干细胞技术课件.ppt

1、第十五章 干细胞技术,主 要 内 容,干细胞概述（定义、特征、分类、研究进展） 干细胞的培养 干细胞的应用,一、干细胞概述,1、概念： 干细胞是动物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我复制和不同程度分化潜能的一些细胞。在一定条件下，能分裂、产生出表现型和基因型都和自己完全相同的子细胞，同时还能分化为各类祖细胞和特化细胞。,一、概述,干细胞是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞。 干细胞除了在细胞治疗、组织器官移植、基因治疗具重要意义外，还在新基因发现与基因功能分析、发育生物学研究、新药开发与药效以及毒性评估等领域具有重要的意义。,一、概述,干细胞研究1999年被Science评为十大

2、科技进展之首；2000年再度入选世界十大科技进展。 美国诺贝尔奖获得者吉尔伯特预言： “用不了50年，人类将能够培育出人体的所有器官。”,一、概 述,2、干细胞的特征： 具有无限增殖分裂的能力； 长期保持自我稳定的能力； 长期保持分化成其它细胞的可能性； 产生新细胞是对组织（细胞）损伤的反应； 以对称或不对称两种方式进行生长（由细胞质中调节分化蛋白的不均匀分配决定）。,2、干细胞的特征：,对称分裂(symmet ric cell division) , 形成两个相同的子干细胞; 非对称分裂(asymmet ric ccell division) , 即干细胞分裂后的两个子细胞一个为干细胞, 而

3、另一个为祖细胞, 祖细胞在外界刺激因子的作用下可以向多个细胞系的终末期分化。,形态学特征： 细胞小，核较大，明显，有1至多个核仁； 细胞间界限清晰，形态扁平； 碱性磷酸酶（AKP）染色阳性； 细胞克隆如鸟巢状；,2、干细胞的特征：,一、概 述,3、分类： （1）、按来源分： 胚胎干细胞（ESC）： 胚胎内细胞团（ICM） 原始生殖细胞（PGC） 成体干细胞（ASC）：骨髓、角膜、皮肤、心脏等,一、概 述,3、分类： （2）、按分化潜能分： 全能干细胞：受精卵及八胞期以前的卵裂球 多能干细胞：骨髓造血干细胞 分化12种血细胞 专能干细胞：大多数成体干细胞，如上皮组织基底层的干细胞，一般处于稳定更

4、新状态，组织损伤时分化起修复作用。,一、概 述,4、研究进展 1981年，Evans等获得小鼠胚胎干细胞； 1990年，Piedrahita等获得猪和绵羊的胚胎干细胞； 1991年，Meineeke-Tillmann等获得山羊胚胎干细胞； 1992年，Satio等获得牛胚胎干细胞； 1992年，Sukoyan等获得水貂胚胎干细胞； 1993年，Oraves等获得兔胚胎干细胞；,一、概 述,1995年，Thomson等获得恒河猴胚胎干细胞； 1996年，Pain等获得鸡胚胎干细胞； 1997年美国华盛顿大学的多纳尔托马斯报告说，将正常人的骨髓移植到病人体内，可以治疗造血功能障碍； 1998年，T

5、homson和Shamblott实验室分别用人的胚泡和早期胚胎的生殖嵴培养出胚胎干细胞（ES）和生殖嵴干细胞（Embryonic germ stem cell）；,一、概 述,在一些原本认为不可更新的组织中发现干细胞，如：亚脑室区、侧脑室区和嗅球的连接处以及海马区； 目前已发现存在干细胞的组织有：骨髓、外周血、脐血、血管、脑、脊髓、皮肤、骨骼肌、肝脏、胰腺、角膜、视网膜、牙齿和消化系统上皮等。,一、概 述,1999年12月，美国科学家在美国科学院院刊报告说，小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞。随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞包括人类的成体干细胞具有可塑性。骨髓间充质干

6、细胞可分化为骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、神经元细胞等。 避开了伦理争议和异体免疫排斥问题。,一、概 述,2001年4月，美国科学家发现，从病人臀部和大腿处抽取的脂肪中，含有大量类似干细胞的细胞，这些细胞可以发育成健康的软骨和肌肉等。这一发现有可能使脂肪成为干细胞的主要来源。 2004年12月，法国科学家发现，通过培育人类干细胞可以将每个干细胞转化为200万个红血球。 该发现向着数十年来批量制造红细胞的目标又迈进了一大步，该研究将最终使得血液短缺成为历史。,一、概 述,2005年2月加拿大科学家在人体脐带中发现一种新的干细胞源。这种干细胞可以生成骨胳、软骨、肌肉和其他结缔组织。 把在结缔组织中发

7、现的这些干细胞分离、培养几周，生成了足够多的细胞。 这项发现将对骨髓移植有促进作用。,一、概 述,2005年1月，台大医院陈耀昌等医生从新鲜胎盘分离出胎盘间质干细胞，是介于“胚胎干细胞”与“成体干细胞”间的新种干细胞； 放入培养基中诱导分化，大约5到7天后，干细胞分别成功分化为神经、脂肪、成骨细胞。 与脐带血干细胞相比，胎盘干细胞的数量更充裕。,一、概 述,2005年1月30日在美国威斯康星大学工作的中国科学家张素春和李学军报告说，他们成功地用人类胚胎干细胞分化出了运动神经元。 研究发现只有在相当于人类胚胎发育第三周到第四周这一段时间里，胚胎干细胞才有可能分化成运动神经元。具体为： 胚胎干细胞

