常见分子生物学实验方法

1、常见分子生物学实验方法,company logo,1，分子生物学技术在目前医学科学研究中占主导地位，几乎所有基础类sci文章都涉及分子生物学实验，掌握分子生物学实验技术的理论和方法有助于读懂基础类sci文章； 2，对许多医学研究生来说，分子生物学实验技术是他们完成实验研究最为常用的一种工具和达到目的的一种手段。,分子生物学实验的重要性,company logo,核酸实验： 重组质粒的构建与表达 蛋白质实验： 蛋白质相互作用研究的常用方法,原核质粒,真核质粒,gst pull-down,免疫共沉淀,本课程主要内容,company logo,实验一 重组质粒的构建,1，分子生物学最基本、最重要的实

2、验技术 2，目前重组质粒的获取方法,公司合成服务,同行馈赠,自己构建（低成本，可靠）,company logo,选择载体 获得目的基因 目的基因与载体的重组 重组载体的转化 重组子的筛选与鉴定,重组质粒构建的基本过程,company logo,重组质粒构建的简单流程,基因组dna,pcr产物, cdna (插入子),质粒dna (载体),限制性酶切 (修饰 dna 末端),连接载体与插入片段,转化 (将重组质粒导入宿主细胞),鉴定重组子,company logo,质粒载体的选择,载体：用于携带重组dna，并且能够使外源dna一起复制与表达的运载工具。基因工程中用得最多的是plasmid载体。

3、质粒：独立于宿主细胞（如细菌）染色体之外的可进行复制和遗传的遗传单位-双链闭合环状超螺旋dna分子。是一种环状的双链dna分子，大小从1k-200kb。分子生物学实验中所用载体为人工合成的。,company logo,人工构建质粒的基本元件,启始复制子：使质粒在宿主细胞中能够复制 抗性基因：用于筛选阳性克隆。 多克隆位点：插入外源基因。 对于表达载体还需要启动子、多聚a尾等。 易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分离纯化、重组等等。,company logo,pbr322 plasmid 是一个克隆载体，作为一个克隆载体最基本的要求都具备： 复制起点:origin 克隆位点:ecor i; h

4、ind iii; bamh i; sal i 筛选标记:ampr。,company logo,克隆载体 原核生物表达载体 真核生物表达载体,质粒载体根据用途分类,质粒载体分类,company logo,t-vector是一种高效克隆pcr产物 (ta cloning) 的专用载体，由puc18载体改建而成的。在puc18载体的多克隆位点处的xba i 和sal i 识别位点之间插入了ecor v 识别位点，用ecor v 进行酶切反应后，再在两侧的3 端添加“t”而成。因大部分耐热性dna聚合酶反应时都有在pcr产物的3末端添加一个“a”的特性,所以用本制品可大大提高pcr产物的连接、克隆效率

5、。,克隆载体（t-载体）,company logo,t-vector 克隆pcr产物时用高效连接液ligation solution i 可以在极短的时间内 (30分钟1小时) 完成连接反应，大大地方便了实验操作。 用途：克隆pcr产物。 对克隆后的pcr产物使用m13 primers进行dna测序。,company logo,t-vector pcr产物亚克隆载体,company logo,company logo,原核生物表达载体,原核生物表达载体的基本结构单元包括： 复制起点 克隆位点 筛选标记 启动子 转录终止序列 核糖体结和位点：起始密码子atg和sd序列（翻译识别）,company

6、 logo,pet-28a,company logo,company logo,真核生物表达载体,真核生物表达载体的结构单元： 复制起点（真核和原核） 克隆位点 筛选标记(原核和真核标记） 增强子/启动子 polya 终止信号,company logo,目的基因的获得,目的基因的获取方法,公司合成 同行馈赠 rt-pcr,company logo,rt-pcr 实验原理,rt-pcr是将rna的反转录（rt）和cdna的聚合酶链式扩增（pcr）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从rna合成 cdna，再以cdna为模板，扩增合成目的片段。 rt-pcr可以一步法或两步法的形式进行。在两步法rt

7、-pcr中，每一步都在最佳条件下进行。,company logo,company logo,操作步骤,1、rna的提取； 2、反转录合成cdna； 3、pcr扩增； 4、产物的电泳和结果的测定。,company logo,rna的提取,rt-pcr中从细胞分离的rna的质量至关重要，包括rna的纯度和完整性。rna分离的最关键因素是尽量减少rna酶的污染。但rna酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性rna酶外，环境中也存在大量rna酶。因此在提取rna时，应尽量创造一个无rna酶的环境，包括去除外源性rna酶污染和抑制内源性rna酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（depc）去除外源性rna酶，

8、通过rna酶的阻抑蛋白rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性rna酶。,company logo,反转录合成cdna,在冰上加入：,1、混匀，42，60min; 2、95 ，5min，终止反应。,company logo,pcr扩增,取1支0.2ml的pcr管，在冰上加入：,company logo,pcr反应参数的设置,company logo,pcr条件的优化,引物退火温度的调节，一般在引物设计软件推荐温度的上下2 变化寻找最佳退火温度。 mg2浓度的调节也非常重要，通常最佳浓度为2mm左右。 引物和模板的量等。,company logo,产物的电泳和结果的测定,根据产物长

