zql 第二章气相色谱-第三章高效液相色谱.ppt

1、第二章 气相色谱分析,Chapter two Gas Chromatography (GC),21 气相色谱法概述,一.概述 分离、分析混合物的最有效方法。 俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置是色谱原型装置，如右图。,现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的，仍然称它为色谱分析。,色谱法是一种分离技术，试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在色谱分离柱中两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。,与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的高效分离与

2、灵敏检测。 两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础。分离的动力为各组分在性质和结构上的差异导致其与固定相之间作用力有强弱。,三.色谱分类,色谱分析法有很多种类，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。,1.从两相的状态分类： 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体，由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在固体上的液体，分类情况如下：,2.按固定相的状态分类： 柱色谱：固定相装在色谱柱中； 纸色谱：利用滤纸作载体，吸附在纸上的水作固定相； 薄层色谱：将固体吸附剂在玻璃板或塑料板上制成薄层作固定相。,3.按分离原理分类： 1)吸附色谱法：利用吸附剂（固定相

3、一般是固体）表面对不同组分吸附能力的差别进行分离的方法；,2)分配色谱法：利用不同组分在两相间的分配系数的差别进行分离的方法。,3) 离子交换色谱：利用溶液中不同离子与离子交换剂间的交换能力的不同而进行分离的方法。 4)空间排斥（阻）色谱法：利用多孔性物质对不同大小的分子的排阻作用进行分离的方法。,四、气相色谱仪的工作过程,载气系统,记录处理系统,1. 气路系统 包括气源、净化干燥管和载气流速控制；,1-载气钢瓶； 2-减压阀； 3-净化干燥管； 4-针形阀； 5-流量计; 6-压力表；,气路系统将样品载入色谱柱分离后进入检测器测定； 气路系统要求气密性好、载气流量稳定和测量流量准确； 气相色

4、谱常用的载气为氮气、氢气和氦气等。载气的选择主要由检测器性质及分离要求所决定； 载气在进入色谱仪前必须经过净化处理；去除载气中的水、有机物等杂质（依次通过分子筛、活性炭等）； 载气流量由稳压阀或稳流阀调节控制。,2、进样系统,气化室的作用是将液体或固体样品瞬间气化而不分解,后进柱分离 要求: 热容量较大, 死体积较小,无催化效应,进样器：液体样品的进样通常采用微量注射器，气体样品的进样通常采用医用注射器或六通阀。,气化室：,进样装置：进样器+气化室；,3. 分离系统,色谱柱：色谱仪的核心部件。 柱材质：不锈钢管或玻璃管，内径3-6毫米。长度可根据需要确定。 柱填料：粒度为60-80或80-10

5、0目的色谱固定相。 液-固色谱：固体吸附剂；液-液色谱：担体+固定液 柱制备对柱效有较大影响，填料装填太紧，柱前压力大，流速慢或将柱堵死，反之空隙体积大，柱效低。,4. 检测系统,色谱仪的眼睛， 通常由检测元件、放大器、显示记录三部分组成；被色谱柱分离后的组分依次进入检测器，按其浓度(浓度型， 如热导检测器)或质量(质量型，如氢火焰离子化检测器)随时间的变化，转化成相应电信号，经放大后记录和显示，给出色谱图； 广普型对所有物质均有响应；热导检测器； 专属型对特定物质有高灵敏响应；电子俘获检测器；,温度控制,温度是色谱分离条件的重要选择参数； 气化室、分离室、检测器三部分在色谱仪操作时均需控制温

6、度； 气化室：保证液体试样瞬间气化而不分解（一般比柱温高10-50 C）； 检测器：保证被分离后的组分通过时不在此冷凝，而且温度影响检测器灵敏度和稳定性，一般控温精度要求由于0.1 C,分离室：准确控制分离需要的温度。当试样为沸点范围很宽的混合物时，分离室温度需要按一定程序控制温度变化（程序升温），各组分在最佳温度下分离，从而改善分离效果，缩短分析时间。,5. 记录和数据处理系统色谱工作站,五、色谱流出曲线 从载气带着组分进入色谱柱起就用检测器检测流出柱后的气体，并记录信号随时间变化的曲线，此曲线就叫色谱流出曲线。,六、色谱术语 1. 基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出

7、曲线称为基线。基线在稳定的条件下应是一条水平的直线。它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况。,2 峰高（h）和峰面积：色谱峰顶点与基线的距离叫峰高。色谱峰与峰底基线所围成区域的面积叫峰面积。,3. 保留值,1)死时间(tM) ：不与固定相作用的物质（空气）从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。,2)保留时间tR：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的时间tM和组份在固定相中滞留的时间。,3)调整保留时间tR：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即,4)死体积VM：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和

