第七章-紫外--可见吸收光谱法

1、第三章 紫外-可见吸收光谱法（UV-Vis）,基于被测物质的分子对紫外-可见光具有选择吸收的特性而建立的分析方法。,分子光谱 吸收光谱,可见光,远紫外 （真空紫外）,紫外光,一、紫外-可见光,第一节 概述,1. 物质分子对光的吸收,E = Ee + Ev + Er,2. 分子吸收光谱,A（吸光度）-（波长）关系图,Er： 0.05 eV,带光谱,Ee： 1 20 eV,Ev： 0.05 1 eV,二、紫外-可见吸收光谱,三、紫外-可见吸收光谱 法,定性分析,定量分析,在一定的实验条件下，物质在某波长处的吸光度与物质的浓度成正比。,吸收光谱的位置 (max )和形状,1. 精密度较高,3. 检出

2、限低,相对误差 13%,2. 准确度较高,DL 10-7 10-8 10-9 g / ml,不一定要追求低的检出限,4. 仪器比较简单 操作比较简便,5.应用广泛,选择性一般比较好。条件适当，可不经分离进行单组分或多组分测定。,主要干扰： 共存组分与被侧组分的光谱重叠,RSD1%,四、紫外-可见吸收光谱 法的特点( 定量分析 ),承担60%的定量分析任务（无机离子 有机物 生化分析）,一些有机物结构分析的辅助方法,五、研究工作的现状,提高选择性,提高灵敏度,第二节 吸收光谱法基本原理,单色光 复合光 光的互补,单色光,复合光,光的互补,单一波长的光,由不同波长的光组合而成的光,若两种不同颜色的

3、单色光按一定的强度比例混合得到白光（无色的光），那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。,一、物质对光的选择性吸收,当溶液中的某种物质选择性地吸收可见光中某种颜色的光时，溶液就会呈现出对应的互补色。,黑色-全吸收；白色-全反射；无色-全投射,光,I0,I,L,二、吸收光谱,如果让不同波长的单色光依次照射某一吸光物质，并测量改物质在每一波长处对光吸收程度的大小（吸光度，A），然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，即得到一条吸光度随波长变化的曲线，称之为吸收曲线谱图也称为吸收光谱。,末端吸收,最强峰,肩峰,峰谷,次强峰,max min ,A,1. 吸收峰的形状及所在位置 定性的依据

4、 2. 吸收峰的强度定量的依据 光吸收定律,A,紫外可见光谱的特征,三、光吸收定律,透光率 T，透光光强度与入射光强度的比值,全部吸收 T = 0.0,全部透射 T = 100.0 %,（一）朗伯-比尔定律,1. 定律,吸光度 A,朗伯-比尔定律 A = Kbc,1） 液气固介质均适用,2）入射光是单色光，平行光,1730年 Lamber A b (C固定),1852年 beer A C ( b固定),3）稀溶液,I0,It,-dIx =k1 Ix adn,dn = CSdb,-dIx=k1 IxaCSdb,-dIx/Ix= k Cdb,dIx,2 . 朗伯-比尔定律推导,S,物理意义：当一束

5、平行光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度A与吸光物质的浓度C及吸收池厚度b成正比（定量分析的依据）,adn C,吸光度 与透光率,T,T = 0.0 %,A = ,T = 100.0 %,A = 0.0,A = 0.434,T = 36.8 %,3. 吸光度的加合性,A = A1 + A2 + + An,各组分之间无相互作用,条件：,多组分测定及扣除空白方法的理论基础,用途：,在某一波长处,C: mol/ L,2) ( L mol1 cm-1),C: g / L,1) a ( L g 1 cm-1),吸光物质定性的特征参数,4. 吸光系数,吸光物质定量分析的灵敏度参数,物理意义为当吸

6、光物质的浓度为1mol.L-1，吸收池厚度为1cm时，吸光物质对某波长光的吸光度,影响因素：入射光的波长 吸光物质的性质（吸光质点的面积、有效跃迁概率） 溶剂 温度等环境因素,3) 检出限与摩尔吸光系数,若可测量的吸光度为0.001,一般 103 104；灵敏 的 104；个别的可达 106,增大 是提高方法灵敏度的重要途径,提高跃迁几率 增大截面积,(二) 导致 A-C 关系偏离朗伯比尔定律的原因,1. 入射光的单色性不好,设入射光由 1 和 2 两种波长组成，,对于 1,总吸光度,对于 2,偏离 减小校准曲线的线性范围,若 , 1 = 2= ,在一定的浓度范围内 A= b C,若 , 1

