血液细胞组织化学幻灯片.ppt

1、血液细胞化学染色的检测方法和应用，石清，概述，细胞化学染色是在组织化学基础上发展起来的一个分支，组织化学是细胞学和化学相结合形成的一门科学。它研究细胞的化学成分，在保留血细胞形态的基础上就地显示化学反应的结果，并根据化学反应原理研究细胞成分的化学性质。研究正常血细胞的活性和生理功能，提高血液疾病的诊断和鉴别诊断水平，确定急性白血病的类型，有助于某些血液疾病的鉴别诊断，有助于疗效观察和预后评估，有助于探讨某些血液疾病的发病机制和治疗机制，有助于选择标本，对骨髓片、血片、淋巴结片和脾片进行组织化学染色。用于酶染色的标本应尽可能新鲜。用于非酶染色的样品可在室温下保存1个月，如PAS样品。固定的目的和

2、方法目的在活体前保持细胞的结构和化学成分，使血膜在染色和洗涤过程中不易脱落和损坏。甲醛蒸汽固色是一种常见的化学固色方法：将滤纸铺在染缸底部，加入少量40%的甲醛溶液。将涂片标本放入圆筒内，盖上血膜，用甲醛蒸气固定5-10分钟，水洗后晾干。液体固定：常用的固定液有乙醇、丙酮、甲醇、甲醛等。也可以使用由两种或多种组分组成的混合固定液。显示法、纯化学法、金属沉淀法、偶氮偶合法、联苯胺颜料法、希夫反应、普鲁士蓝反应、化学法、物理法、双重染色法、双重染色法是一种便于观察细胞内化学成分发展后的比较染色法。核双染法：常用的染料有苏木精、甲基绿、核固红、沙黄等。细胞质染色：常用的染料有曙红、淡绿色等。过氧化物

3、酶染色)。目的：急性髓系白血病在鉴别诊断中：急性髓系白血病阳性：阴性，分布特征-1，原粒细胞：阴性，而副粒细胞白血病可为阳性。中性粒细胞：随着早幼粒细胞的成熟，阳性强度增加。阳性颗粒圆形、规则，直径与喜苏丹黑色颗粒相似，但大于赖特染色的特殊颗粒。嗜酸性粒细胞：阳性反应，颗粒较大，比中性粒细胞染色深。嗜碱性粒细胞：慢性粒细胞白血病可能出现阴性反应和阳性反应。分布特征-2。在粒细胞系统中，过氧化物酶颗粒的出现和增加与特殊颗粒的出现和增加是平行的。单核细胞系：原始单细胞呈阴性反应，而年轻单细胞和单核细胞呈弱阳性反应。正粒子越来越少，而且它们是分散的，其中一些还会表现出负反应。其他细胞：淋巴细胞、巨核

4、细胞、血小板、红细胞、浆细胞和组织细胞均呈阴性反应。一些吞噬细胞可以显示阳性反应。0.3%联苯胺醇溶液和0.3g联苯胺95%乙醇完全溶解后，加入1毫升饱和亚硝基铁氰化钠水溶液。它可以储存1-2年。过氧化氢溶液的制备：3%过氧化氢，1滴蒸馏水，5ml，每次必须新鲜制备。在染色步骤中，将38滴复合联苯胺染料溶液滴在新鲜涂片上，以覆盖涂片。12分钟后，加入等量的过氧化氢溶液。48分钟后，用水冲洗并晾干。用雷耶斯染料溶液重新染色，干燥并用油镜观察。根据染色原理，粒细胞和一些单核细胞胞浆中的颗粒含有过氧化物酶，能分解过氧化氢，释放新的生态氧。从而将无色联苯胺氧化成蓝色联苯胺蓝。联苯胺蓝是一种不稳定的中间

5、产物，可进一步氧化成棕色化合物。结果，判断阳性反应是位于细胞质中的蓝色或蓝棕色颗粒。临床意义：当ALL时，原始细胞的POX阳性率小于3%。在急性髓系白血病中，原始细胞的阳性率为3%。在大多数M1、大多数M2和M3，pos在骨髓增生异常综合征中，当粒细胞白血病和感染引起的白细胞增加时，成熟中性粒细胞的痘活性可能降低或消失。在慢性粒细胞白血病中，成熟中性粒细胞的痘活性增加。注意，固定的血膜不能再用过氧化物酶染色，因为酶已经被破坏了。所用的过氧化氢必须是新鲜的，当它加入到血膜中时应该会产生泡沫。红细胞过量时会出现假阳性。过氧化氢的浓度应适当增加和减少。如果过量，粒子的颜色将是暗的，如果不足，粒子的颜