9、度制作适宜 浓度的琼脂糖凝胶: 取适量pcr产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，10v/cm电泳4560min。成像系统成像分析。,company logo,注意事项,所提取的rna不能有降解，要达到最佳扩增，所需的总rna的量是必需的。 taq酶、rnasin等-20保存，操作时置于冰上；dntp保存在 4度即可，勿反复冻融。 在操作过程中实验者必须戴消毒手套，并经常更换，确保无rnase的污染。,company logo,在pcr过程中使用良好的实验步骤减少残余污染：使用抗气雾剂移液管阻止气雾剂进入 eppendorf 管内；为pcr样品配制和扩增后分析设计隔离

10、的区域，在准备新反应前更换手套；总是使用不含有模板的阴性对照检测污染；使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。,company logo,目的基因与载体的重组(酶切与连接),核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。 核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来； 核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3，5磷酸二酯键，将核酸链切断。,company logo,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）能特异地结合于一段

11、被称为限制性酶识别序列的dna序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链dna。,限制性酶切的原理,company logo,限制性核酸内切酶的类型和主要特征,company logo,识别序列,限制性内切酶的特点,识别 4-8 bp 的回文序列. 常用的酶识别 6 bp 发生的概率为 46=4096 bp/每次. (44=256 bp; 48=65536 bp),高度特异性 商业化生产 反应需要mg2+ 不同的内切酶可能产生相同的末端,5 gaattc 3 3 cttaag 5,如 ecori 识别序列:,company logo,影响核酸限制性内切酶活性的因素,（1）dna 纯度 （2）dn

12、a甲基化的程度 （3）酶切消化反应温度 （4）dna的分子结构 （5）限制性内切酶的缓冲液,company logo,dna连接酶与dna分子的体外连接,dna连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭dna链上缺口酶，借助atp或nad水解提供的能量催化dna链的5-po4与另一dna链的3-oh生成磷酸二酯键。 常用的dna连接酶有两种： 来自大肠杆菌的dna连接酶 来自噬菌体的t4dna连接酶。 二者的作用机理类似,company logo,t4连接酶作用分三步： （1）t4dna连接酶与辅助因子atp形成酶amp复合物。 （2） 酶amp复合物结合到具有5磷酸基和3羟基切口

13、的dna上，使dna腺苷化。 （3） 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。 t4dna连接酶可连接dna- dna，dna-rna，rna-rna和双链dna粘性末端或平头末端。,company logo,a atp 浓度 b 连接酶浓度 c 反应时间 d insert和vector的比值（载体dna和外源dna的分子数比（浓度比）为1：31：10） e 连接温度 其中连接温度是影响连接效率的最重要的因素。,影响连接效率的因素,company logo,感受态细胞 (competent cells): 经过 cacl溶液处理的e. coli 细胞对外源dna的吸收变得非常敏感，其细胞内的酶限

14、制-修饰系统被抑制，有利于外源基因的转化、表达和繁殖，这种细胞被称作感受态细胞. 转化 (transformation): 感受态细胞吸收外源dna的过程. 热激 (heat-shock): 将 dna 与宿主细胞混合后，将宿主细胞放入42c 的温水中保温 1.5 分钟以增加转化效率的过程.,重组载体的转化,company logo,重组子的筛选与鉴定,外源dna,载体dna,重组分子,原核细胞,真核细胞,扩增或表达,表达,连接,转化,转染,受体细胞,company logo,在dna体外重组实验中，外源dna片段与载体dna的连接反应物一般不经分离直接用于转化，再加上重组率和转化率的不理想，

15、因此必须通过筛选和鉴定来区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。 转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。 非转化子：为接纳载体或重组分子的非转化细胞。 重组子：含有重组dna分子的转化子。 非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。,company logo,转化子的筛选与重组子的鉴定方法,基于载体遗传标记的筛选与鉴定 利用载体dna分子上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组子 基于克隆片段序列的筛选与鉴定 由于基于载体遗传的筛选与鉴定程序不能区分期望重组子与非期望重组子。在大多数情况下，待克隆的目的基因或dna片段的序列至少部分是已知的，因此根据克隆片段序列设计的筛选与鉴定程序具有广泛的实

16、用性 基于外源基因表达产物的筛选与鉴定 如果克隆在受体细胞中的外源基因编码产物是蛋白质，则可通过检测这种蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定期望重组子,company logo,基于载体遗传标记的筛选与鉴定,抗药性筛选法,营养缺陷性筛选法,显色模板筛选法,噬菌斑筛选法,company logo,可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。,非重组子：apr、tcr,重组子：aps、tcs,抗药性筛选法,将外源dna片段插入bamh i、sal i位点,company logo,基本操作,company logo,company logo,营养缺陷性筛选法,基本原理,营养缺陷型筛选法可以区分转化子与