8、检测器间隙的总和。忽略后两项可得到,5) 保留体积VR：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。,6)调整保留体积VR：某组份的保留体积扣除死体积后的体积。,7)相对保留值r2,1（选择因子）：组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。,r2,1 1，两组分热力学性质相同不能分离， r2,1 1是两组分能分离的前提。,注意： r2,1 只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长L、填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据！,用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法： （1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。 （2）半峰

9、宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度 Y1/2 =2.354 （3）峰底宽(Wb)：Wb=4,4. 区域宽度,色谱流出曲线的意义： 色谱峰数=样品中单组份的最少个数； 色谱保留值定性依据； 色谱峰高或面积定量依据； 色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。,22 气相色谱分析理论基础 一.分离过程,色谱分离是色谱体系热力学过程和动力学过程的综合表现。 热力学过程是指：与组分在体系中分配系数相关的过程； 动力学过程是指：组分在该体系两相间扩散和传质的过程。 组分、流动相和固定相三者的热力学性质使不同组分在流动相和固定中具有不同的分配系数，分配系数

10、的大小反映了组分在固定相上的溶解-挥发 或 吸附-解吸的能力。 分配系数大的组分在固定相上溶解或吸附能力强，因此在柱内的移动速度慢；分配系数小的组分在固定相上溶解或吸附能力弱，因此在柱内的移动速度快。 经过一定时间后，由于分配系数的差别，使各组分在柱内形成差速移行，达到分离的目的。,二. 分配系数（partion factor） K,组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示，即：,分配系数不同是色谱分离的依据。,K 是一个无因次量，它是由组分及固定液的热力学性质决定的

11、，只随柱温和柱压而变化，与色谱柱中气相和液相的体积无关。,三. 分配比k 在一定温度和压力下，组份在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比，称为分配比。它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保留因子。也叫容量因子或容量比。,分配比k与分配系数K的关系为：,式中为相比。 填充柱相比：635； 毛细管柱的相比：501500,容量因子越大，保留时间越长。 可由保留时间计算出容量因子，两者有以下关系：,三、塔板理论-柱分离效能指标,色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H， 色谱柱的理论塔板数：n， 则三者的关系为： n = L / H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为：,有效塔板数和有效塔板高

12、度,单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。 组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：,塔板理论的特点和不足：,(1)当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。 (2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。 (3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数 K 相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。 (4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，

13、也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,四、速率理论-影响柱效的因素,速率方程（也称范.弟姆特方程式）: H = A + B/u + Cu H：理论塔板高度，u：载气的线速度(cm/s) 减小A、B、C三项可提高柱效； 存在着最佳流速； A、B、C三项各与哪些因素有关？,1. 涡流扩散项A,A = 2dp dp：固定相的平均颗粒直径 ：固定相的填充不均匀因子,固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。,2. 分子扩散项,B = 2 Dg ：弯曲因子，填充柱色谱， 1。 Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1）。由于柱

14、中存在着浓度差，产生纵向扩散：,a.扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差。 b.分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散 c.扩散系数：Dg （M载气）-1/2 ； M载气，B值,3.传质阻力项 C,组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻力。传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL，液相传质阻力大于气相传质阻力。 即： C =（Cg + CL）,(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。,4. 速率理论的要点,(1)组分分子的涡流扩散、分子扩散及传质阻力是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。,(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明

15、了流速和柱温对柱效及分离的影响。,(4) 各种因素相互制约 如载气流速增大，分子扩散项减小，使柱效提高，但同时传质阻力项增大，又使柱效下降； 柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。,一.分离度,同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为：,用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度R。,R =0.8：两峰的分离程度可达89%； R =1.0：分离程度98%； R =1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。,23 色谱分离条件的选择,一班401宿舍：气相色谱在生物领域的应用 一班402宿舍：高效液相色谱在生物领域的应

16、用 一班403宿舍：电泳（毛细管电泳）在生物领域的应用,令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相邻两峰的峰底宽近似相等），引入相对保留值和塔板数，可导出下式：,二.色谱分离基本方程式,1.分离度R 与柱效的关系 分离度R与理论塔板数n有关，对具一定相对保留值的物质对，R与有效塔板数有关，说明N有效可正确代表柱效能。 由色谱方程可得：,增加柱长（n增加）可提高分离度。然而，分析时间也相应增加，且峰宽也展宽！为提高柱效，用减小塔板高度H的方法比增加柱长更有效。,改变温度可影响分配系数和分配比，改变相比包括改变固定相量Vs和死体积Vm 死体积越小对分离越有利，固定相颗粒细填充紧密而均匀的柱子死体积小。,2

