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文档简介

1、.,PCR 反应体系,.,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,.,3,通用PCR反应体系,某些公司生产的buffer会预先含有Mg离子，因此不必额外再添加Mg离子。,.,4,缓冲液(buffer)：提供合适的pH值和DNA聚合酶的激活剂10mM TrisHCl （ pH8.3-9.0），1.5mM MgCl2，50mM K+,多次冻融会使dNTP 降解。如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR 产物的产量。,Mg2+浓度过高，反应特异性降低,出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA 聚合酶的活性,使反应产物减少。,dNTP（

2、底物）：等摩尔浓度的 4 种 dNTP（即 dATP、 dTTP、dCTP和dGTP），终浓度一般为 0.2mM（即饱和浓度）， dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和保真度。,.,引物(Primer)： 1M/L,上游引物：与目的序列5端相同 下游引物：与目的序列3端互补,上游引物,下游引物,注：当双链解开成单链后，引物总是结合于靶序列的3端。,5,.,6,模板：单、双链DNA均可。 模板的纯度要求不是很高，但其数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,目前有两种Taq DNA 聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。 催化一典型的PCR 反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。,DNA聚合酶： 最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75。 Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3-5 外切酶活性（高

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