第三章蛋白质与蛋白质组学.ppt

1、1,第三章蛋白质与蛋白质组学,2,第一节 蛋白质的分子结构 (一) 一级结构:蛋白质分子中氨基酸的排列顺序称为蛋白质的一级结构，包括二硫键的位置,3,（二）二级结构： 概念：是指多肽链中主链的局部构象，不涉及氨基酸侧链在主链上的空间排布。 种类：1. 螺旋 2. 折叠 3. 转角 4. 无规则卷曲 5. 超二级结构,4,5,6,7,是多肽链内相互邻近的几个二级结构单元在空间上进一步靠近、相互作用形成的规则的二级结构聚集体，称为超二级结构,8,9,（三）三级结构：具有二级结构的一条多肽链，由于氨基酸侧链的相互作用，进一步卷曲折叠，形成蛋白质的三级结构，它包括这条多肽链中所有原子的空间排布 结构域

2、,10,结构域,11,（四）四级结构：某些蛋白质由两条或多条肽链组成，每条肽链都具有完整的三级结构，称为该蛋白质的一个亚基。亚基之间通过非共价键结合，形成特定的空间结构，称为该蛋白质的四级结构。,12,第二节 蛋白质的结构与功能的关系,一、一级结构与蛋白质功能的关系 蛋白质的一级结构决定其空间结构，进而决定其生物学功能。 （一）一级结构是构象的基础 核糖核酸酶由124个氨基酸残基组成，其中有8个是半胱氨酸残基，它们在分子内形成4个二硫键,13,核糖核酸酶一级结构,14,（二）一级结构变异可直接影响其功能 基因突变可改变蛋白质的一级结构，使蛋白质生物活性降低或丧失，甚至改变生理功能，而发生疾病。

3、镰状细胞病是由血红蛋白分子结构异常变而引起的分子病,15,血红蛋白 -链上谷氨酸变成缬氨酸,镰刀状贫血病的分子机理,CTCGAG谷 氨酸 CACGUG缬氨酸,16,一个基因缺陷会导致多种症状,17,二、蛋白质的空间结构与功能的关系 蛋白质的空间结构直接决定蛋白质的功能，决定功能蛋白的生物活性。生物体内的很多蛋白质就是在不改变一级结构的前体下，通过改变构象而改变活性，适应代谢需要。 蛋白质的变性 蛋白质的变构 酶的变构调节，血红蛋白,18,（三）辅助蛋白在蛋白质分子折叠中的作用 自组装学说:蛋白质一级结构是构象的基础。多肽链能自发的形成比较稳定的天然结构而具有生物学功能。 辅助组装学说：越来越多

4、的研究发现，新生肽链折叠并组装成有活性的蛋白质的过程，在相当多的情况下需要其它辅助蛋白的帮助。 这类辅助蛋白包括蛋白伴侣和折叠酶。,19,蛋白伴侣 概念：是细胞内参与其它多肽链或寡聚体折叠与组装的一类蛋白质，且在组装完毕后与之分离，并不是这些蛋白质的组成成分。 分布：蛋白伴侣从细菌到人类都广泛存在， 定位于细胞的各个场所。 种类：分子伴侣：与未折叠或部分折叠的蛋白质结合并使其稳定，避免形成错误折叠、聚集或被降解。 伴侣蛋白：直接促进蛋白质折叠。,20,折叠酶类某些蛋白质折叠的限速步骤是共价键的异构化，需要相应的酶催化。主要有肽基脯氨酰顺反异构酶（PPI）和蛋白质二硫键异构酶(PDI)。 PPI

5、在细胞中的基本作用是改变脯氨酸残基形成的肽键的构型，以保证整个蛋白质分子形成正确的构象。 PDI的基本作用是催化巯基与二硫键的可逆反应，当多肽链中有许多半胱氨酸时，可能形成错误的二硫键，进而形成错误的蛋白质构象。PDI可以使错误连接的二硫键断裂，再形成正确的连接。在蛋白质折叠过程中，PDI主要催化含有二硫键的膜蛋白或分泌蛋白的正确折叠。,21,22,第三节蛋白质组与蛋白质组学,基因 蛋白质 执行生命活动 基因组 蛋白质组 完成生命活动 基因组是稳定的，生物体所有不同细胞共享有同一个基因组，并且从机体的发生、发展到衰老、死亡基本稳定不变。 蛋白质组是一个动态的概念,23,一、概念:,蛋白质组:指