7、2,A-C曲线向浓度轴弯曲，偏离beer定律，负偏离,*要获得较宽的线性范围, 越大，偏离越严重, 适当提高入射光的单色性, 在吸收光谱的峰值(max)处进行测定,1）一种为- 很小，近似的认为 1 = 2,2）另外一种为- 很大，但在选择的入射光波长附近曲线比较平坦， 1 = 2,2. 非平行入射光引起的偏离，光程的变化引起信号的变化,3. 介质不均匀引起的偏离，如胶体或浑浊溶液,若不平行，实际光程比吸收池厚度大，产生正偏离,吸收和散射等，使检测到的吸光度偏大，产生正偏离,浓度增高，吸光物质粒子平均距离减小，相互作用增强，电荷分布改变， 改变。 减小，向浓度轴偏离； 增大，向吸光度轴偏离。,

8、4. 溶液浓度过高,5. 溶液中发生了化学反应（吸光物质 离解 缔合 异构互变 生成新物质 ）, 络合-离解,Cr2O72- + H2O 2CrO42- + 2H+,350,375,Cr2O72- 浓度不同 离解度不同 A-C 关系偏离beer定律, 聚合-离解,MR M + R,C (1-) C C ,*加入过量显色剂 ，可使 R保持不变，为定值，MR才能作为C的量度，A=KbC 成立。,稀溶液定律,CM的初始浓度,MR M的测定浓度,恒定MR才能作为C的量度,一、有机物的紫外可见吸收光谱,E E E n E * E *,（一）电子跃迁类型,第三节 紫外可见吸收光谱,（二） 生色团 及共轭作

9、用,乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基、乙炔基、腈基,1.生色团 含有 键的基团，在吸收外来辐射时可发生-*和 n-*跃迁。,2. 生色团的共轭作用,在共轭体系中电子有更大的离域性，*能量降低，n *和 * 的E降低。导致,吸收波长增大（红移）；,max 增大,一些含有n电子的基团 OH NH2 X,（三）助色团（Auxochromous group）,1. 助色机理,n-共轭 降低*能量使 *的E降低,2. 效果,max 红移；max增大,n电子增加，助色作用增强；n电子消失，助色作用消失。,max max,208 nm 7000,230 nm 8800,203 nm 7500,（ 四 ）溶剂效应

10、,-* 跃迁的E减小，吸收峰红移。,1.对吸收波长的影响,n- * 跃迁E 增大，吸收峰蓝移,2.对光谱精细结构的影响,溶剂化作用限制了分子的自由转动， 溶剂极性限制了分子的自由振动， 吸收光谱精细结构消失 ，变得平滑。,溶剂选择原则,1）绘制吸收光谱（定性），应选用非极性溶剂；,2）比较已知物和未知物的吸收光谱，应选用 同一溶剂；,3）所用溶剂在测量的光谱范围内无吸收或少吸收。,在极性溶剂中,1. dd 配位场跃迁,正八面体配合物dd 配位场跃迁,在配体的作用下过渡金属离子的d 轨道裂分，吸收辐射后，产生 dd 跃迁。,在实际的分析应用中没有价值，但可以用于配合物结构或无机配位键合理论方面的

11、研究。,dd 跃迁概率较小，摩尔吸收系数一般只有 0.1100 Lmol-1cm-1,二、 无机化合物的紫外-可见吸收光谱,2.电荷转移跃迁,max 在可见区； max 104,中心离子和配位体之间，一方的电子向另一方轨道转移跃迁，所产生的吸收光谱称为荷移光谱。,3. 中心离子影响下配位体 的-* 跃迁,当金属离子与含有生色团及助色团的配位体配合后，受到金属离子的作用，配位体所含的共轭结构发生了变化，导致其吸收光谱蓝移或红移。,* E 改变 E 蓝移 ； E 红移,例：茜素磺酸钠在pH45时与Al3+的显色反应,Al3+ / 3,max = 420 nm,max = 475 nm,茜素磺酸钠,