17、.分离度R 分配比k的关系 k很小时，k增加，分离度R增加明显，但当k10，则R的增加不明显,分析时间反而延长很多。通常k在2-7之间。 改变 k 的方法有：改变柱温(GC)、改变相比。,3. 分离度R与选择因子 的关系 越大，柱选择性越好，对分离有利。 的微小变化可引起 R 较大改变。 如，当 从1.01增加至1.10(增加9% )时，R 则增加 9 倍(但1.5, R增加不大) 。 增加 最有效的方法：改变固定相，使组分的分配系数有较大的差别。,例题1：,在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即R=1.5 。计算需要多少块有效塔板。若填充柱的有效塔板高

18、度为0.1 cm，有效柱长是多少？ 解： = 100 / 85 = 1.18 n有效 = 16R2 / (1) 2 = 161.52 (1.18 / 0.18 ) 2 = 1547（块）,L有效 = n有效H有效 = 15470.1 = 155 cm 即柱长为1.55米时，两组分可以得到完全分离。,例题2：,在1m的色谱柱上，两组分的理论塔板数为3600，两个组分的保留时间分别为12.2s和12.8s，计算分离度。要达到完全分离，所需要的柱长是？ 解：,分离度：,塔板数增加一倍，分离度增加多少？,三.分离操作条件的选择,1、载气及其流速的选择,载气种类： u小，分子扩散项起主要作用，应尽量选相

19、对分子质量 大的载气，如：N2,Ar u大，传质阻力项起主要作用，应尽量选相对分子质量 小的载气，如：H2, He 同时考虑载气与检测器的要求相适应（热导检测器： H2, He ）； 对一般的填充柱，N2的最佳实用线速为10-12 cm/s H2的最佳实用线速为15-20 cm/s,色谱分离的操作条件的选择依据：基本色谱分离方程式及范氏理论,载气流速 在最佳流速时板高最小，但为缩短分析时间，往往选略高于最佳流速。,2、柱温的选择,每种固定液都有最高使用温度，柱温不能高于此温度。 提高柱温各组分的挥发靠拢，不利于分离，但柱温太低时组分的扩散变慢，分配平衡不能迅速建立，峰型变宽，柱效较低，分析时间

20、过长。 选择柱温要兼顾几方面的因素。一般原则是：1）在使最难分离的组分有尽可能好的分离度前提下，采取适当低的柱温，但以保留时间适宜，峰形不拖尾为度；,2）对于宽沸程的多组分混合物，可采用程序升温法。 沸点较低的组分在低柱温下良好分离后最早流出。 沸点较高的组分在较高柱温下良好分离后随即流出。,3、固定液的用量 固定液的用量和允许的进样量成正比。 目前盛行低固定液含量的色谱柱，其柱效较高，但允许的进样量也较小。 固定液的用量同时和所采用的担体有关，担体表面积越大，固定液的含量可以高些，其配比一般在5：100 25：100。,4载体的选择 担体均匀而细小，固定液薄而均匀，柱效就愈高。但粒度也不能太

21、小，否则，阻力压急剧增大。一般粒度直径为柱内径的120l25为宜； 5进样时间及进样量 进样时间要短（1s内），使试样进入色谱柱呈“塞子”状； 最大允许进样量应控制在使半峰宽基本不变，而峰高与进样量成线性关系，如果超过最大允许进样量，线性关系遭破坏。,一 热导检测器 thermal conductivity detector,TCD,25 气相色谱检测器,1 热导检测器的结构 池体（一般用不锈钢制成） 热敏元件：电阻率高、电阻温度系数大、且价廉易加工的钨丝制成。 参考臂：仅允许纯载气通过，通常连接在进样装置之前。,测量臂：需要携带被分离组分的载气流过，则连接在紧靠近分离柱出口处。,2检测原理,