6、一个基因组、一个细胞或组织或一种生物体所表达的全部蛋白质. “Proteome”是由蛋白质的”Prote”和基因组的“ome”字母拼接而成. 蛋白质组学: 在整体水平上研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的学科。,24,二、研究内容：,研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律 分为两种类型： 一种是针对细胞或组织的全部蛋白质，也就是着眼点是整个蛋白质组； 一种是以与一个特定的生物学机制或机制相关的全部蛋白质为着眼点，着眼点在局部。,25,分支学科：功能蛋白质组学、表达蛋白质组学、肝脏蛋白质组学、神经蛋白质组学、亚细胞蛋白质组学、血浆蛋白质组学、糖蛋白质组学、疾病蛋白质组学、微生物蛋白质组学和药

7、物蛋白质组学等。,26,三、研究方法：,现阶段蛋白质组的研究分为三个主要步骤 1.应用电泳、层析分离蛋白质（分离）。 2.应用aa组成分析、C和N末端aa序列分析、质谱分析鉴定所分离的蛋白质（鉴定）。 3.应用生物信息学数据库对鉴定结果进行储存、处理、对比和分析（总结）。最终构建出细胞的“功能图”,27,（一）蛋白质相互作用的研究方法 酵母双杂交系统： 报告基因转录调控区 组成 报告基因 一对可相互作用的杂交反式作用因子 N-端：报告基因转录因子特异DNA结合区 杂交反式作用因子1 C-端：调控目的基因转录的反式作用因子 proteinX N-端：报告基因转录因子转录活化区 杂交反式作用因子2

8、 C-端：调控目的基因转录的另一种反式作用 因子 proteinY,28,报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。,29,30,（二）蛋白质与核酸

9、间相互作用的研究 研究基因表达调控 方法:凝胶滞后实验,31,（三）蛋白质组的分离及分析 蛋白质组的最主要方法是二维凝胶电泳(2-DE) 1.组成: 等电聚焦凝胶电泳(IEF) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 2.基本步骤: 样品的制备IPG胶的制备双向电泳蛋白质染色分析鉴定,32,33,34,35,36,四、研究意义,1.蛋白质组与基因组的关系： 基因是遗传信息的携带者，蛋白质是生命活动的执行者。每一种生命运动形式，都是特定蛋白质群体在不同时间或空间出现并发挥功能的结果。 DNA提供的信息是静态的，而执行生命活动的蛋白质是动态的。 基因数目与所表达的蛋白质数目并不相符。 基因组测序的成功为蛋白质

10、组的研究奠定了良好基础。,37,2.蛋白质组学与医学,疾病与诊断： 肿瘤,神经系统疾病,传染病,新药开发,38,第四节 蛋白质分析技术,一、蛋白质的分离纯化 蛋白质分离：利用各种方法将蛋白质与其它分子的混合物或者不同种类蛋白质的混合物分成单一蛋白成分的过程。 蛋白质纯化：通过分离技术获得目的蛋白的单一成分纯品的过程。 分离 纯化,39,40,（一）材料的选择 原则： 1.材料易得 体液 组织细胞（动物、植物） 微生物 2.目的蛋白质含量高,41,（二）细胞破碎的方法 1.机械法 1）匀浆 破碎软组织 2）组织捣碎机方法 3）研磨 破碎单一细胞 2.物理法 1）超声波 2）反复冻融法 3）冷热交

11、替法 4）低渗裂解,42,3.化学法 1）有机溶剂法 2）表面活性剂 3）酶解法 （三）蛋白质混合物的分离方法 1.利用溶解度差异的分离方法 1）盐析法 盐溶 盐析 2）有机溶剂沉淀法 3）等电点法 4）温度的影响,43,例如:血浆蛋白质的分离 为纤维蛋白原；+为-球蛋白、-球蛋白、凝集素；为-球蛋白；为-球蛋白、 -球蛋白; 为清蛋白。,44,2.根据分子量不同的分离方法 1）透析和超滤 2）平衡离心法 差速离心法 速度区带离心法 3）凝胶过滤层析,45,46,凝胶过滤层析,47,48,3.根据电荷不同的分离方法 1）电泳 自由电泳和区带电泳 等电聚焦 毛细管电泳 2）离子交换层析 4.亲和

