基因工程的基础知识与基本技能.ppt

1、第一章 基因工程的基础知识与基本技术,一、基因工程的基本知识 （一）基因的结构特点 结构基因 调节基因 启动子（promoter） 终止子（terminater） 增强子（enhancer）,1、原核生物基因的结构特点 大多为结构基因，很小一部分为调节基因； 具有转录单元，形成多顺反子mRNA,重叠基因,（1）操纵子（operator）结构 指原核生物DNA上，一系列在作用上密 切相关而排列在一起的结构基因和操纵基因的总 和，是原核生物的一个遗传单位。,（2）原核生物mRNA的特征 半衰期短 、 具多顺反子形式 存在SD序列：起始密码子AUG上游7-12个 核苷酸处有一保守序列，可与16srR

2、NA 3端反向互 补，此序列称为SD序列。 5-AGGAGGU-3 作用：核糖体-mRNA结合过程中起作用。,（3）原核生物基因的终止子特点 存在富含有GC碱基的二重对称区。 RNA易形成RNA-RNA发卡结构，破坏一 部分RNA-DNA杂交链。 存在一段由4-8个A组成的序列 3端为寡聚U，则杂合链的易出现不稳定的rUdA区域,终止子对转录的终止,2、真核生物基因的特点 （1）不连续性,Splitting gene：coding sequences are spaced by non-coding sequences in DNA molecule. Coding sequence arra

3、ys discontinuous.,外显子（exon） 内含子（intron）,（2）内含子 I型自我剪接内含子 II型自我剪接内含子 型内含子 真核rRNA 核mRNA、tRNA 核内前体mRNA 蛋白质内含子(intein)：是蛋白质中的一段多肽链, 它靠自我剪切的方式从前体蛋白中分离出来, 而两端的外显肽（extein）以肽键的方式相连。 翻译内含子（translational intron）：mRNA中存在与内含子对应的核苷酸序列，在翻译过程中这序列被“跳跃”过去，因此产生的多肽链不含有内含子对应的氨基酸序列。,（3）外显子 mRNA剪接方式不同，产生了mRNA多态性。 组成型剪接（c

4、onstitutive splicing）： 选择性剪接（alternative splicing）：,constitutive,（4）连接区（exon-intron junction sequence） 连接区序列高度保守，剪接过程重要的识别序列 GT-AG法则：多数内含子5端起始的两个碱基都是GT，而3端最后两个碱基总是AG，由于这两对碱基的高度 保守性和广泛性，则把它称为GT-AG 法则。,左剪接位点或供体位点,右剪接位点或受体位点,GT,（5）重复序列 卫星DNA：染色体DNA经氯化铯密度梯度离心,其高度重复序列因组成不同而在主带旁自成一条或数条条带。 小卫星DNA（VNTR，串联重复

5、序列可变数）：D短重复单位6-40bp，重复6-100次，常位于非编码区，分布广泛。 微卫星DNA（STR，简单串联重复）：重复单位长度通常为2-6个核苷酸单位，重复6-60次。 中度重复序列： Alu元件：属于非自主的逆转录转座子,人类基因组内的拷贝数可达140万个,占基因组的10%以上.,（二）从DNA到蛋白质 1、中心法则与反中心法则,RNA的编辑： mRNA序列发生了 不同于模板DNA的变 化，使翻译生成的蛋白 质的氨基酸组成，不同 于基因序列中的编码信息。,2、基因表达（gene expression） 转录（transcription）: 翻译（translation）: 基因表达

6、调 控（ gene regulation /gene control）:,DNA footprinting methodIdentifying the Nucleotide Sequence in DNA where a protein binds,Footprinting is a means of finding the target DNA sequence, or binding site, of a DNA-binding protein.,1）原核生物的基因表达 a.原核生物启动子：,TTGACA:RNA聚合酶识别信号,Pribnow区或TATA box DNA局部解链,b.乳糖操

7、纵子与调控系统,1961年Jacob、Monod首先提出了关于原核生物基因 结构及表达调控的操纵子学说。 乳糖操纵子结构： i：调节基因 p： 启动基因 o： 操纵基因 Z ：-半乳糖苷酶 Y： -半乳糖苷透过酶 A： -半乳糖苷乙酰基转移酶,lac体系受调控的证据 lac体系的“开-关”特性,乳糖操纵子和负调控模型,转录的调控是在启动区和操纵区进行。,Allosteric protein Inducer： lactose or allolactose?,What is the nature of the inducer?,How can lactose be metabolized to a

8、llolactose if no permease is present to get it into the cell and no galactosidase exists to perform the metabolizing because the lac operon is repressed?,关于负控诱导的几点说明,1、lac操纵子具有本底水平的表达 在非诱导的状态下有少量的lac mRNA合成，此合成称为 本底水平的组成型合成。 2、大肠杆菌对乳糖的反应 乳糖进入细胞，成为异构乳糖 结合阻遏物 启动 lac mRNA的生物合成 产生大量半乳糖苷酶和透过酶 乳糖大量进入细胞 降解

9、为葡萄糖和半乳糖 异构乳糖 结合阻遏物 促使mRNA高速合成 提高了透过酶和半乳糖苷酶浓度 乳糖耗尽，阻遏物不断合成，lac mRNA合成受抑制，半 乳糖苷酶和透过酶合成停止， 不断稀释.,代谢产物活化蛋白（CAP），又称为cAMP受体蛋白，能够与cAMP形成复合物；cAMP-CAP复合物可以结合到乳糖操纵子的启动基因上，可以促进转录的进行。 则：正调控因子为： cAMP-CAP复合物,乳糖操纵子中的正调控:,细菌对此复合物的需要是独立的，与阻遏体系无关。,CAP,关于正调控的几点说明,1、降解物的阻遏作用或葡萄糖效应 (glucose effect ) 。 葡萄糖分解代谢的降解物能抑制腺苷酸

10、环化 酶活性并活化磷酸二酯酶，从而降低cAMP浓 度，则不能形成cAMP-CAP复合物，使许多参 与分解代谢的酶基因不能转录，这种现象称为 降解物的阻遏作用。 2、cAMP-CAP复合物对降解物敏感型操纵子均具有调节作用(半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等).,（2）真核生物的基因表达,真核生物基因启动子分类： 类别（class ）：RNA聚合酶只进行rRNA前体基因的转录 类别（class ）：由RNA聚合酶进行转录，涉及诸多编码蛋白质的基因及部分SnRNA表达的控制。 类别（class ）：由RNA聚合酶所识别，涉及tRNA和 5srRNA的转录。,类别II基因启动子的结构（共有）： 核心元件：包

11、括转录起始位点（initiator，INR）和 TATA区。 转录起始子：转录起始（+1）邻近的序列 TATA区：-25 -35区，保守序列：TATAAA 作用：使DNA双链解开，并决定转录的起点位置,Hogness box,上游调控区（TATA区上游的保守序列称 上游启动子元件 UPE或上游激活序列UAS ） CAAT区：-70 -80区，保守序列：CCAAT 作用：为RNA聚合酶识别结合区，转录起始 频率的影响最大。 GC区：-80 -100区，保守序列：GGGCGGG 作用：与某些转录因子结合，控制转录频率。,远端调控区： 增强子：能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。 具有不同于启动子的特性： 具有远距离效应：over 2kb 无方向性：inverted without significant effect 顺式调节：cis-acting sequence 无基因的特异性、具有组织特异性 有相位性：其作用与DNA的构象有关系 有的增强子可以对外部信号产生反应,真核类别II基因调控区的结构,关于真核基因启动子的