22、平衡电桥。 不同的气体有不同的热导系数。,钨丝通电，加热与散热达到平衡后，两臂电阻值： R参=R测 ; R1=R2 则：R参R1=R测R2 无电压信号输出；记录仪走直线（基线）。,进样后:,载气携带试样组分流过测量臂而这时参考臂流过的仍是纯载气，使测量臂的温度改变，引起电阻的变化，测量臂和参考臂的电阻值不等，产生电阻差，R参R测 则 R参R2R测R1,这时电桥失去平衡，a、b两端存在着电位差，有电压信号输出。信号与组分浓度相关。记录仪记录下组分浓度随时间变化的峰状图形。,3. 影响热导检测器灵敏度的因素,桥路电流I ： I，钨丝的温度 ，钨丝与池体之间的温差，有利于热传导，检测器灵敏度提高。检

23、测器的响应值S I3，但稳定性下降，基线不稳。桥路电流太高时，还可能造成钨丝烧坏。 池体温度：池体温度与钨丝温度相差越大，越有利于热传导，检测器的灵敏度也就越高，但池体温度不能低于分离柱温度，以防止试样组分在检测器中冷凝。,载气种类：载气与试样的热导系数相差越大，在检测器两臂中产生的温差和电阻差也就越大，检测灵敏度越高。载气的热导系数大，传热好，通过的桥路电流也可适当加大，则检测灵敏度进一步提高。,表 某些气体与蒸气的热导系数（），单位：J / cms,2 氢火焰离子化检测器 flame ionization detector, FID,1） 特点 (1) 典型的质量型检测器; (2) 对有机

24、化合物具有很高的灵敏度; (3) 无机气体、水、四氯化碳等含氢少或不含氢的物质灵敏度低或不响应; (4) 氢焰检测器具有结构简单、稳定性好、灵敏度高、响应迅速等特点; (5) 比热导检测器的灵敏度高出近3个数量级，检测下限可达10-12gg-1。,(1) 在发射极和收集极之间加有一定的直流电压（100300V）构成一个外加电场。 (2) N2 ：载气携带试样组分； H2 ：为燃气； 空气：助燃气。 使用时需要调整三者的比例关系，检测器灵敏度达到最佳。,2） 结构,A区：预热区 B层：点燃火焰 C层：热裂解区 D层：反应区,被测组分在热裂解区生成的正负离子，在外加恒定直流电场的作用下分别向两极定

25、向运动而产生微电流（约10-610-14A）；在一定范围内，微电流的大小与进入离子室的被测组分质量成正比；离子电流信号输出到记录仪，得到峰面积与组分质量成正比的色谱流出曲线。,3） 原理,3 电子捕获检测器 electron capture detector, ECD,高选择性检测器， 仅对含有卤素、磷、硫、氧等元素的化合物有很高的灵敏度，检测下限10-14 g /mL， 对大多数烃类没有响应。,较多应用于农副产品、食品及环境中农药残留量的测定。,4其它几种检测器,1) 火焰光度检测器(flame photometric detector, FPD),化合物中硫、磷在富氢火焰中被还原，激发后，

26、辐射出400、550 nm 左右的光谱，可被检测； 该检测器是对含硫、磷化合物的高选择性检测器； 2)热离子检测器(thermionic detector, TID) 氮、磷检测器；对氮、磷有高灵敏度； 在FID检测器的喷嘴与收集极之间加一个含硅酸铷的玻璃球，含氮、磷化合物在受热分解时，受硅酸铷作用产生大量电子，信号强； 3)定性检测器(联用仪器) 将两种仪器结合；色-质联用仪,2）最低检测限,噪声水平决定着能被检测到的浓度（或质量）。,从图中可以看出：如果要把信号从本底噪声中识别出来，则组分的响应值就一定要高于N。 检测器响应值为3倍噪声水平时的试样浓度（或质量），被定义为最低检测限（或该物

27、质的最小检测量）。,3）最小检出量Q0,检测器恰能产生和噪声相区别的信号时所需进入色谱柱的最小试样浓度（或质量）。 Q0= 1.065Y1/2qv,0D,一、色谱定性分析,1.利用纯物质定性的方法 利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。 利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。,25 气相色谱定性定量分析,2.利用文献保留值定性 相对保留值r21：相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。

28、,3.保留指数,又称Kovats指数（），是一种重现性较好的定性参数。测定方法： 将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。,4.与其他分析仪器联用的定性方法,小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS；LC-MS） 色谱-红外光谱仪联用仪； 组分的结构鉴定,试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即： m i = fi Ai 绝对校正因子：比例系数f i ，单位面积对应的物质量： f i =m i / Ai 定量校正因子与检测器响应值成倒数关系： f i = 1 / Si 相对校正因子f i ：即组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。,二