8、 神经干细胞 运动神经元祖细胞 运动神经元,一、概 述,2000年5月，日本把干细胞技术的出现视作在生命科学和生物技术领域赶超欧美国家的绝好机遇。在2000年度启动的“千年世纪工程”中，日本把干细胞工程作为四大重点之一，并且在第一年度就投入108亿日元的巨额资金； 2000年12月19日，英国下议院也超过23的多数票通过了允许克隆人类早期胚胎，并从中提取干细胞进行医疗研究的决议。,一、概 述,5、干细胞的分化 干细胞的可塑性： 骨髓干细胞 神经细胞 神经干细胞 造血细胞 骨髓肌间叶干细胞 造血细胞,一、概 述,5、干细胞的分化 迄今为止，触发和控制细胞分化的机制尚不明了，是预先程序化还是受环境

9、的调控是一个有争议的话题。 内在调控：转录因子，端粒酶活性，结构蛋白等以各种方式影响干细胞的有丝分裂、分裂部位及染色体的功能；,一、概 述,5、干细胞的分化 外在调控(微环境)： 整合素：细胞受损时，胞外信息通过整合素传递给干细胞，以触发跨膜信号转导，调控干细胞的基因表达； 细胞因子：干细胞因子，干细胞生长因子，白细胞介素，表皮细胞生长因子，成纤维细胞生长因子，肝细胞生长因子等；,二、干细胞的培养,获得干细胞系（干细胞的分离、培养、鉴定）； 建立干细胞诱导分化模型 ； 将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织，考察其效果。,二、干细胞的培养,干细胞的伦理和社会问题： 英国200

10、0年通过了准许在严格管理的条件下克隆人类早期胚胎进行干细胞研究； 美国总统布什在2001年8月宣布，美国政府将仅仅支持对已有的胚胎干细胞进行研究； 德国不仅只允许研究2002年1月30日以前产生的胚胎干细胞，而且还必须是在没有其它可选择的情况下才能进行。 中国对胚胎干细胞研究，即治疗性克隆持支持态度。,二、干细胞的培养,（一）、获得干细胞系： 这是本研究最重要的第一步。可以从动物或人的早期胚胎或各器官、组织中分离并鉴定，能在体外长期保持干细胞特性（一般应稳定传25代以上）。,二、干细胞的培养,（一）、获得干细胞系： 1、分离纯化技术： 密度梯度离心：BSA；Ficoll；泛影酸盐 选择性细胞凝

11、聚：例红细胞 可用羟乙基淀粉、甲基纤维素、T淋巴细胞进行凝聚和其他细胞分离 差异黏附分离：葡聚糖凝胶G10。成纤维细胞 细胞表面物质分选：如抗原分选，例免疫磁珠分选法。,二、干细胞的培养,（一）、获得干细胞系： 免疫磁珠分选： 中心：金属小颗粒 外层：包裹了一层高分子材料，如聚苯乙烯 最外层：能与大分子偶联的功能集团如抗原或抗体,二、干细胞的培养,2、培养 (1)、一般采用饲养层培养法。饲养层细胞： 提供附植环境； 饲养层细胞分泌物对维持干细胞的生长、抑制分化起重要作用； (2)、也可采用条件培养基进行培养。,二、干细胞的培养,3、干细胞的鉴定 细胞周期特征： 慢周期性（标记滞留法）； 无限增

12、殖能力，形成细胞克隆； 干细胞表面受体鉴别： 荧光素标记； 受体结合标记；,二、干细胞的培养,（二）、建立干细胞诱导分化模型 ； 探索诱导干细胞向特定组织、器官分化的条件； 二甲亚砜可诱导肌细胞分化；维甲酸可诱导神经细胞分 （三）、移植研究 植入动物或人的相应器官或组织，考察其效果。,三、干细胞的应用,细胞治疗、组织器官移植、基因治疗 新基因发现与基因功能分析 发育生物学研究 新药开发与药效以及毒性评估,三、干细胞的应用,神经干细胞治疗帕金森病的研究应用 表皮干细胞的研究应用 造血干细胞移植治疗白血病,神经干细胞治疗帕金森病的研究应用,帕金森病（Parkinsons disease，PD）又称

13、震颤麻痹，是锥体外系功能紊乱引起的一种慢性中枢神经系统神经退行性疾病，由英国人James Parkinson首次描述。此病的主要体征有：肌强直，肌无力，运动迟缓；非自愿的震颤，以手、踝常见；少动。 病因学说：到目前为止，只有多巴胺缺失学说得到大多数学者的公认。该学说认为，帕金森病是由于纹状体内多巴胺（dopamine, DA）减少所致，而纹状体内DA的减少主要是由于黑质受损变性所致。,神经干细胞治疗帕金森病的研究应用,目前药物治疗并不能完全治愈该病 。 神经干细胞：首例人胎脑NSCs移植治疗帕金森症( Parkinsonps disease,PD)在瑞典获得成功以来,全球已有约360例患者在17个中心接受了该类手术。但每名患者至少需5 - 10个流产胚胎,从而面临来源有限和道德法律限制等多方面问题。 研究确定:原始的人类胚胎细胞和鼠胚胎干细胞能够变成全功能的多巴胺干细胞。,表皮干细胞的研究应用,表皮基底部具有不断增殖和分化能力的干细胞称为表皮干细胞 （ Epidermal stem cell, ESC） 创伤修复：刺激或诱导患者自身创面残存的上皮细胞来修复创面。 基因治疗： Mavilio 等把表达层黏连蛋白53 cDNA(LAM5-bata3)的逆转录病毒载体转移到LAMB3缺陷的JEB患者表皮干细胞内进行体外培养，然后将这些细胞移植到患者病变部位。在