6、色将是亮的。滴过氧化氢溶液后，最好将染料放在台上，用低倍镜观察，当细胞质中出现阳性颗粒时，立即用水冲洗。周期性酸性希夫反应(PAS)，目的，红白血病的鉴别诊断(-)，骨髓增生异常综合征和巨幼细胞性贫血的鉴别诊断(-)，单核细胞性白血病的鉴别诊断()和组织细胞病的鉴别诊断(MH)淋巴肉瘤，霍奇金病和急性淋巴细胞性白血病的鉴别诊断，戈谢病和尼曼-皮克病，试剂-1，10g/L周期性酸性溶液希夫染料溶液：碱性品红0.5g DH2O 100ml DH2O煮沸一会儿，加入碱性品红，振荡几分钟以溶解品红，冷却至50冷却至25后，加入0.5g焦亚硫酸钠，混合，放入带塞子的棕色瓶中，避光放置24小时。染液是无色

7、的。如果是红色，加入12克活性炭，混合并过滤。如果滤液仍然是红色，加入少量活性炭，直到红色完全被吸收。把它放在棕色瓶子里，放在冰箱里备用。如果它变成红色，就不能用了。试剂-2，苏木精溶液：苏木精0.9g 95乙醇10ml铵(钾)明矾20g DH2O 200ml将苏木精溶于95乙醇中，明矾溶于水(可加热)，然后将苏木精溶液加入明矾溶液中混合，用武火煮沸，加入0.5g氧化汞，迅速搅拌，变成深紫色，迅速移入冷水中，第二天过滤，立即使用。染色步骤：用95%乙醇固定新的血液或骨髓切片10分钟。10g/L高碘酸盐溶液20分钟，DH2O洗涤1分钟，空气干燥希夫染料溶液，用自来水洗涤15分钟60分钟(用长流量

8、水洗涤)，和苏木精染料溶液10分钟。用自来水冲洗15分钟，等待干显微镜检查。根据染色原理，高碘酸盐可以将细胞中多糖的乙二醇基团氧化成二醛，然后与位于细胞质中的无色品红希夫溶液结合。结果，在AMLM6中，正常的骨髓和有核红细胞几乎都表现出阴性反应，并且年轻的红细胞对PAS呈强阳性。中性粒细胞：大多数原粒细胞为阴性，PAS在早期未成熟阶段开始时为阳性，然后在每个阶段逐渐增加。巨核细胞和血小板：不含糖原，但含粘多糖，因此巨核细胞细且呈弥漫阳性，血小板呈粉红色。所有：它可以是致密的粗颗粒，精细分散的颗粒，或这两种颗粒的混合物。ALL的PAS也可能是负的，尤其是在L3中。在单核细胞白血病中，原始单细胞通

9、常是阴性的，年轻和成熟的单细胞可能是弱阳性或弥漫性阳性。注意事项：1)希夫液变红，不能再次使用。2)碱性品红的质量非常重要。如果碱性品红不合格，加入活性炭后颜色不会被吸附。如果没有苏木精复染液，可以用1%的亚甲蓝复染代替，扣25分。非特异性酯酶染色，原理，非特异性酯酶是一种作用于短链脂肪的酶。当酯酶活性存在时，基质中的萘酚乙酸酯被水解并与重氮盐偶联形成不溶性有机产物，这些产物位于细胞质中。试剂，甲醛：基质溶液：1/15M磷酸盐缓冲液PH7.4 40ml 10g/L萘酚乙酸酯50丙酮溶液0.8ml重氮蓝B) 40mg。方法：新鲜涂片用甲醛蒸气固定5min。用自来水冲洗5分钟，然后晾干。将其放入基

10、质溶液中371小时，用水浸泡10分钟。20克/升亚甲基绿复染20-30分钟。用水清洗，在空气中干燥，并进行显微镜检查。临床意义：单核细胞系统是阳性的，随着细胞的成熟而增强，并具有不同的功能非特异性酯酶-氟化钠抑制试验与非特异性酯酶相同，只是在1毫升溶液中加入1.5毫克氟化钠，可抑制单核细胞的酯酶，因此可用于急性单核细胞白血病的鉴别诊断。急性白血病组织化学染色，白血病POX NSE PAS ALL AML M0 M1 (3个原细胞)M2 M3 M4(原细胞)M5/M6(原细胞)(红细胞)M7，中性粒细胞碱性磷酸酶染色(AKP)，客观，区分白血病(低)和白血病样(高)反应，区分淋巴肉瘤(高)和霍奇