29、、色谱定量分析,当mi、mS以摩尔为单位时，所得相对校正因子称为相对摩尔校正因子（f M）,用表示；当mi、mS用质量单位时, 以（f m）,表示。,3. 常用的几种定量方法 （1）归一化法：,特点及要求： 归一化法简便、准确； 进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大； 仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。,（2）内标法,内标物要满足以下要求： （1）试样中不含有该物质； （2）与被测组分性质比较接近； （3）不与试样发生化学反应； （4）出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。 试样配制：准确称取一定量的试样W，加入一定量内标物mS 计算式：,（1） 内标法的准确性较高，操作条

30、件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大。 (2) 每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析。 (3)若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：,特点：,（3）外标法,外标法也称为标准曲线法。,特点及要求： 外标法不使用校正因子，准确性较高; 操作条件变化对结果准确性影响较大; 对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。,第三章 高效液相色谱分析,Chapter Three High Performance Liquid Chromatography （HPLC）,31 高效液相色谱法的特点 一、高效液相色谱法概述 高效液相色谱法（HPLC）在经典液相

31、色谱基础上，采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点，因此得到迅猛的发展。目前已成为应用极为广泛的化学分离分析重要手段。,1高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较,高速：在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cmmin-1. 例如分离氨基酸，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成；,高效：其柱效可达3万塔板/米以上（气相色谱约2000 塔

32、板/米），分离效率大大提高了。,2高效液相色谱法与气相色谱法的比较,（l）气相色谱法分析对象只限于气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20。对于占有机物总数近80的那些高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析；,(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它与组分不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用，因此，可选用不同极性的液体，选择余地大，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便； （3）气相色谱一般都在较高

33、温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作； 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。,32 影响液相色谱分离的因素,气相色谱所讨论的基本概念及基本理论，如：保留 值，分配系数，分配比，分离度，塔板理论，速率理 论等与液相色谱一致，但液相色谱流动相为液体，其 扩散系数，粘度，密度等与气体均有很大的差别，都 将对色谱分析过程产生影响。,要提高液相色谱的分离效率，装柱的均匀性和减小固定相（目前常用5 m）的粒径是关键。另外，降低流动相的黏度也可加快传质，提高柱效，流速对板高的影响和气相色谱一样存在最佳流速。 HPLC的最小板高比GC的板高小一个数量级，说明其有大得

34、多的柱效。,HPLC中还存在柱前和柱后展宽，柱前展宽和进样有关，要想办法减小柱前样品的扩散。 柱后展宽和色谱柱和检测器连接管和检测器的死体积密切相关，要尽可能减小。,一、液液分配色谱法及化学键合相色谱 1分离原理 分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。,33 高效液相色谱的主要类型,和气液色谱的比较 相同点：固定液是涂渍在担体表面； 不同点：流动相种类对分配系数有较大的影响。,2、正相分配色谱和反相分配色谱 为了避免固定液的流失。要求流动相尽可能不与固定相互溶，而且两相的极性差别越显著越好。根据所用流动相和固定相的极性程度，将其分为正相

35、分配色谱和反相分配色谱； 正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性。它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是按极性顺序流出； 反相分配色谱：流动相的极性大于固定相的极性。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。,3、化学键合相色谱 为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法，代替了固定液的机械涂布，它的分离机理：一般认为分配和吸附两种作用兼有； 可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破，对液相色谱的迅速发展起着重大作用 。它是目前应用最广泛的一种固定相。而单纯地液液分配色谱已很少采用。,二、液-固吸附

36、色谱（liquid-solid adsorption chromatography） 固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂。 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。,三、离子对色谱（ion pair chromatography）,原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水 性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配； 阴离子分离常采

37、用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十 六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；,反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。,注意： 离子对色谱特别是反相离子对色谱解决了强极性有机酸、有机碱的难以分离的问题，特别适合一些生化试样如核酸、核苷、生物碱等的分离，另外借助离子对的生成还可引入紫外吸收或荧光基团，可提高灵敏度。,四、离子交换色谱（ion-exchange chromatography）,固 定 相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子

38、交换树脂； 流 动 相：盐类的缓冲溶液。通过改变流动相的pH、缓冲剂（平衡离子）的类型、离子强度以及加入有机溶剂、配位剂等都会改变交换剂的选择性，影响样品的分离。,流动相离子强度的变化对保留值的影响比pH更显著。组分的保留值受流动相中盐类的总浓度控制。增加外加阴离子或阳离子总数，会增强它们对R+或R-的竞争能力，使组分离子的保留值减小。通过加入不同性质的外加盐类，可以影响柱的选择性，因为不同外加离子对交换剂的固定基团的亲和力大小不同。,流动相的pH值会影响酸或碱的离解平衡，若组分以分子形式存在，则不被固定相保留。离子形式所占的分数越大，保留值也越大；反之，保留值越小。常用的缓冲剂有磷酸盐、柠檬