12、层析,49,带正电荷多蛋白紧密结合,带负电荷多蛋白流过层析柱,阳离子交换树脂工作示意图,50,51,52,（四）蛋白质分离纯化的条件 1.缓冲液 2.盐、金属离子和螯合剂 3.还原剂 4.去垢剂 5.蛋白酶抑制剂 6.蛋白质的环境因素 表面效应 温度 储存,53,二、Western印迹技术 （一）原理：将经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白质转移到特定的固相支持物上，用第一抗体特异与他的抗原决定簇结合，结合后的抗体与带有某种标记的第二抗体结合而被检测。 （二）操作步骤： 1.蛋白质样品的制备 2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.蛋白质的电转移,54,55,4.靶蛋白的免疫学检测 1）封闭

13、2）靶蛋白与第一抗体反应 3）与第二抗体反应 4）显色,56,57,主要用于分析蛋白质样品中是否存在目的蛋白，并进行半定量分析,58,第五节 朊病毒,什么是朊病毒（prion） 是一种不同于其他致病微生物,可引起一组人和动物神经退行性病变的病原体 （病毒 类病毒 细菌 真菌 寄生虫） 特点：没有核酸，只有单纯蛋白质,59,一、生物学特性 人和哺乳动物： 正常的朊病毒蛋白前体（朊蛋白 PrPC） 致病性朊病毒蛋白前体（PrPSC） 朊病毒蛋白（PrP） 结构：未成熟：仓鼠和小鼠 254个氨基酸 人 253个氨基酸 成熟：208个氨基酸的糖蛋白,60,PrPC与PrPSC的比较 特性 PrPC P

14、rPSC 分子量 3335 3335 氨基酸序列 相同 相同 空间构象 -螺旋 42 30 -折叠 3 45 蛋白酶K 完全消化 部分被消化产生PrP2730 -螺旋21 -折叠 54 正常脑组织 存在 不存在 感染脑组织 存在 存在,61,正常脑组织中只有PrPC 患病脑组织中有PrPC和PrPSC PrPC PrPSC PrP2730 转变条件：感染PrPSC 基因突变PrPC自发转变为PrPSC 特点：极强的生命力和感染力 10克患病脑组织可使上亿只老鼠致病 抵抗力很强：耐热120130OC耐受4小时，耐甲醛,62,二、朊病毒蛋白基因结构 人：20号染色体 鼠：2号染色体 酵母菌、果蝇、

15、线虫均有 研究发现： 人类PrP基因有20余种突变 突变部位主要在4个螺旋区 PrPC自发转变 PrPSC,63,三、复制过程 方式：自我复制 两种机制 1.模板依赖形式 PrPSC PrPC PrP-蛋白X PrPSC- PrP-蛋白X 2 PrPSC+蛋白X （游离） （结合）,64,2.成核-聚合形式 PrPSC + PrPC PrPSC- PrPC 4 PrPSC 2 PrPC + 2 PrPSC,65,66,四、朊病毒病 1.种类： 人：震颤病 （库鲁病） 纹状体脊髓变性病（CJD） 脑软化症（GSS） 致死性家族性失眠症 （FFI） 动物：羊瘙痒病 疯牛病 遗传性 传染性 散在发病,67,2.特点： 潜伏期长 数月数年 病程进展缓慢 数年数十年 最终死亡 损伤中枢神经系统，引起海绵样变 3.致病机理： PrPC的分布和生理功能 a.分布：神经元、神经胶质细胞、小胶质细 胞、T、B淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞、肌细胞,68,b.生理功能： 神经系统： 在PrPC缺陷的鼠脑片中发现 GABA-型抑制电流及外源性铜和过氧化氢等应激诱导剂应答方面改变 PrPC缺陷的鼠神经元培养时 存活能力下降 对铜和阿糖胞苷