12、E 红移,一、比色法 1. 目视比色法 用眼睛观察比较溶液颜色以确定物质含量 原理： 间接应用比尔定律（观测吸收光的互补色光） 仪器：比色管 方法：标准系列法 特点：简单 准确度不高,第四节 紫外-可见分光光度法及仪器,2. 光电比色法,用仪器比较溶液颜色以确定物质含量原理： 朗伯-比尔定律（测定吸光度） 仪器：比色计 方法：标准曲线法 特点：单色光（纯度较差） 灵敏度和准确度较高 使用参比溶液，一定选择性 利用吸光度加和性，可做多组分测定,二、分光光度法,用仪器测定溶液吸光度以确定物质含量原理： 朗伯-比尔定律 仪器：分光光度计 方法：标准曲线法 特点：单色光（纯度高） 灵敏度和准确度高 选

13、择性好 利用吸光度加和性，可做多组分测定 扩大波长范围，可测紫外、红外吸收,三、分光光度计基本部件,光源,单色器,样品池,检测器,信号处理 及输出,1.光源,基本要求： 强 稳定 光谱区域宽 能量分布均匀,可见光源 卤钨灯 250 2000 nm,紫外光源 氢灯 氘灯 185 350 nm,2.单色器,作用：从复合光中获取单色光,棱镜,光栅,玻璃， 350 2500 nm, 石英，185 4500 nm,透射光栅 反射光栅；平面光栅 凹面光栅,玻璃，光学玻璃，石英,多道 ： 二极管阵列 电荷耦合器件（CCD）电荷转移器件（CID）,狭缝 色散元件,3.样品池,4.检测器,5.信号处理及输出 表

14、头、记录仪、屏幕、数字显示,作用：将光信号转换为电信号，并放大,单道 ： 光电管，光电倍增管；,光电倍增管（PMT）,有暗电流,电压要稳定,放大倍数104107,1. 工作原理 参比溶液 I0 调 T=100 % A=0 ；试液 I,补偿吸收池对光的吸收、反射，溶剂对光的吸收、散射，使I0成为真正只与被测物质有关的I0,2.特点,（一）单波长单光束分光光度计,四、分光光度计构造原理,不能进行吸收光谱的自动扫描（不易绘制吸收光谱）, 精密度不高,(参比溶液和试液不在同一时间测量，光源的波动影响测量结果), 简单，廉价，适用于常规分析,（二）双光束分光光度计,1.工作原理, 精密度好（ I0 和

15、I 变化的幅度一致，补偿仪器的不稳定性）, 可进行吸收光谱的自动扫描（绘制吸收曲线）, 仪器复杂 较昂贵,2.特点,I0 和 I 同时（或交替）测量，统计处理。,仪器实物,仪器实物1,第五节 分析条件的选择,一、显色反应条件的选择,（一）显色反应及其类型 无机阳离子的显色反应绝大多数都属于络合反应，其中三元络合物体系在光度分析中发展较快、应用较为普遍。重要的三元络合物体系主要由以下几种类型： 1混配型络合物体系 例如, V(V)可与H2O2和吡啶偶氮间苯二酚（PAR）形成1：1：1的有色络合物。 2离子缔合物体系 例如，Ag+ 与邻二氮菲形成配阳离子，再与溴邻苯三酚红的阴离子作用形成深蓝色的离

16、子缔合物。 3. 金属离子-配体-表面活性剂体系 如在Au-KI-丁基罗丹明B体系中加入曲通-100，水溶液中即可测定，值高达1.2 106 。,显色反应基本要求,1.选择性好 显色剂 R不与共存组分显色或显色但不产生干扰, = 显- 配 60nm,2.灵敏度高 MRn max 大,3.精密度高 MRn 稳定，组成恒定,4.显色反应条件易于控制,（二）显色条件的选择,1. 显色剂的用量,M + nR = MRn,过量 定量,实际工作中，作 A CR 曲线，寻找适宜 CR 范围。,RH = R- + H+,例：磺基水杨酸 Fe 3+,紫红色,pH = 2 3,FeR,pH = 4 7,FeR2,