17、非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子 。,company logo,lys,lys+,lys,lys+,基本原理图示,company logo,用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+,用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型,company logo,基于克隆片段序列的筛选与鉴定,pcr鉴定法,菌落原位杂交法,限制性酶切图谱法,亚克隆法,dna序列测定法,company l

18、ogo,pcr鉴定法,pcr技术的两大主要用途为目的基因的获得和dna特定序列的检测。根据引物互补区域的不同，pcr技术即可用于区分重组子与非重组子，也能鉴定期望重组子与非期望重组子，甚至还能探测目的基因或dna片段是否整合在受体细胞的基因组上。上述pcr鉴定程序一般需要将筛选平板上的单菌落分别挑出进一步培养，因此不太适用于成千上万个转化子的鉴定。,company logo,原理: pcr能在模板序列上扩增出预期dna片断。,pcr鉴定法,过程:（1）从重组克隆中提取质粒（或dna）。 （2）用外源dna插入片断作pcr引物。 （3）电泳pcr产物。 （4）检查是否有pcr产物。 （5）pcr

19、产物的长度是否与外源基因一致。,company logo,company logo,dna序列测定法,dna序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行采用sanger发明的双脱氧末端终止法测定dna序列，其工作原理是在dna聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定。,company logo,实验二 蛋白质相互作用研究方法,protein-protein interactions- a common theme in cell biology 蛋白质-蛋白质相互作用 细胞生物学领域的普遍主题,两个或两个以上的蛋白质结合在一起执行生物学功能时，发生相互作用。,company logo,

20、interaction domain - structural basis for protein interaction 相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础,蛋白质蛋白质相互作用和识别在诸如生物催化、物质转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种生命过程起着重要的作用。,company logo,western blot,western免疫印迹（western blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。 western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜或pvd

21、f膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。,company logo,western blot 特点,蛋白质的western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白。,company logo,western blot 应用,目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位

22、目的蛋白的表达量分析,company logo,western blot 流程,company logo,电泳,常用sds-page：单一亚基组成的蛋白质 非变性page：多个不同亚基组成的蛋白质 tris-tricine胶中电泳：用于分子量小于10kda的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套,company logo,转膜,戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致 以适量的转移buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜1530min，如果是pvdf膜，必须先用甲醇激活后浸泡。 方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极

23、 排去滤纸、胶和膜间的气泡。 电转时间：100v 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活 选择 转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率 膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置,company logo,湿转系统,company logo,半干转移系统,company logo,封闭,用5脱脂奶粉或3bsa （含0.1tween20 tbs或pbs配制） 时间：室温2h或4c过夜,company logo,一抗、二抗孵育,把nc膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1ml/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 回收一抗溶液，用tbst漂洗膜3次，每

24、次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 回收一抗溶液，用tbst漂洗膜3次，每次10min。 最后用tbs漂洗膜2次，每次10min。,company logo,显色 辣根过氧化物酶：底物为dab 碱性磷酸酶：底物为bcip/nbt 化学发光显影 最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品） 注意：化学发光前将膜用不含tween20的tbs或pbs洗涤一次 曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定,二抗与底物反应显色,company logo,流程图,company logo,western blot常见问题分析,company

25、 logo,sds-page电泳,胶不平？ 凝胶漏液？,胶板洗刷干净 加入ap和temed的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐,company logo,条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,sds-page电泳,company logo,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲？

26、 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,company logo,转移到膜上的蛋白很少,company logo,背景太高,company logo,杂交信号很弱,company logo,出现非特异带,company logo,gst融合蛋白进行pull-down实验,原理 细菌表达的谷胱甘肽s转移酶（gst）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将gs

27、t融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀gst融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质蛋白质之间的相互作用时，可以启用gst沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。,company logo,方法： 1） gst融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cdna表达得到的未知蛋白） 2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4c 2h 3）离心弃上清 4）沉淀加入2 蛋白loading buffer煮沸，离心 5）取上清进行sds-page电泳， 6）考

28、马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做western blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白 注意：该实验设立gst对照，反应均在4c进行,gst-pulldown assay,company logo,company logo,原理： 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。 优点：生理条件下的结合 缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的

29、蛋白质蛋白质相互作用,免疫共沉淀,company logo,1）细胞裂解 采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（np40或triton x-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。 不能用高浓度的变性剂（0.2sds)，细胞裂解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的cocktailer。 2）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。 3) 对照实验的设计。,注意事项,company logo,实验基本流程,1.提取蛋白 2.在细胞裂解液中加入抗x的抗体 3.孵育后再加入protein a或g(于agarose bead上)若细胞中有

30、与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“yx抗x抗体protein a或g 4.经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。（xy抗原、x抗体）,company logo,co-ip特征,优点 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物,company logo,co-ip特征,局限性 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用； 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。,company logo,实验结果分析,sds-page western blotting分析 质谱分析检测目的蛋白,company logo,实