11、金病，区分细菌感染(高)和病毒感染，分布，血细胞碱性磷酸酶活性，主要见于成熟中性粒细胞，位于细胞质中。原理上，细胞中的AKP可以水解基质中的萘酚磷酸钠，并在PH9.59.6缓冲溶液中释放萘酚。后者与稳定的重氮盐(通常用作快速石榴石、GBC或RR)结合形成不溶性偶氮染料，并沉积在细胞上。试剂，95%乙醇，柠檬黄GBC AS-BI，萘酚磷酸酯，12.5毫克d H2O，100毫升，0.2毫升tris缓冲液：2.43克DH2O，溶解至100毫升。0.05毫升tris缓冲液(ph 8.6-9.0):0.2毫升tris缓冲液25毫升0.1毫升HCL 49ml毫升储存溶液：50毫升AS-BI萘酚磷酸盐PH8

12、.8 0.05毫升tris缓冲液50毫升，在冰箱中储存1%甲基绿，染色步骤。新鲜的骨髓切片和血液切片应干燥并用95%的乙醇固定10分钟，然后将1毫克2毫升的储存溶液混合均匀，并立即滴几滴在血液切片或骨髓切片上，然后在37个恒温箱中孵育30分钟，用蒸馏水快速洗涤，在1%甲基绿中再染色5分钟，用蒸馏水快速洗涤，干燥，并通过显微镜检查。结果表明，阳性颗粒呈红色，位于成熟中性粒细胞的细胞质中。计数法，根据碱性酶活性的强弱，可分为5个等级：0-4。评分特征：细胞质内无红色颗粒0分，弥漫性红色1分，偶见性红色颗粒2分，中度红色颗粒3分，较多红色颗粒4分，粗颗粒充满细胞质。计算积分。分数细胞数积分0 20

13、0 1 45 45 2 25 50 3 5 15 4 5 20总计100 130=LAP积分，临床意义上，正常LAP积分是20100点，但由于计数的主观性，建立每个实验室的正常值非常重要。临床诊断评分正常，20100慢粒，13白血病，100真红，100200继发性红细胞增多症，10100铁颗粒染色，原则上，骨髓颗粒中的含铁血黄素称为细胞外铁，其中三价铁与分子中的蛋白质结合不牢固，经稀盐酸处理后可释放，在酸性亚铁氰化钾溶液中可发生普鲁士蓝反应。细胞内铁也可以通过这种方法显示。根据反应强度了解骨髓中铁的含量。试剂，酸性亚铁氰化钾溶液：200克/升亚铁氰化钾溶液5份浓盐酸1份取200克/升亚铁氰化钾

14、溶液置于试管中，缓慢加入浓盐酸，边滴加边摇匀，直至出现白色沉淀，然后滴加200克/升亚铁氰化钾，边滴加边摇匀，直至白色沉淀消失，以备后用。2克/升固核红硫酸铝溶液：取10克硫酸铝，加入100毫升DH2O，然后加入0.2克固核红EMER，置于37水浴中1小时，经常摇动，溶解，过滤备用。方法：将酸性亚铁氰化钾滴在富含骨髓颗粒的骨髓涂片上，染色30分钟。(可置于37)用DH2O冲洗，然后用固核红色染色溶液再染色1015分钟。用自来水冲洗，干燥，并用油镜检查。结果：正常人细胞外铁：年轻红细胞为鲜红色，细胞质为黄绿色，铁颗粒为蓝绿色。细胞外铁的评价用低倍显微镜观察涂片，特别是在涂片尾部和骨髓颗粒附近。细胞外铁的判断标准，有少数铁颗粒无颗粒或偶有铁颗粒较多的铁珠和有许多铁颗粒的珠，珠和有许多铁颗粒的几个小块，以及有许多小块的珠密集堆积，而有铁颗粒的年轻红细胞的分类如下：1型只含有一种铁颗粒，2型含有25种铁颗粒，3型含有69种铁颗粒， 第4型含有10个以上的铁颗粒，环状幼细胞内有铁颗粒，有6个以上的含铁颗粒，其中2/3以上的铁颗粒排列成一个完整的环或不完整的环围绕着细胞核(围绕着细胞核，它们分布在靠近或接近细胞核的1/3细胞质中； 当铁颗粒增加时，它们可以分布在外2/3的细胞质中。临床意义，IDA:骨髓细胞中细胞外铁和细胞内铁明显减少或消失，铁颗粒红细胞阳性率为0.16，铁颗粒少且颜色浅，