39、酸盐、甲酸盐、乙酸盐、氨水等。,五、离子色谱（ion chromatography）,固定相：离子交换树脂 流动相：电解质溶液 检测器：电导检测、电化学检测器、紫外检测器 分析对象：水溶液中的阴、阳离子、糖类、氨基酸等 离子色谱分为双柱型离子色谱法和单柱型离子色谱。双柱即在分离柱后连接一个抑制柱，如 洗脱液是浓度很大的NaOH，离子交换下来待测离子Br-进入洗脱液引起的电导变化很小，检测灵敏度很低。,在分离柱后连接一个高容量的阳离子交换柱： 这样就消除了洗脱液本底电导的影响，大大提高了所测阴离子的检测灵敏度。,单柱离子色谱即选用低电导的洗脱液，如苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液，分离洗脱各个阴离

40、子，直接进入检测器进行检测。,六、空间排阻色谱（steric exclusion chromatography）,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；因此，排阻色谱又称为凝胶渗透色谱。 原理：按分子大小分离。 小分子可以扩散到凝胶空隙，从空隙中通过，出峰最慢； 中等分子只能部分进入凝胶空隙，中速通过； 大分子被排斥在外，出峰最快； 溶剂分子最小，在最后出峰，即组分全部在死时间前出峰；在柱中停留的时间短，柱内展宽小，柱效较高。,分子量介于全排斥和全渗透之间的化合物，按相对分子量降低的次序被洗脱，通常将V1-V4称为分级范围,分析对象：可对相对分子质量在100-8105范围内的化合物按质量分离。

41、不能用来分离大小相似、相对分子量接近的分子（相对分子量在10%） 一些相对分子量变化连续的高聚物，虽不能用凝胶色谱进行分离，但可测定其相对分子质量分级的情况。,（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。表面积小，柱容量低。,将固定相涂在单体上最大的问题是固定液的流失。20世纪60年代后期发展了新型固定相化学键合固定相,3） 化学键合固定相,化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： SiC d. 硅氮键型

42、： SiN,化学键合固定相的特点,1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快； 2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； 4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； 5）有利于梯度洗脱；,存在着双重分离机制： (键合基团的覆盖率决定分离机理) 高覆盖率：分配为主； 低覆盖率：吸附为主；,一、流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以

43、改进分离或调整出峰时间。,35 液相色谱法流动相相,二、选择流动相时应注意的几个问题,1 纯度要高 溶剂的纯度极大地影响色谱系统的正常操作和色谱分离效果。溶剂中若存在杂质会污染柱子，存在固体颗粒会损害高压泵或输液通道，使压力升高，基线漂移。 2 粘度要低 高效液相色谱中为获得一定流速必须使用高压，若溶剂粘度较高，操作压力也更大。高的压力会使色谱柱性能降低，而且泵也容易损坏。 3 化学稳定性好 流动相不能与固定相或组分发生任何化学反应。 4 溶剂沸点要高于55 低沸点溶剂挥发度大，容易使流动相浓度或组成发生变化，也容易产生气泡。,5 溶剂要能完全浸润固定相 溶剂对所测定的组分要有合适的极性，最好

44、选择样品的溶剂作流动相，否则发生溶剂与流动相不相混溶的情况，使分离变坏。 6 溶剂要与检测器匹配 溶剂要适合于检测器，例如采用示差折光率检测器，必须选择折光率与样品有较大差别的溶剂作流动相；若采用紫外吸收检测器，所选择的溶剂在检测器的工作波长下不能有紫外吸收。,三、 流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配色谱分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，也可先低极性溶剂，再逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 反相色谱中通常以水为流动相主体，加入不同的有机溶剂作调节剂。 常用的有机溶剂：甲醇、乙腈、二氧六环和四氢呋喃等,36 高效液相

45、色谱仪,高效液相色谱仪的一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统,另有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。,一高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。,二进样系统,高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约530cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 进样装置： 注射器进样 高压定量进样阀,三、分离系统色谱柱,色谱柱包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜，内衬光滑的聚合材料。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。 一般色谱柱长530cm，内径为45mm，凝胶色谱柱内径312mm，制备柱内径较大，可达25mm 以上。 一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。,四检测系统,在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。 一