17、橙色,pH = 8 10,FeR3,黄色,2. 酸度,影响显色产物的组成,低酸度下一些金属离子水解,实际工作中，作 A pH 曲线，寻找适宜 pH 范围。,影响显色剂的离解度,3. 显色温度,4.显色反应时间,作 A t 曲线，寻找适宜 反应时间。,显色反应在一定温度下才能较快地进行,一般室温即可 , 若需加热则须控制温度。,显色反应完成需要一定的时间；,生成的配合物在一定的时间范围内稳定,5.有机溶剂和表面活性剂,表面活性剂：胶束增溶，增稳；形成多元配合物,有 机 溶 剂： 提高显色灵敏度,（二）测量条件的选择,1.测量波长,无干扰：选择max,有干扰：选择不重叠的较高峰,最大吸收原则,吸收

18、较大、干扰最小原则,当T = 0.368 = 36.8 %时，仪器测量误差最小,此时， A = 0.434,A 0.15 0.8,T 70 15%,光源及检测器的不稳定性；吸收池状态位置的不确定性；读数的不确定性,2.吸光度范围的控制,改变测量波长,调节试液浓度,3.参比液的选择,作用 调节仪器零点，消除器皿及溶剂的吸收 扣除共存组分、显色剂及其他无关的吸收,无吸收 不显色,无吸收,溶剂,吸收 不显色,无吸收,不加显色剂的试液,无吸收 不显色,吸收,显色剂溶液,显色 吸收,吸收,掩蔽待测组分后加显色剂 的试液,A 试液 = A 共存组分+ A其他+ A 待测吸光物质,A 参比 = A共存组分+

19、 A其他,显色剂 共存组分 参比溶液,例：铬天箐测Al 3+， Cr 3+ Ni2+ 干扰。用F-掩蔽Al3+ 作参比,第六节 吸光光度法的应用,一、定性分析,（一）化合物鉴定,（二）有机物结构分析,比较未知物和标准物的吸收光谱,根据吸收曲线的特征推断化合物结构中的官能团和共轭体系,1比较光谱法， 2制作试样的吸收曲线并与标准紫外光谱对照； 3利用Woodward-Fieser经验规则求最大吸收波长。,二、定量分析,. （一）单组分的测定,1. 校准曲线法,在确定的最佳显色反应条件和最佳测量条件下分别测量一系列不同含量的标准溶液的吸光度,以标准溶液中被测组分的含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制

20、A-c曲线，此即校准曲线。现代分析中大多要求以最小二乘法处理制作校准曲线的实验数据，得到一元线性回归方程。 A = bC,例： 人血清中总蛋白的测定。在碱性溶液中，蛋白质分子中多肽的肽键可与铜离子作用生成紫红色络合物。在37下，反应15min，一个铜离子可与6个肽键形成配位键，不同种类蛋白的显色能力相似。在540 nm测定所形成络合物的吸光度，可以对人血清中总蛋白含量进行测定。 葡萄糖在葡萄糖氧化酶(GOD）作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢,后者与酚及4-氨基安替吡啉在过氧化物酶(POD) 作用下生成红色醌类染料化合物，在500 nm 波长处检测，可测定人血清或血浆中的葡萄糖含量。 H2O2 +

21、4-氨基安替吡啉 + 对氯苯酚 过氧化物酶 醌染料 + H2O,甘油三脂的测定： 甘油三脂 + H2O 脂肪酶 甘油 + 脂肪酸 甘油 + ATP 甘油激酶 甘油-3-磷酸 + ADP 甘油-3-磷酸 + O2 甘油磷酸氧化酶 磷酸二羟丙酮 + H2O2 H2O2 + 4-氨基安替吡啉 + 对氯苯酚 过氧化物酶 醌染料 + H2O 在500 nm 波长处检测，可测定人血清中的甘油三脂含量,2. 双波长法,2) 原理,对于1 ：,对于2 ：,选择合适的1 2 使Ab1=Ab2,1）仪器,A=Aa+Ab,则 A = A1-A2 = Aa1-Aa2 = KC,3）波长组合的选择,被测组分的A 最大；

