1910 )可以表示，在系统的时间节点中，分配系数k和带电数z的关系在(1921 )式中与系统的组成、添加盐类和温度等有关。 已知PH与带电数的关系的蛋白质，例如溶菌工

11、作团队和卵蛋白质的研究中，确实适合上式。 pH影响磷酸盐分解的程度，改变H2PO4-和HPO42-的比例时，相间电位发生变化，影响分配系数。 pH值的微小变化可以使蛋白质的分配系数变化23位数。 探讨分配系数与pH的关系时，如果加入不同的盐类，根据电位差的不同，这种关系也应该不同。 但是，在等电点中，可以得到不带电荷的分子的分配系数，根据盐类系统的不同，需要相等的值。 因此，在不同的盐体系中，分配系数和PH的关系曲线的升交点成为等电点。 测量这种等电点的方法称为交织分配。 例如在图196中表示血清白蛋白的交织分配。 (5)、温度、温度影响相图，特别是在限制点附近特别显着，因此对分配系数也有影响

12、。 然而，在远离限制点的远表兄弟处，这种影响很小。 大生产总是采用常温，可以节省冷冻费用。 这是因为聚合物稳定地作用于蛋白质，不会造成损失。 另外，温度高则黏性系数低，有利于相的分离操作。 (6)、带电PEG作为相聚合物，通过向聚合物中导入电荷，可以增大两相间的电位差。 可以在PEG和聚葡萄糖中导入带有电荷的化学基。 但是，从式(1919 )来看，相间电位差与电荷数成反比，但由于可以对每个右旋糖酐分子导入很多带有电荷的化学基，所以效果差。 相反，由于每分子PEG只含有两个羟基化学基，只能导入两个带电化学基，所以增大电场的效果很好。 一些带正电或带负电的PEG诱导体：带正电的PEG诱导体三一甲胺

13、化学基PEG(TMA-PEG ) :氨基化学基PEG(PEGNH2)。 带负电： PEG-磺酸盐； 由于可以利用羧基化学基一PEG(PEG一COOH ) .带电PEG产生大的相间电位，因此可以增加分配系数。 五、相聚物的回收、聚合物或盐的回收利用十分重要。 例如，从1000kg面包酵母中提取反丁烯二酸酶催化剂需要680kg PEG1550和533kg K3PO3，如果不资源再生化学品的消耗使生产成本大幅度上升。 产品为蛋白质，如果分配到盐相中，盐可用错流工艺的操作方法进行过滤或透析的薄膜过滤回收。 膜分离是分离富集精制蛋白质，将聚合物除去到云同步的最好方法。 如果蛋白质积蓄在聚乙烯管二醇中，可

14、以通过加入盐进行精制，加入的盐使蛋白质在盐相中再分配。 PEG的分离也可以通过膜分离实现，在用选择性孔径大的半透膜说唱乐蛋白质的同时，排除PEG进行回收。 另一种力法是用盐折或水溶性溶剂使蛋白质沉淀，但固体(生成物)的除去受到不存在的PEG的阻碍。 也可以使用通过蛋白质和基质的选择性相互作用进行的络离子交换和吸附。 但是，用色谱柱处理粘性聚合物溶液时，会出现高压降。 另外，也可以用阳离子电泳和亲和分配与双水相萃取组合的方法回收或减少PEG的用量。六、应用(一)、工艺问题，双水相萃取法主要应用于胞内酶萃取。 采用双水相萃取的方法，(1)、萃取的酶催化剂和细胞球必须分布于不同相： (2)、酶催化剂

15、的分配系数对一盏茶有较大影响。 以一定的相体积比，抽出一次，可以得到高收率。 (3)、两相用离心机容易分离。 从典型的细胞球片段中分离酶催化剂的数据如表193所示。 通常将蛋白质分配到上相(PEG )，将细胞球东鳞西爪分配到下相(盐)。 相反的情况下不利于相的分离，上相的含有固体成分高的话分离机的性能会受到影响。 从表193可看出，蛋白质通常可达到90，分配系数为120之间，大于3的其他蛋白质通常也可被去除到云同步。 PEG盐系统应用广泛，主要是因为PEG廉价，其选择性高于PEG粗葡聚糖系统。 提取时，单位重量体系中均匀拉力赛的添加量是重要的残奥表。 从经济的观点出发，最好增加更多的量，但这影

16、响了原来成为聚合物的相系，与变更相比，降低分配系数，结果会降低收率。 一般的1千克提取系统优选处理200400克的湿菌体。 在PEG盐体系中将细胞球东鳞西爪分配到下相比较容易。 Hustedt等人经过系统研究，在PEG1550磷酸钾元素系统的相图(图197 )中，当起始混合物的浓度在折断线范围内时，细胞球东鳞西爪被分配到下相。 分配到上相的蛋白质通过加入适量的盐(有时也可以在云同步中加入少量的PEG )，可以进行第2次双水相萃取。 通常，第二阶段提取的目的是除去核酸和粗多糖，由于它们的亲水性强，容易分配到盐相中，蛋白质应该留在PEG相中。 在第三步提取中，将蛋白质分配到盐相(例如，调节pH )

17、，与本体PEG分离。 色素通常从其防水性向上相分配。 本体PEG可以资源再生，而盐相蛋白质可以用超滤法除去剩馀的PEG，提高产品纯度。 (2)、工程上的问题，在工业上的应用需要考虑到达到萃取平衡所需要的时间和两相分离的设备。 在双水相体系中表面张力低，混炼和平衡容易。 PEG盐系的表面张力为0.11mNcm1，PEGDx系为0.000110.01mncm1，非常小。 因此，搅拌时容易分散到液滴中，所以几秒钟内取得平衡，电功耗也少。 表面张力低时，蛋白质界面上的失活也减少，收率提高。 两相分离比较困难，因为两相密度差低，如果处理均匀的拉力赛，则黏性系数大。 一般的分离用盘式离心机进行，图199表

18、示流体的流动方向。 由于表面张力低，分离的相也容易再混合，所以要正确地调节界面的位置，使混悬剂上升到盘中的入口，这可以调节下相的出口半径来实现。 七、双水相萃取技术的进展，双水相萃取技术不仅使生物物质的分离纯化成为新的分析测试手段。 近年来有了新的进展，主要分为两个方向。 1 .廉价的双水相系的开发在生化工程中应用的双水相系有高分子化合物和高分子化合物盐系。 从表中可以看出，高分子化合物系对活性物质的变性作用小，界面吸附少，但价格高。 因此寻找廉价的高分子化合物双水相体系是双水相萃取技术应用的重要发展方向。 目前，改性淀粉PPT代替了昂贵的Dextran已经成功使用。 PPTPEG系用于从发酵液中分离过氧化氢酶、半乳糖苷酶等。 PPTPEG系比PEG盐系稳定，与PEGDextran系相图非常相似，具有蛋白质溶解度大