22、干扰组分的A = 0,2,Aa1=K1bC,Aa2=K2bC,1,2,3.示差光度法,常规方法： A（0.150.80）；T（70%15%）,以空白溶液为参比,示差法,以浓度为 Cs 的标准溶液为参比,（ Cs Cx ）,若样品浓度较大 T15%,*示差法提高准确度的实质,常规法,Tx,落在测量误差较 大 的范围,示差法,Tx,Ts,Ts,落在测量误差较 小 的范围,结论：示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度,假设 T=5%,（二）多组分的测定,解联立方程，可求得Cx, Cy, 为物质的特征参数，可通过配制标准溶液测得。,1.若各组分吸收曲线不重叠 各自 进行测定,2.若各组分吸收曲线

23、重叠,联立方程组,三、 络合物的组成的测定,1.摩尔比法（饱和法）,M + nR = MRn,CM, 固定；,CR, 从 0 开始增大,在特定波长测定,M + nR = MRn,保持 CM+ CR = 常数,CM / C 从 0 1连续改变,在特定波长测定A作图,n = 1, CM / C =0.5,n = 2, CM / C =0.33,2.等摩尔连续变化法,四、络合物条件稳定常数的测定,A,A A,由于络合物离解引起,离解度,MR = R + M,总浓度 C,平衡浓度,C(1-a),Ca,Ca,五.弱酸弱碱离解常数的测定,HR = H+ + R-,HR,用光度法可以测定其离解常数,R,E

24、= Ee + Ev + Er,带光谱,一、紫外-可见吸收光谱,二、朗伯-比尔定律 A = KbC,1. 液、气、固介质均适用,2.入射光是单色光，平行光；稀溶液,A = A1 + A2 + + An,C: mol/ L,三、摩尔吸光系数 ( L mol1 cm-1),吸光物质结构的特征参数;,提高跃迁几率 增大截面积,吸光物质定量分析的灵敏度参数,吸光度的加合性,吸收曲线 （A-曲线 ）max 1/2,小结,四、导致A-C关系偏离朗伯比尔定律的原因,1.入射光的单色性不好,*要获得较宽的线性范围, 越大，偏离越严重, 适当提高入射光的单色性, 在吸收光谱的峰值(max)处进行测定,2. 溶液浓

25、度过高,3. 溶液中发生了化学反应,单色光 稀溶液 显色剂过量,五、 分析条件的选择,1. 显色反应条件的选择,基本要求,1) 选择性好 显色剂不与共存组分显色或显色但不产生干扰,2) 灵敏度高 MRn max大,3) 精密度高 MRn 稳定，组成恒定,4) 显色反应条件易于控制,1.显色剂的用量,过量 定量,2. 酸度,3. 显色温度,4.显色反应时间,5.有机溶剂和表面活性剂,条件的选择,六、测量条件的选择（减小测量误差 ）,1.测量波长,2.吸光度,3.参比液,扣除共存组分、显色剂及其他无关的的吸收,1. 工作原理 参比溶液 I0 调 T=100 % A=0 ；试液 I,补偿吸收池对光的

26、吸收、反射，溶剂对光的吸收、散射，使I0成为真正只与被测物质有关的I0,2.特点,（一）单波长单光束分光光度计,七、分光光度计,不能进行波长扫描，不能绘制吸收光谱, 精密度不高,(参比溶液和试液不在同一时间测量，光源的波动影响测量结果), 简单，廉价，适用于常规分析,（二）双光束分光光度计,1.工作原理, 精密度好（ I0 和 I 变化的幅度一致，补偿仪器的不稳定性）, 可绘制吸收曲线, 仪器复杂 昂贵,2.特点,I0 和 I 同时（或交替）测量，统计处理。,波长组合的选择,被测组分的A 最大；干扰组分的A = 0,. （一）单组分的测定,有共存组分物质的光谱干扰,（二）多组分的测定,联立方程组法,示差光度法,以浓度为 Cs 的标准溶液为参比,双波长法,. 八、定量分析,校准曲线法 标准加入法,九、定性分析,（一）化合物鉴定,（二）有机物结构分析,比较未知物和标准物的吸